地黃—大蒜輪作對(duì)大蒜生長及地黃化感自毒作用的影響

鈕顏宇，郭志祥，徐淑慧，孫香榮，洪利亞，王豐青，張重義，李 娟

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，河南鄭州 450000；2.福建農(nóng)林大學(xué)作物科學(xué)學(xué)院，福建福州 350002)

在根類中藥材生產(chǎn)栽培過程中，連作障礙是影響藥材產(chǎn)量和品質(zhì)的一個(gè)非常嚴(yán)重的問題。地黃(Rehmanniaglutinosa)是應(yīng)用廣泛的大宗中藥材之一，其種植過程中連作障礙問題尤為突出，研究發(fā)現(xiàn)連作使地黃葉綠素含量降低，光合能力下降，塊根不膨大[1]。連作地黃根區(qū)有益菌種數(shù)量降低，真菌和放線菌數(shù)量增加[2-3]。目前對(duì)地黃連作障礙的研究多集中在分子形成機(jī)制方面[4-7]，可應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)的消減措施的研究較少，參考其他根類藥用植物消減連作障礙的研究發(fā)現(xiàn)，通過運(yùn)用合理輪作模式可以有效緩解連作障礙，但研究主要側(cè)重于輪作對(duì)連作障礙作物的影響上，而對(duì)選取輪作作物本身的產(chǎn)量和品質(zhì)鮮少研究。一種合理的輪作模式要在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)系統(tǒng)中推廣，輪作作物的經(jīng)濟(jì)效益也是必須考慮的因素之一。

大蒜(Alliumsativum)具有廣譜殺菌作用，大田生產(chǎn)中常被用來作為前茬作物，研究人員通過鑒定發(fā)現(xiàn)大蒜根系分泌物為鄰苯二甲酸二丁酯、2，6-二異丙基苯酚等酚類物質(zhì)以及二烯丙基二硫化物[8]，其中二烯丙基二硫化物為大蒜揮發(fā)油中的典型物質(zhì)。研究表明酚類物質(zhì)能夠有效防止病蟲害發(fā)生，大蒜根系分泌物主要成分對(duì)細(xì)菌引起的根腐病、枯萎病有顯著抑制作用[9-12]。在膜側(cè)栽培模式下，大蒜與當(dāng)歸間作，能有效改變土壤微生物數(shù)量，提高土壤酶活性，改善土壤理化性質(zhì)，緩解當(dāng)歸連作障礙[13]。前期研究結(jié)果也表明，地黃與大蒜間作可以減少連作地黃的死亡率，大蒜或可作為消減地黃連作障礙的倒茬作物[14]。

為了探究地黃—大蒜輪作模式的可行性，本研究對(duì)地黃—大蒜輪作模式下，大蒜的生長指標(biāo)、產(chǎn)量品質(zhì)以及土壤指標(biāo)變化進(jìn)行了分析，并通過根區(qū)土壤化感效應(yīng)測定及地黃苗盆栽試驗(yàn)研究輪作大蒜后對(duì)地黃化感自毒作用的影響，以期對(duì)后期的田間試驗(yàn)進(jìn)行結(jié)果預(yù)估，為建立通過合理輪作模式緩解地黃連作障礙提供理論依據(jù)和技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試大蒜品種及樣品采集 試驗(yàn)地位于國家“2011計(jì)劃”河南農(nóng)業(yè)大學(xué)原陽基地，大蒜品種選用紫皮大蒜，田間試驗(yàn)以地黃—大蒜(2020年種植過地黃品種溫85-5的茬地)作為處理組，以玉米—大蒜(前茬為玉米，8年內(nèi)未種植過地黃的土壤)作為對(duì)照組，試驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)，分別測定土壤基礎(chǔ)氮磷鉀含量，并通過施肥補(bǔ)齊。于2020年10月20日播下蒜種，一壟雙行，壟寬0.4 m。行距 20 cm，株距10 cm。進(jìn)行常規(guī)田間管理。分別在大蒜幼苗期、生長期、成熟期、收獲期4個(gè)時(shí)期進(jìn)行取樣，每個(gè)重復(fù)按照3點(diǎn)取樣法，各取30株。試驗(yàn)在2020年10月至2021年5月進(jìn)行。

