薄荷腦通過miR-1247-3p/PI3K/Akt 通路影響LPS 誘導的Ⅱ型肺泡上皮 細胞凋亡和炎癥反應的分子機制研究①

朱丹娜 孟 泳 （河南中醫(yī)藥大學肺病科，鄭州 450046）

肺泡Ⅱ型上皮細胞（alveolar type Ⅱ epithelial cells，AT-Ⅱ）是肺泡壁的重要組成部分，具有維持肺表面活性物質(zhì)動態(tài)平衡和肺免疫功能，其過度凋亡可導致肺泡上皮屏障破壞，肺上皮細胞異常損傷與急性肺損傷、肺結(jié)核、慢性阻塞性肺疾病等肺部疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［1-2］。因此，研究肺泡上皮細胞損傷的分子機制對肺部相關(guān)疾病的治療具有重要意義。脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）是革蘭氏陰性桿菌細胞壁的重要成分，可誘導肺泡上皮細胞損傷［3］。研究表明中藥在防治肺部疾病上具有重要作用［4］。薄荷腦是從薄荷的葉和莖中提取的一種飽和環(huán)狀醇，又名薄荷醇、薄荷冰；研究報道霧化吸入薄荷醇可減輕哮喘小鼠氣道炎癥，降低氣道高反應性［5］。薄荷醇通過MAPK、NF-κB 和AKT 信號通路抑制神經(jīng)炎癥反應，可保護多巴胺能神經(jīng)元免受LPS 誘發(fā)的帕金森病模型中炎癥介導的損傷［6］。然而薄荷腦對LPS 誘導的AT-Ⅱ細胞凋亡和炎癥反應的影響及機制尚不清楚。研究報道LPS 處理的A549 細胞中miR-1247-3p 相對表達量升高［7］。抑制miR-1247-3p 表達通過靶向SFTPC 基因抑制LPS 誘導的肺泡上皮細胞損傷［8］。磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）信號通路與肺損傷發(fā)生有關(guān)，如氫可通過激活PI3K/Akt/Foxo3a 信號通路防止高氧誘導的AT-Ⅱ細胞凋亡［9］。右美托咪定通過激活PI3K/Akt 通路可改善LPS 誘導的大鼠急性肺損傷［10］。川芎嗪可通過抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路活化減輕內(nèi)毒素誘導的急性肺損傷大鼠炎癥反應［11］。而 薄 荷 腦 是 否 通 過 調(diào) 控miR-1247-3p 及PI3K/Akt通路影響LPS 誘導的肺泡上皮細胞損傷尚未可知。因此，本實驗旨在研究薄荷腦對LPS 誘導的AT-Ⅱ細胞凋亡和炎癥反應的影響及機制是否與miR-1247-3p及PI3K/Akt通路有關(guān)。

1 材料與方法

1.1 材料 AT-Ⅱ細胞購自上海雅吉生物科技有限公司；DMEM 培養(yǎng)基購自美國Hyclone 公司；LPS購自北京伊塔生物科技有限公司；薄荷腦購自滁州仕諾達生物科技有限公司；CCK-8 試劑盒購自北京利維平生物科技有限公司；凋亡檢測試劑盒購自上海信帆生物科技有限公司；蛋白提取試劑盒購自南京恩晶生物科技有限公司；ELISA 試劑盒購自深圳子科生物科技有限公司；熒光定量試劑盒購自上?？泼羯锟萍加邢薰?。

1.2 方法

1.2.1 LPS 誘導AT-Ⅱ細胞損傷模型的建立 將AT-Ⅱ細胞分別用5、10、15 mg/L的LPS處理，以未經(jīng)LPS 處理的細胞作為對照（NC）組，發(fā)現(xiàn)不同濃度LPS均可減弱AT-Ⅱ細胞活性，后續(xù)實驗選用濃度為15 mg/L。

1.2.2 細胞分組 分別采用1、5、10 μmol/L的薄荷腦和15 mg/L LPS 處理AT-Ⅱ細胞，分別設為1、5、 10 μmol/L 薄荷腦+15 mg/L LPS 組；將anti-miR-NC、anti-miR-1247-3p 轉(zhuǎn)染至AT-Ⅱ細胞后用15 mg/L LPS 處理，設為anti-miR-NC+15 mg/L LPS 組、antimiR-1247-3p+15 mg/L LPS 組；將miR-NC、miR-1247-3p 轉(zhuǎn)染至AT-Ⅱ細胞后用0 μmol/L 的薄荷腦和 15 mg/L 的LPS 處理，設為miR-NC+10 μmol/L 薄荷腦+15 mg/L LPS 組、miR-1247-3p+10 μmol/L 薄荷腦+ 15 mg/L LPS組。

1.2.3 CCK-8 法檢測細胞活性 將AT-Ⅱ細胞以2×103個/孔接種于96 孔板培養(yǎng)12 h，分別加入0、5、10、15 mg/L的LPS，培養(yǎng)24 h后每孔加入10 μl CCK-8試劑孵育2 h，酶標儀檢測450 nm 波長處的吸光度值（A）。

