響應面優(yōu)化伏毛鐵棒錘總生物堿微波輔助提取工藝

多杰措 ，李彩霞 ，許顯莉 ，宋文珠 ，馬世震 *

（1.中國科學院 西北高原生物研究所，青海 西寧 810008；2.青海省青藏高原特色生物資源研究重點實驗室，青海 西寧 810008；3.中國科學院大學，北京 100049）

伏毛鐵棒錘（Aconitum flavumHand.-Mazz.）屬于毛茛科烏頭屬植物，別名為斷腸草、烏藥和一支蒿等［1］，是我國傳統(tǒng)民族藥材也是甘、寧、藏等地廣泛應用的民間草藥，主要分布于內(nèi)蒙古南部、青海、甘肅、寧夏南部、四川西北部、西藏北部等地，生于海拔2 000～4 600 m的林下、灌叢和高山草甸［2］。以塊根和幼苗入藥，其干燥塊根俗稱“鐵棒錘”［3］。塊根具有活血祛瘀、祛風濕、止痛、消毒的功效；主要用于風濕性關(guān)節(jié)炎、關(guān)節(jié)痛、毒熱、腫瘤等疾病的治療［4-5］?，F(xiàn)代藥理毒理研究表明，生物堿類是伏毛鐵棒錘的主要活性成分，具有鎮(zhèn)痛、局麻、解熱、抗炎、抗腫瘤等藥理作用［6］。

目前，伏毛鐵棒錘總生物堿的提取方法主要有回流法［7］、浸提法［8］、超聲波輔助提取法［9］等。微波輔助提取法提取效率高、能耗低、安全環(huán)保，而有關(guān)研究較少［10-11］。因此，本試驗采用微波輔助法提取伏毛鐵棒錘總生物堿，并采用單因素試驗和Box-Behnken試驗設計響應面法對其提取工藝參數(shù)進行優(yōu)化，然后進行最優(yōu)工藝驗證性試驗，并測定不同地區(qū)伏毛鐵棒錘總生物堿含量，以期為該藥材開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 實驗儀器

FW100高速萬能粉碎機（北京科偉永興儀器有限公司）；ML204T 型電子天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司）；XH-300B微波超聲波組合催化合成/萃取儀（北京祥鵠科技發(fā)展有限公司）；Heizbad HB digit旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（博勱行儀器有限公司）；Agilent Infinity 1260型高效液相色譜儀（安捷倫科技有限公司）；JADE-PAK ODS色譜柱（廣州太瑋生物科技有限公司）。

1.2 試驗試劑與材料

烏頭堿對照品，批號DSTDW000602，質(zhì)量分數(shù)≥98%；甲醇（分析純，成都市科隆化學品有限公司）；乙腈（色譜純，德國默克股份兩合公司）；甲醇（色譜純，德國默克股份兩合公司）；磷酸（色譜純，德國默克股份兩合公司）。試驗材料見下表1。

表1 伏毛鐵棒錘樣品來源Tab.1 Origin of A.flavum

2 試驗方法

2.1 烏頭堿標準品溶液的制備

精密稱取0.001 0 g的烏頭堿標準品用甲醇超聲溶解并定容至10 mL棕色容量瓶中，制成0.1 μg/μL的烏頭堿標準品溶液。

2.2 供試品溶液的制備

精確稱取伏毛鐵棒錘根的干燥粉末1.00 g，粉末過60目篩，置于25 mL具塞試管中，在選定的微波時間、溫度、料液比以及甲醇體積分數(shù)下提取，共三次，抽濾得提取液并定容至25 mL的容量瓶中，過0.22 μm微孔濾膜，得供試品溶液。采用高效液相色譜法對提取液進行測定，計算粗提物中總生物堿含量。

2.3 色譜條件

色譜柱為 JADE-PAK ODS（250 mm × 4.6 mm，5 μm），以乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液為流動相，梯度洗脫（表2），檢測波長235 nm，檢測時間為35 min，柱溫25℃，進樣量10 μL，體積流量1.0 mL/min，烏頭堿對照品色譜圖見圖1-A，伏毛鐵棒錘樣品色譜圖見圖1-B。