1.1.2 土壤樣品采集 地黃收獲期，采集根區(qū)5～20 cm范圍內(nèi)的土壤，用無菌自封袋裝好后帶回實(shí)驗(yàn)室，碾碎分別過20目、50目篩，除去草根等雜質(zhì)后陰涼風(fēng)干，備用。按照以上方法在取樣期分別取對(duì)照組與處理組大蒜的根區(qū)土壤。另取地黃根區(qū)土壤(2020年種植地黃的土壤)、地黃大蒜輪作根區(qū)土壤以及空白對(duì)照土壤(取8年及以上未種植過地黃的土壤)進(jìn)行盆栽試驗(yàn)，碾碎過20目篩除去石子、雜草等雜質(zhì)，陰涼風(fēng)干后儲(chǔ)藏備用。

1.2 測定項(xiàng)目及方法

1.2.1 生長指標(biāo) 用卷尺測量株高、葉長、葉寬，用游標(biāo)卡尺測量莖粗。收獲期，全小區(qū)收獲紫皮大蒜，風(fēng)干表皮后稱質(zhì)量，折算單產(chǎn)。

1.2.2 生理指標(biāo) 將收獲期紫皮大蒜用硫酸蒽酮法測可溶性糖含量，考馬斯亮藍(lán)染色法測可溶性蛋白含量。

1.2.3 質(zhì)量指標(biāo) 按照《中華人民共和國藥典》(2020年版)要求測可溶性浸出物含量，高效液相色譜法(HPLC)測大蒜素含量。色譜條件：色譜柱為AglientZORBAXSB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；檢測波長214 nm；進(jìn)樣量20 μL；流速1.0 mL/min；以甲醇與0.2%甲酸水作為流動(dòng)相進(jìn)行等度洗脫，柱溫30 ℃。

1.2.4 土壤指標(biāo) (1)土壤酶活性。脲酶活性測定采用苯酚鈉-次氯酸鈉比色法，蔗糖酶活性測定采用3，5-二硝基水楊酸比色法。(2)土壤酚酸。參考李培棟等的方法[15]提取土壤酚酸，稱25 g鮮土于離心管中，加入25 mL 1 mol/L NaOH放置過夜，次日振蕩30 min，離心后過濾離心液用12 mol/L的鹽酸酸化至pH值為2.5，2 h后離心除去胡敏酸，而后將上清液過 0.22 μm 的纖維素薄膜，濾液用HPLC測定(重復(fù)3次)。結(jié)果按照烘干土質(zhì)量換算。色譜條件：色譜柱為SunFire C18(4.6 mm×150 mm，5 μm)；檢測波長260 nm；流速1 mL/min；進(jìn)樣量20 μL；柱溫28 ℃；甲醇(A)-0.2%冰乙酸水(B)系統(tǒng)，梯度洗脫(0～16 min，15%～20%甲醇；16～32 min，20%～32%甲醇)。

1.2.5 根區(qū)土壤中化感物質(zhì)的提取 取上述重茬土、地黃—大蒜輪作土和對(duì)照土各2 000 g，按照土水比為1 g∶2 mL的比例浸泡于燒杯中，攪拌均勻后浸泡過夜，超聲2 h，取上清液過濾，以4 000 r/min離心20 min，40 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮濾液至40 mL，即得根區(qū)土壤水提液母液，置于冰箱備用。

1.2.6 根區(qū)土壤化感效應(yīng)測試 以紗布-濾紙-培養(yǎng)皿法進(jìn)行種子生物測試，取“1.2.5”節(jié)中制備的根區(qū)土壤水提液母液進(jìn)行稀釋，均分別設(shè)置50.00、25.00、12.50、6.25、0 g/mL(空白組用蒸餾水代替提取液)5個(gè)濃度，每個(gè)濃度重復(fù)3次，每次重復(fù)供試60粒地黃種子，試驗(yàn)前用1%次氯酸鈉水溶液處理地黃種子。分別向培養(yǎng)皿內(nèi)添加5 mL不同濃度的水提液，置于溫度為28 ℃，光照度為 12 000 lx 左右的人工氣候培養(yǎng)箱內(nèi)，每天光照 12 h，相對(duì)濕度恒定。每天觀察種子發(fā)芽情況，種子生長周期為10 d，自發(fā)芽后每天定時(shí)統(tǒng)計(jì)發(fā)芽數(shù)，10 d 時(shí)測量種子莖長與根長。