1.2.4 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡 NC 組、15 mg/L LPS 組、1、5、10 μmol/L 薄荷腦+15 mg/L LPS 組、antimiR-NC+15 mg/L LPS 組、anti-miR-1247-3p+15 mg/L LPS 組、miR-NC+10 μmol/L 薄荷腦+15 mg/L LPS 組、miR-1247-3p+10 μmol/L 薄荷 腦+15 mg/L LPS 組 細胞培養(yǎng)48 h，收集細胞，用預冷的PBS 漂洗2 次，加入300 μl 結(jié)合緩沖，然后加入Annexin V-FITC 和PI孵育10 min，流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.2.5 ELISA 檢測TNF-α、IL-6、IL-1β 水平 取各組細胞培養(yǎng)48 h 后上清液，ELISA 法檢測TNF-α、 IL-6、IL-1β 水平，具體操作按照試劑盒說明進行，先測量標準品吸光度值并繪制標準曲線，然后測量樣品吸光度值，根據(jù)所得吸光度值在標準曲線上讀取樣品濃度。

1.2.6 Western blot 檢測蛋白表達 提取各組細胞總蛋白，進行聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，然后將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF 膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入一抗（1∶800） 4 ℃孵育過夜，洗膜后加入二抗 （1∶2 000）室溫孵育2 h，曝光顯影后用Quantity One分析蛋白條帶灰度值，以β-actin 為內(nèi)參計算蛋白相對表達水平。

1.2.7 RT-qPCR 檢測miR-1247-3p 表達水平 提取細胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA 后以U6為內(nèi)參進行PCR 擴增，擴增條件：95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共40 個循環(huán)；60 ℃延長5 min。相對表達量采用2-ΔΔCt法計算。miR-1247-3p 正 向序列：5'-CCCCGGGAACGTCGAGACTGGAGC-3'，反向序列：5'-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3'；U6 正向序列：5'-TGGAACGCTTCACGAATTTGCG-3'，反向序列：5'-GGAACGATACAGAGAAGATTAGC-3'。

1.3 統(tǒng)計學分析 采用SPSS20.0軟件進行統(tǒng)計學分析，符合正態(tài)分布的計量資料以±s表示，兩組比較行t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度LPS 對AT-Ⅱ細胞活性的影響 與NC組相比，不同濃度LPS處理后AT-Ⅱ細胞活性降低（P＜0.05，圖1）。后續(xù)研究濃度選用15 mg/L的LPS。

圖1 不同濃度LPS對AT-Ⅱ細胞活性的影響Fig.1 Effect of different concentrations of LPS on AT-Ⅱ cell activity

2.2 不同濃度薄荷腦對LPS 誘導的AT-Ⅱ細胞凋亡和炎癥反應的影響 與NC 組相比，LPS 組Cleaved-caspase-3 表達水平及細胞凋亡率升高，TNF-α、IL-6、IL-1β 水平升高（P＜0.05）；與LPS 組相比，不同濃度薄荷腦組Cleaved-caspase-3 表達水平及細胞凋亡率降低，TNF-α、IL-6、IL-1β 水平降低 （P＜0.05，圖2）。

圖2 不同濃度薄荷腦對LPS誘導的AT-Ⅱ細胞凋亡和炎癥反應的影響Fig.2 Effect of different concentrations of menthol on apoptosis and inflammation of AT-Ⅱ cells induced by LPS

2.3 不同濃度薄荷腦對LPS 誘導的AT-Ⅱ細胞中miR-1247-3p表達水平的影響 與NC組相比，15 mg/L LPS 組miR-1247-3p 表達水平升高（P＜0.05）；與 15 mg/L LPS組相比，不同濃度薄荷腦組miR-1247-3p表達水平降低（P＜0.05，圖3）。

圖3 不同濃度薄荷腦對LPS 誘導的AT-Ⅱ細胞中miR-1247-3p表達的影響Fig.3 Effects of different concentrations of menthol on expression of miR-1247-3p in AT-Ⅱ cells induced by LPS

2.4 miR-1247-3p 低表達對LPS 誘導的AT-Ⅱ細胞凋亡和炎癥反應的影響 與anti-miR-NC+15 mg/L LPS 組相比，anti-miR-1247-3p+15 mg/L LPS 組miR-1247-3p 表達水平降低，Cleaved-caspase-3 表達水平及細胞凋亡率降低，TNF-α、IL-6、IL-1β 水平降低 （P＜0.05，圖4）。

圖4 miR-1247-3p 低表達對LPS 誘導的AT-Ⅱ細胞凋亡 和炎癥反應的影響Fig.4 Effect of low expression of miR-1247-3p on LPS-induced apoptosis and inflammation of AT-Ⅱ cells

2.5 miR-1247-3p 可逆轉(zhuǎn)薄荷腦對LPS 誘導的 AT-Ⅱ細胞凋亡和炎癥反應的影響 與miR-NC+ 10 μmol/L 薄荷腦+15 mg/L LPS 組相比，miR-1247-3p+10 μmol/L 薄荷腦+15 mg/L LPS 組miR-1247-3p表達水平升高，Cleaved-caspase-3 表達水平及細胞凋亡率升高，TNF-α、IL-6、IL-1β 水平升高（P＜0.05，圖5）。

