匹伐他汀對代謝綜合征大鼠NF-κB、PPARα及糖脂代謝調(diào)控的干預作用

周 華

代謝綜合征(metabolic syndrome，MS)是一組以體內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)代謝障礙為特征的臨床癥候群，主要的臨床表現(xiàn)為肥胖、血脂異常[三酰甘油(TG)升高、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)降低]、高血壓、糖尿病或葡萄糖耐量受損等，發(fā)病機制尚未明確，臨床上尚缺乏根治性的治療藥物或治療手段，該病的致死率、致殘率極高，是危害全球的公共健康問題之一[1]。病人糖脂代謝異常導致的脂肪在內(nèi)臟的異常堆積是代謝綜合征最為關鍵的危險因素[2]。研究表明，動物體內(nèi)的脂肪組織不僅可以產(chǎn)生游離的脂肪酸，參與機體能量的儲存，而且還能分泌諸多脂肪細胞因子(ADS)參與炎癥、胰島素抵抗、物質(zhì)代謝等病理過程[3]。脂肪細胞不僅能分泌多種炎性因子，增強炎性因子的表達，促進炎性介質(zhì)的浸潤，激活更大范圍的炎性信號通路，增強脂肪組織中炎癥性應激以及胰島素受體底物1絲氨酸磷酸化水平，最終致使病人出現(xiàn)胰島素抵抗，推動代謝綜合征的發(fā)展[4]。匹伐他汀(冠爽)在臨床上用于治療高膽固醇癥、家族性高膽固醇癥等。臨床觀察發(fā)現(xiàn)，匹伐他汀能明顯調(diào)控病人的血脂指標，影響病人的脂肪代謝[5]。過氧化物酶體增殖物激活受體α(peroxisome proliferator-activated receptor-α，PPAR-α)/核轉錄因子κB(nuclear factor κB，NF-κB)通路在多種與脂肪代謝相關的疾病及高脂性脂肪性肝炎、非酒精性脂肪肝等疾病中有重要作用[6]。研究表明，上調(diào)PPAR-α能明顯減輕糖尿病大鼠因胰島素抵抗而致的腎損傷[7]。本研究通過構建大鼠代謝綜合征模型，從動物肝臟中糖脂代謝的角度，基于PPAR-α/NF-κB信號通路，探討匹伐他汀對代謝綜合征糖脂代謝的影響機制，以期為臨床藥物的開發(fā)利用提供實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 無特定病原體(SPF)級9～10周齡SD雄性大鼠60只，體質(zhì)量200～250 g，購自湖南省安生美藥物研究院有限公司，動物使用許可證號：SYXK(湘)2018-0005，根據(jù)我院實驗動物管理辦法，室溫下標準飼料、自由飲水、分籠(4籠)適應性飼養(yǎng)1周后用于試驗。

1.2 主要試劑與儀器 匹伐他汀(冠爽，規(guī)格：每片2 mg，華潤雙鶴藥業(yè)有限公司，國藥準字H20080737)，二甲雙胍緩釋片(美噠靈，規(guī)格：每片0.5 g，上海上藥信宜藥廠有限公司，國藥準字H20050699)。蘇木素-伊紅(hematoxylin and eosin，HE)染色試劑盒購自美國Selleck公司。組織裂解液、二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白濃度測定試劑盒、3，3′-二氨基聯(lián)苯胺(3，3′-diaminobenzidine，DAB)化學發(fā)光試劑盒購自北京華夏遠洋科技有限公司。PPAR-α、NF-κB抗體購自Santa公司。磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution，PBS)、酶聯(lián)免疫吸附法檢測用白細胞介素-6(interleukin 6，IL-6)和腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)試劑盒購自北京中杉金橋生物有限公司?？崭寡?fasting plasma glucose，F(xiàn)PG)、血胰島素(fasting insulin，F(xiàn)INS)、總膽固醇(total cholesterol，TC)、TG、低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C)、HDL-C購自羅氏診斷產(chǎn)品(上海)有限公司。牛血清白蛋白(bovine serum albumin、BSA)、甲醇、丙酮、二甲苯、中性樹膠購自武漢博士德生物有限公司。兔抗大鼠NF-κB、PPARα以及甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)單克隆抗體購自美國Cell Signaling Technolohy公司。聚合酶鏈式反應(PCR)試劑盒、SYBR Green PCR 試劑盒、RNA提取試劑盒、逆轉錄試劑盒均購自德國Thermo公司。