表2 梯度洗脫的流動相比例Tab.2 The mobile phase ratio of gradient elution

圖1 烏頭堿標準品（A）和樣品（B）色譜圖Fig.1 Chromatogram of reference standards （A） and test samples （B） of aconitine

2.4 線性關(guān)系

吸取2.1項下配置的烏頭堿標準品溶液，過0.22 μm微孔濾膜濾過，依次設定進樣量為 2、4、6、8、10、12、14、16 μL，按2.3項下的色譜條件進行測定分析。以峰面積（Y）為縱坐標，對照品質(zhì)量（X）為橫坐標，進行線性回歸。

2.5 單因素試驗

2.5.1 溫度對提取率的影響

稱取1.00 g伏毛鐵棒錘粉末，固定料液比為1：10（g/mL），甲醇體積分數(shù)為100%，提取時間為8 min，分別在20、30、40、50、60℃的溫度下提取，考察不同溫度對總生物堿提取率的影響。

2.5.2 料液比對提取率的影響

稱取1.00 g伏毛鐵棒錘粉末，固定溫度為50℃，微波時間為8 min，甲醇體積分數(shù)為100%，分別在1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25（g/mL）的料液比下提取，考察不同料液比對總生物堿提取率的影響。

2.5.3 時間對提取率的影響

稱取1.00 g伏毛鐵棒錘粉末，固定料液比為1：20（g/mL），溫度為50℃，甲醇體積分數(shù)為100%，分別在4、8、12、16、20 min的時間下提取，考察不同提取時間對總生物堿提取率的影響。

2.5.4 體積分數(shù)對提取率的影響

稱取1.00 g伏毛鐵棒錘粉末，固定提取時間為16 min，溫度為50℃，料液比為1∶20（g/mL），分別在20%、40%、60%、80%、100%的甲醇體積分數(shù)下提取，考察不同體積分數(shù)對總生物堿提取率的影響。

2.6 響應面試驗

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選取對伏毛鐵棒錘總生物堿提取率影響較大的因素作為響應面Box-Behnken設計的變量，運用Design expert 12.0軟件的響應面法并以總生物堿提取率為指標安排試驗。

2.7 最佳萃取工藝的確定及驗證試驗

將Design expert 12.0軟件分析預測得到的最佳提取工藝參數(shù)進行調(diào)整：溫度48℃，料液比1∶19（g/mL），時間12 min，甲醇體積分數(shù)39%。取3份1.00 g的伏毛鐵棒錘粉末，按最佳萃取工藝進行三次提取試驗并計算得率。

2.8 伏毛鐵棒錘中總生物堿含量測定

以烏頭堿的量代表伏毛鐵棒錘中總生物堿含量，根據(jù)響應面試驗得到的最優(yōu)工藝測定分析不同地區(qū)伏毛鐵棒錘中總生物堿的含量。

2.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

用IBM SPSS Statistics 25和Design-Expert 12.0軟件進行數(shù)據(jù)處理與分析。

3 結(jié)果與分析

3.1 線性關(guān)系考察結(jié)果

按照“2.3”項色譜條件依次進樣。以峰面積（Y）為縱坐標、烏頭堿質(zhì)量（X）為橫坐標進行線性回歸分析，得烏頭堿回歸方程為Y= 1 021X+ 21.129，R2= 0.999 5，表明烏頭堿在選定的峰面積和相對質(zhì)量范圍內(nèi)具有良好線性關(guān)系。

3.2 單因素試驗結(jié)果

由圖2A可知，隨著溫度的升高，總生物堿得率先升高后降低，當溫度高于50℃，總生物堿提取得率開始下降，可能是因為過高的溫度導致部分生物堿被分解或轉(zhuǎn)化［12］。因此，選擇50℃為最適提取溫度。

由圖2B可知，伏毛鐵棒錘總生物堿的提取得率隨著料液比的增加呈現(xiàn)先升高后降低趨勢，并在料液比為1∶20（g/mL）時，達到最高值，與劉樹興等［13］的研究結(jié)果一致。料液比的增加使溶液傳質(zhì)推動力變強，使溶劑進入細胞壁的速度加快，從而釋放胞內(nèi)物質(zhì)，繼續(xù)增大料液比，細胞轉(zhuǎn)運通道達到飽和［14］。因此，選擇1∶20（g/mL）為最適料液比。