圖5 miR-1247-3p 可逆轉(zhuǎn)薄荷腦對LPS 誘導的AT-Ⅱ細胞凋亡和炎癥反應的影響Fig.5 miR-1247-3p can reverse effect of menthol on LPSinduced apoptosis and inflammation of AT-Ⅱ cells

2.6 PI3K/Akt信號通路蛋白表達情況 與NC組相比，15 mg/L LPS 組p-PI3K、p-Akt 蛋白表達水平降低（P＜0.05），PI3K 和Akt 蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義；與15 mg/L LPS 組 相 比，10 μmol/L menthol+ 15 mg/L LPS 組p-PI3K、p-Akt蛋白表達水平升高（P＜0.05），PI3K 和Akt 蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義；與miR-NC+10 μmol/L menthol+15 mg/L LPS 組 相 比，miR-1247-3p+10 μmol/L menthol+15 mg/L LPS 組 p-PI3K、p-Akt 蛋白表達水平降低（P＜0.05），PI3K 和Akt蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義（圖6）。

圖6 Western blot檢測p-PI3K、p-Akt、PI3K、Akt蛋白表達Fig.6 Western blot detection of p-PI3K， p-Akt， PI3K， Akt protein expressions

3 討論

研究表明中藥有效成分可減輕肺泡上皮細胞損傷，防治急性肺損傷效果顯著，篩選療效顯著的中藥以指導臨床治療相關(guān)肺部疾病具有重要意義［12-13］。肺損傷與炎癥細胞浸潤有關(guān)，AT-Ⅱ在創(chuàng)傷或應激條件下經(jīng)巨噬細胞刺激可產(chǎn)生促炎細胞因子IL-6、IL-1β 及TNF-α 等［14］。因此，抑制AT-Ⅱ細胞凋亡和炎癥因子的產(chǎn)生可防治肺損傷。研究報道法舒地爾和薄荷腦聯(lián)合治療可顯著抑制炎癥反應和細胞凋亡，改善模型大鼠脊髓損傷［15］。薄荷腦通過激活TRPM8 來預防心肌梗死后的炎癥和心臟重塑［16］。薄荷醇還可降低乙酸誘導的大鼠結(jié)腸黏膜結(jié)腸炎中促炎細胞因子（IL-1、IL-23 和TNF-α）分泌［17］。本實驗用不同濃度LPS 處理后AT-Ⅱ細胞活性降低，Cleaved-caspase-3 蛋白表達水平及細胞凋亡率升高，TNF-α、IL-6、IL-1β 水平升高，表明LPS 誘導了AT-Ⅱ細胞凋亡和炎癥反應。因此采用LPS 誘導AT-Ⅱ細胞建立損傷模型。不同濃度薄荷腦處理后，Cleaved-caspase-3 表達水平及細胞凋亡率降低，TNF-α、IL-6、IL-1β 水平降低，表明薄荷腦可抑制LPS誘導的AT-Ⅱ細胞凋亡和炎癥反應，抑制LPS誘導的AT-Ⅱ細胞損傷。

研究報道m(xù)iR-1247-3p過表達可減輕缺氧/復氧誘導的H9c2 細胞損傷［18］。本實驗結(jié)果顯示，miR-1247-3p 低表達后，Cleaved-caspase-3 表達水平及細胞凋亡率降低，TNF-α、IL-6、IL-1β 水平降低，說明miR-1247-3p 低表達可抑制LPS 誘導的AT-Ⅱ細胞凋亡和炎癥反應，與文獻［8］研究結(jié)果相符。研究報道1，6-O，O-二乙酰大花旋覆花內(nèi)酯通過調(diào)節(jié)miR-1247-3p/LXRα/ABCA1 信號傳導抑制口腔鱗狀細胞癌進展，說明藥物可調(diào)控miR-1247-3p 表達［19］。本實驗結(jié)果顯示，薄荷腦可降低LPS 誘導的AT-Ⅱ細胞中miR-1247-3p 表達水平；而miR-1247-3p 高表達逆轉(zhuǎn)了薄荷腦對LPS 誘導的AT-Ⅱ細胞凋亡、炎癥反應，表明薄荷腦可調(diào)控miR-1247-3p表達。

研究報道FGF-2通過激活PI3K/Akt信號通路減輕肺泡上皮細胞的炎癥、氧化應激和細胞凋亡［20］。桑黃素可通過抑制PI3K/Akt/NF-κB 信號通路減輕LPS 誘導的大鼠急性肺損傷［21］。本實驗結(jié)果顯示，薄荷腦處理后的AT-Ⅱ細胞中p-PI3K、p-Akt 蛋白表達水平升高，說明薄荷腦可激活PI3K/Akt 信號通路。此外，miR-1247-3p 高表達逆轉(zhuǎn)了薄荷腦對 p-PI3K、p-Akt蛋白表達的影響。

綜上所述，薄荷腦通過miR-1247-3p/PI3K/Akt通路抑制LPS誘導的AT-Ⅱ細胞凋亡和炎癥反應。