1.2.7 地黃苗生長及根系形態(tài)的測定 取上述地黃根區(qū)土壤、地黃輪作大蒜后根區(qū)土壤以及空白對(duì)照土壤按照每盆500 g分裝至10 cm×10 cm的方盆，每組處理均重復(fù)4次，每個(gè)重復(fù)5盆，每盆定植4株地黃種子苗(2葉期)，于定植30、60、90 d時(shí)統(tǒng)計(jì)死亡數(shù)，在90 d時(shí)破壞性取樣，用根系掃描儀測定各處理地黃苗根系形態(tài)。

1.2.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 利用Excel 2016軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，采用SPSS Statistics 21.0數(shù)據(jù)處理軟件對(duì)各指標(biāo)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 地黃茬口對(duì)大蒜生長的影響

2.1.1 地黃茬口對(duì)大蒜農(nóng)藝性狀的影響 由圖1可知，處理組大蒜4個(gè)時(shí)期的長勢均優(yōu)于對(duì)照組大蒜。收獲期時(shí)，處理組大蒜的株高、莖粗、葉長，分別比對(duì)照組大蒜提高27.14%、18.03%、50.46%，差異均達(dá)到極顯著水平。

2.1.2 地黃茬口對(duì)大蒜發(fā)育狀態(tài)的影響 由表2可知，處理組大蒜的蒜頭橫徑、縱徑分別高出對(duì)照組大蒜6.60%、9.23%，差異顯著，處理組大蒜的蒜頭鮮質(zhì)量高出對(duì)照組大蒜10.45%，處理組間無顯著差異。

表2 地黃茬口對(duì)大蒜的發(fā)育狀態(tài)及產(chǎn)量的影響

2.1.3 輪作處理對(duì)大蒜品質(zhì)及生理指標(biāo)的影響 由表3可知，2組大蒜素的含量均滿足且高出《中華人民共和國藥典》(2020年版)要求，其中對(duì)照組大蒜素含量為0.25%，處理組大蒜素含量為0.29%，高出對(duì)照組16.00%，差異不顯著。

表3 地黃茬口對(duì)大蒜品質(zhì)及生理指標(biāo)的影響

2.2 輪作處理對(duì)根區(qū)土壤的影響

2.2.1 輪作處理對(duì)土壤酶活性的影響 由圖2可知，處理組與對(duì)照組土壤蔗糖酶活性在整個(gè)生育期呈現(xiàn)先升高后降低再升高的趨勢，與種植前相比分別提升33.90%、7.27%，差異極顯著。處理組與對(duì)照組土壤脲酶活性在生育期內(nèi)均呈先升高后降低趨勢，處理組土壤脲酶活性在幼苗期達(dá)到最大值 2.59 mg/(g·h)，高出種植前108.04%，生長期、成熟期與收獲期土壤脲酶活性相對(duì)減弱，但與種植前相比仍顯著提升。

2.2.2 輪作處理對(duì)土壤酚酸含量的影響 土壤酚酸色譜分析結(jié)果見圖3，定量分析結(jié)果見表4。由表4可知，與種植前相比，處理組對(duì)羥基苯甲酸、香草酸與丁香酸含量均顯著升高；阿魏酸含量極顯著提升，處理組在幼苗期提升475.00%，達(dá)到種植前5.75倍水平。香豆酸含量均極顯著降低，含量降低水平最高達(dá)到39.20%；對(duì)照組對(duì)羥基苯甲酸含量在幼苗期達(dá)到最高水平 0.14 μg/g，之后逐漸降低，在成熟期、收獲期未檢測到對(duì)羥基苯甲酸。與種植前相比，對(duì)照組土壤新增了香草酸與丁香酸2種酚酸物質(zhì)；種植大蒜后在對(duì)照組與處理組中均未檢測到咖啡酸。