由圖2C可知，微波提取時間在4～12 min范圍內(nèi)，總生物堿得率呈平穩(wěn)上升趨勢，當提取時間為16 min時，得率最高；時間高于16 min，總生物堿提取得率降低，時間過短提取不充分，過長導致生物堿降解［15］。因此，選擇16 min為最適提取時間。

由圖2D可知，當甲醇體積分數(shù)為40%時，得率達到最高值；隨著體積分數(shù)的增加其得率逐漸降低。推測由于甲醇濃度的增加使伏毛鐵棒錘中的脂溶性成分、醇溶性雜質(zhì)溶出，其中脂溶性成分可能與甲醇-水分子結(jié)合，從而與伏毛鐵棒錘中的生物堿形成競爭關(guān)系，導致伏毛鐵棒錘總生物堿的得率降低［14］。

圖2 不同因素對總生物堿得率的影響Fig.2 Effects of different factors on the yield of total alkaloids

3.3 響應面試驗結(jié)果

3.3.1 Box-Behnken 試驗設計

采用Box-Behnken中心組合試驗設計原理，通過分析單因素試驗結(jié)果，研究各因素對總生物堿提取效果的影響，使用Design Expert 12.0進行響應面設計，以溫度（A）、料液比（B）、時間（C）、甲醇體積分數(shù)（D）為自變量，總生物堿提取得率為評價指標，進行四因素三水平的響應面試驗，預測伏毛鐵棒錘總生物堿的最佳提取工藝，具體的因素水平設計見表3。響應面實驗結(jié)果見表4。

表3 響應面試驗因素與水平Tab.3 Response surface test factors and levels

3.3.2 模型建立與方差分析

將表4所得數(shù)據(jù)用Design-Expert 12.0進行響應面試驗分析，以總生物堿提取率為響應值，對各因素進行回歸分析，得到二次多元回歸方程：

表4 Box-Behnken設計-響應面設計試驗因素水平及試驗結(jié)果Tab.4 Box-Behnken design-response surface design test factor levels and test results

續(xù)表

Y= 0.288 6 - 0.003 8A- 0.003 7B- 0.003 1C+0.000 8D+ 0.005 3AB-0.000 7AC- 0.008 3BD+0.002 5CD- 0.014 4A2- 0.013 7B2+ 0.000 5C2-0.01 7 3D2。

由表5方差分析結(jié)果可知，二次回歸模型影響極顯著（P＜ 0.01），失擬項為0.070 8（P＞ 0.05），表明回歸模型與實測值擬合度較好，不存在明顯失擬因素；R2= 0.919 2，CV= 2.07%＜ 5%，表明該模型重復性好；另外，A、B項的P＜ 0.05，說明溫度和料液比對伏毛鐵棒錘總生物堿得率有顯著影響。由表5中一次項、二次項及交互項P值可知，AD、BD交互作用顯著（P＜0.05），A2、B2、D2均達到極顯著水平（P＜ 0.01）。由F值可知，四個因素對總生物堿含量影響程度依次為A＞B＞C＞D，即溫度＞料液比＞時間＞甲醇體積分數(shù)。

表5 響應面二次模型的方差分析結(jié)果Tab.5 ANOVA results for the response surface quadratic model

3.3.3 響應面分析

為進一步確定A、B、C、D四個因素的最佳水平范圍以及因素之間的交互作用對伏毛鐵棒錘總生物堿提取得率的影響，根據(jù)分析結(jié)果做三維曲面圖（圖3）。曲面圖中等高線的形狀、密集程度和響應曲面的陡峭程度可以判斷因素之間的交互作用。等高線密集且呈橢圓形，響應曲面的坡度越陡峭，表明試驗因素對響應值影響越大，兩因素間的交互作用越顯著。反之，等高線稀疏呈圓形，響應面坡度越緩表明兩組因素交互作用不顯著［16］。由圖3可知，料液比（B）的響應曲面坡度最陡峭，時間（C）的坡度最緩，表明料液比對總生物堿得率影響最大，而時間對得率的影響最小。溫度（A）和體積分數(shù)（D）、料液比（B）和體積分數(shù)（D）的等高線密集呈橢圓形且響應面坡度陡峭，表明AD、BD交互作用影響顯著，其他因素交互作用影響較小，與方差分析結(jié)果一致。通過Design expert 12.0中的Numerical分析預測得到的最佳提取工藝參數(shù)為：溫度48.372℃，料液比1∶19.080（g/mL），時間12 min，甲醇體積分數(shù)為38.828%，在此條件下，伏毛鐵棒錘總生物堿提取得率為0.293%。