羅氏Modular P800全自動生化分析儀(瑞士ROCHE公司)，AP-960全自動酶聯(lián)免疫分析儀(日本協(xié)和醫(yī)藥株式會社)，蘇凈Airtech超凈工作臺(北京六一儀器廠)，組織包埋機(德國Leica公司，型號：LEICAEG1150)，Nikon Ti-U/Ti-s倒置熒光顯微鏡(日本三菱公司，型號：H-7650)，5810R 型高速離心機(日本島津公司)，E-Gel Imager凝膠成像儀(美國Beckma公司)。

1.3 試驗方法

1.3.1 模型構建與分組 按照隨機數(shù)字表法將大鼠分為正常組、模型組、實驗組、對照組，每組15只。正常組大鼠始終給予基礎飼料喂養(yǎng)，模型組、實驗組、對照組大鼠給予高脂、高鹽、高糖飼料喂養(yǎng)12周建立代謝綜合征動物模型[8]?；A飼料總熱量為14.32 kJ/g，主要包括玉米面、小麥麩、大豆油、全麥次粉、豆粕、鹽、氯化膽堿、必需氨基酸、礦質(zhì)元素以及復合維生素等。高脂、高鹽、高糖飼料總熱量為20.56 kJ/g，主要包括56%基礎飼料、15%蔗糖、15%動物脂肪、10%蛋黃等混合均勻后，再額外添加2%的食鹽和2%的膽固醇。兩種飼料均購自湖南大通農(nóng)業(yè)科技有限公司。

12周后，檢測大鼠動脈壓，腹靜脈采血測定其血糖、血脂水平判斷建模是否成功。建模成功后，實驗組和對照組大鼠分別給予匹伐他汀和二甲雙胍緩釋片100 mg/kg灌胃，每日1次；模型組和正常組給予等劑量生理鹽水灌胃，連續(xù)給藥4周。模型組、實驗組、對照組仍給予高脂、高鹽、高糖飼料，正常組給予基礎飼料喂養(yǎng)，所有大鼠均自由飲水，標準動物房飼養(yǎng)。

末次給藥后，禁食12 h，稱量各組大鼠體重，腹靜脈采血2 mL，離心，留取上清液，低溫冷藏待測。麻醉動物后，斷頭處死，無菌剝離大鼠的胰腺組織、肝臟組織、腎周脂肪組織，依次使用PBS、生理鹽水清洗干凈，無菌濾紙吸掉水分，稱其質(zhì)量，迅速以液氮封存，低溫冷藏待測。大鼠胰腺的臟器系數(shù)=大鼠胰腺質(zhì)量/大鼠體質(zhì)量×100%，大鼠肝臟的臟器指數(shù)=大鼠肝臟質(zhì)量/大鼠體質(zhì)量×100%。

1.3.2 大鼠胰腺組織、肝臟組織病理變化的觀察 分別取各組大鼠10%的胰腺組織和肝臟組織，生理鹽水清洗，4%多聚甲醛固定，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，常規(guī)切片、貼片、烤片，HE染色，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察結果。

1.3.3 大鼠血清指標的檢測 羅氏Modular P800全自動生化分析儀測定各組大鼠血清FPG、FINS、TC、TG、LDL-C、HDL-C水平，全自動酶聯(lián)免疫分析儀檢測各組大鼠血清中IL-6和TNF-α的含量。同時通過[FPG(mmol/L)× FINS(mU/L)]/22.5計算大鼠的胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)[9]。

1.3.4 PCR檢測各組大鼠肝臟中糖、脂代謝基因的mRNA表達 取20%的大鼠肝臟組織，常規(guī)提取各組細胞的總RNA，測定純度和完整度，逆轉錄合成cDNA，PCR儀進行擴增。GAPDH作為內(nèi)參；以2-△△Ct表示基因的相對表達量[10]。糖原合成基因(GS2)、胰島素誘導基因1(INSIG1)、胰島素誘導基因2(INSIG2)，脂肪酸合成的乙酰輔酶A羧化酶基因(ACC)、固醇調(diào)節(jié)元件結合蛋白基因(SREBP)、脂肪酸合成酶基因(FAS)以及GAPDH的正向序列和反向序列均由湖南潤美基因科技有限公司設計完成。各目的基因的引物序列詳見表1。