表4 根區(qū)土壤酚酸含量的變化 μg/g

2.3 輪作前后土壤水提液化感效應(yīng)研究

2.3.1 根區(qū)土壤水提液對(duì)地黃種子萌發(fā)的影響 由圖4可知，添加12.50、25.00、50.00 g/mL濃度時(shí)，輪作組地黃種子發(fā)芽勢高于組內(nèi)空白對(duì)照以及對(duì)照組和處理組。添加濃度為12.50、50.00 g/mL時(shí)，發(fā)芽率較空白對(duì)照分別提升8.73%、9.53%，差異不顯著。添加12.50、25.00、50.00 g/mL濃度時(shí)，輪作組地黃種子發(fā)芽率均高于另外2組處理，添加濃度為50.00 g/mL時(shí)差異極顯著，差異最大值達(dá)68.28%。除組內(nèi)空白對(duì)照，對(duì)照組發(fā)芽勢和發(fā)芽率隨添加濃度增加而逐漸降低；除添加6.25 g/mL濃度外，處理組另3個(gè)濃度發(fā)芽勢較組內(nèi)空白對(duì)照降低，處理組組內(nèi)空白對(duì)照發(fā)芽率顯著高于添加12.50、25.00、50.00 g/mL濃度時(shí)的發(fā)芽率。

2.3.2 根區(qū)土壤水提液對(duì)地黃種子生長的影響 由圖5可知，不同濃度下，3組處理莖長均整體呈現(xiàn)隨提取液濃度提升而增加的趨勢；同一濃度下，輪作組地黃莖長小于其他2組。3組處理地黃根長均隨添加濃度的提升呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢；添加6.25、12.50、50.00 g/mL濃度時(shí)，輪作組根長小于其他2組，且在添加濃度為6.25 g/mL時(shí)根長與其他2組差異極顯著，與對(duì)照組根長差值最大，可達(dá)1.50 cm?；袦y試結(jié)果表明，輪作后土壤對(duì)地黃種子的根長、莖長均有抑制作用。

2.4 輪作處理對(duì)地黃苗期生長的影響

2.4.1 輪作處理對(duì)地黃苗死亡率的影響 由圖6可知，隨時(shí)間增長，地黃苗死亡率為輪作組>重茬組>對(duì)照組。生長60 d時(shí)，輪作處理后土壤對(duì)地黃苗的影響急劇增強(qiáng)，90 d時(shí)死亡率為47.5%，比同期地黃根區(qū)土死亡率高出90.00%。

2.4.2 輪作處理對(duì)地黃苗地下部分鮮質(zhì)量的影響 由圖7可知，地黃苗地下部分鮮質(zhì)量為對(duì)照組>輪作組>重茬組，處理間具有顯著性差異；地黃苗期產(chǎn)量為對(duì)照組>輪作組>重茬組，對(duì)照組產(chǎn)量極顯著高于重茬組與輪作組。

2.4.3 根區(qū)土壤對(duì)地黃苗根系形態(tài)的影響 由表5、圖8可知，從投影面積、根表面積和總根體積3個(gè)方面分析，均為對(duì)照組>輪作組>重茬組，處理組之間有極顯著差異，輪作大蒜處理后根區(qū)土壤對(duì)地黃苗期地下部分生長的抑制作用減弱；各處理根系平均直徑之間均無顯著性差異；從根尖數(shù)量分析，輪作組的根尖數(shù)量較大，與對(duì)照組相比具有極顯著差異，重茬組的根尖數(shù)量大于對(duì)照組，二者之間無顯著性差異。

表5 地黃苗期根系掃描分析結(jié)果

3 討論與結(jié)論

合理輪作能夠減輕連作障礙，改善土壤環(huán)境，豐富土壤微生物群落，增強(qiáng)土壤相關(guān)酶活性，可減輕連作障礙植物復(fù)種時(shí)的自毒作用[16]。大量資料表明，現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)提倡采用輪作模式代替單季作物，提高作物產(chǎn)量，穩(wěn)定土壤肥力，提升土地利用率，減少病蟲害[17-19]。研究地黃茬口對(duì)大蒜生長發(fā)育以及產(chǎn)量品質(zhì)的影響，結(jié)果表明，處理組大蒜地上部分生長與發(fā)育狀態(tài)較好，產(chǎn)量品質(zhì)均有一定程度提升，大蒜素含量略高于對(duì)照組，其抗菌消炎抗腫瘤的效果更好，臨床療效、經(jīng)濟(jì)效益更高。