圖3 各因素交互作用的響應面圖Fig.3 Response surface diagram of the interaction of various factors

3.3.4 驗證試驗

在最佳提取工藝條件下進行驗證試驗，總生物堿得率平均值為0.288%（RSD為1.120%）與預測值（0.293%）接近，表明調(diào)整后的總生物堿微波輔助提取工藝與響應面優(yōu)化結(jié)果一致，該工藝穩(wěn)定可靠。

3.4 不同地區(qū)伏毛鐵棒錘中烏頭堿的含量測定

在最佳提取工藝條件下測定了不同地區(qū)伏毛鐵棒錘中烏頭堿的含量，其中青海貴南烏頭堿含量最高，青海甘德烏頭堿含量最低，測定結(jié)果見表6。

表6 不同地區(qū)伏毛鐵棒錘中總生物堿含量Tab.6 Content of total alkaloids in A.flavum from different regions

4 討論與結(jié)論

馬新?lián)Q等［17］用加熱回流法測得伏毛鐵棒錘中總生物堿含量為0.234%；林麗等［18］用浸提法測得不同產(chǎn)地鐵棒錘中總生物堿含量為0.036%～0.201%，本研究采用微波輔助提取法測得不同地區(qū)伏毛鐵棒錘總生物堿含量為0.090%～0.290%，得率相對較高?；亓鞣?、浸提法耗時耗能且得率較低，而微波輔助提取是利用不同組分吸收微波能力的差異，在細胞內(nèi)部產(chǎn)生熱應力，熱運動加劇，使細胞壁破裂，溶劑易于進入細胞內(nèi)，溶解并釋放胞內(nèi)產(chǎn)物［19］；具有溶劑用量少、快速高效的特點。因此，該方法提取伏毛鐵棒錘總生物堿的提取效率較高。

生物堿是一種能對多種環(huán)境脅迫作出反應的次生代謝產(chǎn)物，生物堿含量提高能增強植物對環(huán)境的適應性。本研究對不同產(chǎn)地伏毛鐵棒錘總生物堿進行了含量測定，其中貴南、阿壩樣品中生物堿含量顯著高于其它產(chǎn)地?？赡苁且驗橘F南縣草原灘地較多，土壤均為壤土且呈微堿性或堿性，有機質(zhì)豐富；阿壩牧草地、草甸土資源豐富適合伏毛鐵棒錘生長發(fā)育。王容［9］、林麗［18］、趙梅宇［20］等人測定了不同地區(qū)鐵棒錘總生物堿含量，分別以寧夏隆德、陜西秦嶺、西藏的含量最高，分別為0.365%、0.201%、0.117%。藥用植物的生長發(fā)育、有效物質(zhì)的合成與積累，一方面取決于遺傳特性，另一方面與其生長環(huán)境條件相關(guān)［21］。不同產(chǎn)地的伏毛鐵棒錘樣品總生物堿含量存在較大差異，可能是因為產(chǎn)地不同導致氣候、土壤、溫度、輻射、水分等環(huán)境因子不同［22］，同時也受藥材采集的生長年限和采集月份的影響。

本研究用微波輔助提取伏毛鐵棒錘總生物堿，經(jīng)單因素試驗、響應面優(yōu)化得到最佳工藝為溫度48℃，料液比1∶19（g/mL），時間12 min，甲醇體積分數(shù)39%。說明該工藝穩(wěn)定可靠、高效便捷。綜上所述，本研究能夠為伏毛鐵棒錘資源的開發(fā)利用提供參考依據(jù)。