表1 糖、脂代謝基因及其引物序列

1.3.5 免疫組化法檢測各組大鼠肝臟組織中NF-κB、PPARα含量 取10%大鼠肝臟組織，用10%的中性甲醛固定，包埋，切片，脫蠟，去除內(nèi)源性過氧化物酶，PBS修復抗原，分別加一抗(1∶100)4 ℃過夜孵育，次日加入二抗(1∶500)室溫孵育，DAB顯色，蘇木素復染，丙酮梯度脫水，二甲苯浸泡，中性樹膠封片，鏡檢觀察并記錄實驗結果；用圖像分析軟件進行系統(tǒng)分析NF-κB、PPARα的陽性細胞比例。

1.3.6 蛋白免疫印跡法(Western Blot)檢測各組大鼠脂肪組織NF-κB、PPARα蛋白表達水平 取10%大鼠脂肪組織，裂解后離心留取上清，測定總蛋白濃度后，取50 μg樣品，進行電泳、轉膜、封閉，加入一抗(均為1∶1 000)，4 ℃孵育過夜，加入二抗，DAB顯色，成像，Image軟件分析各條帶的灰度值，以GAPDH作為內(nèi)參，獲得蛋白的相對表達量。

2 結 果

2.1 代謝綜合征大鼠的建模情況 基礎飼料喂養(yǎng)大鼠(正常組)活動正常，反應機敏，皮毛順滑有光澤，體重增加穩(wěn)定；高脂、高鹽、高糖飼料喂養(yǎng)12周后，模型組、實驗組、對照組大鼠反應逐漸遲鈍，活動量減少，皮毛漸漸失去光澤，變得暗淡粗糙，飲水量明顯增多?；A飼料喂養(yǎng)大鼠平均動脈壓為(105.78±5.69)mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)，TG為(2.13±0.49)mmol/L，血糖為(0.85±0.55)mmol/L；高脂、高鹽、高糖飼料喂養(yǎng)大鼠平均動脈壓為(131.37±6.71)mmHg，TG為(6.78±0.63)mmol/L，血糖為(2.83±0.66)mmol/L，高脂、高鹽、高糖飼料喂養(yǎng)大鼠的平均動脈壓、TG、血糖水平明顯高于基礎飼料喂養(yǎng)大鼠，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2.2 各組大鼠胰腺組織、肝臟組織病理改變比較 HE染色結果顯示，正常組大鼠肝臟組織結構完整，細胞規(guī)則，大小均勻，排列有序，肝細胞索呈放射狀排列；模型組大鼠肝臟組織損傷明顯，肝細胞的界限模糊，細胞出現(xiàn)分布較多的脂肪空泡，肝細胞索失去正常結構，排列紊亂。實驗組和對照組大鼠的肝臟組織損傷明顯緩解，肝細胞排列趨于正常，細胞界限較模型組清晰可辨。詳見圖1。正常組大鼠的胰腺實質(zhì)分葉清晰，胰腺組織結構完整，細胞規(guī)整排列，胰島色淺，在胞漿內(nèi)呈球狀，腺泡上皮細胞呈錐形，核質(zhì)界限清晰，線粒體以及其他細胞器規(guī)整地分散在胞核周圍，胞漿呈現(xiàn)嗜堿性；模型組大鼠胰腺組織失去正常形狀，腺體內(nèi)出現(xiàn)大量的空泡變性，結構完整的線粒體數(shù)量減少，核質(zhì)界限不明顯，核質(zhì)固縮嚴重，細胞內(nèi)容物明顯減少，胰島β細胞的結構不明，炎性細胞浸潤明顯；實驗組和對照組大鼠的胰腺組織損傷較模型組明顯減輕，腺體內(nèi)雖有空泡樣變性以及少量的炎性細胞，但線粒體數(shù)量明顯增多，核膜的結構區(qū)域正常。詳見圖2。

圖1 各組大鼠肝臟組織病理變化(×400)

圖2 各組大鼠胰腺組織病理變化(×400)