土壤酶是土壤中動(dòng)植物和微生物活動(dòng)的產(chǎn)物，是數(shù)量極微、作用極大的土壤組成部分，土壤酶的活性可以反映土壤生態(tài)狀況下生物化學(xué)過程的相對(duì)強(qiáng)度，測定相應(yīng)酶的活性，可以間接了解該物質(zhì)在土壤中的轉(zhuǎn)化情況，作為判斷土壤生物化學(xué)過程的強(qiáng)度及評(píng)價(jià)土壤肥力的指標(biāo)之一[20]。脲酶是土壤酶中唯一對(duì)尿素的轉(zhuǎn)化有重要影響的酶，尿素只有經(jīng)過脲酶水解才能被作物吸收[21]。蔗糖酶參與土壤中碳水化合物的轉(zhuǎn)化，使蔗糖水解為葡萄糖和果糖被植物及微生物利用。蔗糖酶的活性強(qiáng)弱能夠反映土壤熟化程度和肥力水平[22]。本研究結(jié)果表明，與種植前相比，處理組與對(duì)照組土壤蔗糖酶活性均有一定程度提升，間接活化土壤養(yǎng)分，改善土壤肥力，與前人研究結(jié)果[23]相類似。在整個(gè)種植過程中，脲酶活性呈下降趨勢，對(duì)照組土壤脲酶活性減弱至種植前的53.52%，而輪作處理組土壤脲酶活性雖然較種植前提升了21.76%，但相比幼苗期的脲酶數(shù)據(jù)，仍然是降低的，推測種植初期，大蒜植入對(duì)地黃茬地土壤的脲酶活性起促進(jìn)作用，但在大蒜生長過程中，土壤中的脲酶活性逐漸降低。輪作處理后土壤酶活性顯著升高，預(yù)計(jì)為后茬地黃帶來較高的土壤肥力，使地黃在連作環(huán)境下，保持相對(duì)較高水平的肥料利用率。

近年來，土壤酚酸類物質(zhì)作為連作障礙產(chǎn)生的主要因素被廣泛研究，前期研究表明，外源添加酚酸類物質(zhì)引起的地黃化感效應(yīng)有所差異，添加單體酚酸丁香酸與混合添加香豆酸、丁香酸對(duì)地黃生長影響較大，對(duì)地黃苗成活率，地黃根系膨大以及根系活力均有顯著抑制作用[24]。本研究結(jié)果表明，輪作大蒜處理后，處理組對(duì)羥基苯甲酸、香草酸、丁香酸、阿魏酸含量均顯著提升，香豆酸含量降低38.69%，咖啡酸損失。對(duì)照組香豆酸含量降低25.91%，咖啡酸、對(duì)羥基苯甲酸2種酚酸物質(zhì)損失，新增香草酸、丁香酸2種酚酸物質(zhì)，阿魏酸含量提升258.62%。地黃茬口輪作大蒜后，根區(qū)土壤酚酸含量以及種類均發(fā)生變化，但總體含量呈上升趨勢。綜合根區(qū)土壤盆栽試驗(yàn)結(jié)果，輪作后能夠提高地黃種子發(fā)芽率，但對(duì)幼苗生長具有抑制作用，或受輪作后酚酸尤其是丁香酸含量提升的影響。

本試驗(yàn)通過田間試驗(yàn)證明地黃—大蒜輪作提高了大蒜的產(chǎn)量與品質(zhì)，改善了土壤環(huán)境，土壤酶活性提高，土壤酚酸含量總體上升；通過土壤盆栽試驗(yàn)表明輪作后土壤對(duì)地黃苗期地下部分的抑制作用減弱，但地黃苗死亡率較高，同期進(jìn)行的地黃—大蒜輪作后復(fù)種地黃的大田試驗(yàn)，也同樣存在地黃出苗率不高的問題。由于受到2021年強(qiáng)降水影響，田間試驗(yàn)被迫停止。大蒜輪作后對(duì)地黃化感自毒的具體影響還有待驗(yàn)證，其能否作為輪作作物有待商榷。