2.3 各組大鼠臟器指數(shù)比較 與正常組比較，模型組大鼠的肝臟系數(shù)明顯升高、胰腺系數(shù)明顯降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與模型組比較，實驗組和對照組大鼠肝臟系數(shù)明顯降低、胰腺系數(shù)明顯升高，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；實驗組和對照組肝臟系數(shù)、胰腺系數(shù)比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。詳見圖3。

模型組與正常組比較，＊ P<0.05；與模型組比較，# P<0.05。

2.4 各組大鼠血清指標比較 與正常組比較，模型組大鼠FPG、FINS、HOMA-IR、TC、TG、LDL-C、IL-6、TNF-α水平均明顯升高，HDL-C明顯下降，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與模型組比較，實驗組和對照組大鼠FPG、FINS、HOMA-IR、TC、TG、LDL-C、IL-6、TNF-α水平均明顯下降，HDL-C明顯升高，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；實驗組和對照組以上指標比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。詳見圖4。

與正常組比較，＊ P<0.05；與模型組比較，# P<0.05。

2.5 各組大鼠肝臟組織糖、脂代謝基因表達比較 與正常組比較，模型組大鼠肝臟組織糖代謝基因GS2、脂代謝基因ACC、SREBP、FAS的mRNA表達明顯升高，糖代謝基因INSIG1、INSIG2的mRNA表達明顯下降，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與模型組比較，實驗組和對照組大鼠肝臟組織糖代謝基因GS2、脂代謝基因ACC、SREBP、FAS的mRNA表達明顯下降，糖代謝基因INSIG1、INSIG2的mRNA表達明顯升高，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；實驗組和對照組以上指標比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。詳見圖5。

2.6 各組大鼠肝臟組織PPARα、NF-κB含量比較 與正常組比較，模型組大鼠肝臟組織中PPARα陽性細胞比例明顯下降、NF-κB陽性細胞比例明顯升高，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與模型組比較，實驗組和對照組大鼠肝臟組織中PPARα陽性細胞比例明顯升高、NF-κB陽性細胞比例明顯下降，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；實驗組和對照組以上指標比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。詳見圖6、圖7。

模型組與正常組比較，＊P<0.05；與模型組比較，#P<0.05。

模型組與正常組比較，＊P<0.05；與模型組比較，#P<0.05。

圖7 各組大鼠肝臟組織PPARα、NF-κB含量免疫組化圖(×400 )

2.7 各組大鼠脂肪組織PPARα、NF-κB蛋白表達比較 與正常組比較，模型組大鼠脂肪組織中PPARα蛋白表達明顯下降、NF-κB蛋白表達明顯升高，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與模型組比較，實驗組和對照組大鼠脂肪組織中PPARα蛋白表達明顯升高、NF-κB蛋白表達明顯下降，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；實驗組和對照組以上指標比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。詳見圖8、圖9。

圖8 各組大鼠脂肪組織PPARα、NF-κB蛋白表達條帶圖

模型組與正常組比較，＊P<0.05；與模型組比較，# P<0.05。

3 討 論

隨著人們生活方式與飲食習慣的改變，代謝綜合征受多種心血管疾病合并癥如高血壓、高血脂等的危險因素的影響，其發(fā)病率呈現(xiàn)逐年上升趨勢[11]。目前，針對該病的臨床干預往往傾向于疾病前狀態(tài)，而忽略病人早期代謝異常的狀態(tài)，以致難以全面干預疾病的發(fā)展，嚴重制約療效以及影響病人的遠期預后。

匹伐他汀是臨床上廣泛應用的強效降脂藥物。藥理學研究顯示，匹伐他汀不僅具有較好的抗炎、穩(wěn)定斑塊的作用，還能阻斷細胞內(nèi)膽固醇的合成，調(diào)節(jié)機體內(nèi)的血脂水平[12]。馮翔等[13]研究證實，在冠狀動脈旁路移植術后使用匹伐他汀對病人進行強化降脂治療，可明顯降低LDL-C水平，且并未增加病人的肝、腎負擔，是圍術期降脂的理想藥物。王麗娟等[14]臨床研究表明，在治療非酒精性脂肪性肝病中，匹伐他汀可降脂、抗炎及改善病人出現(xiàn)的胰島素抵抗現(xiàn)象，并且對肝功能的影響較低。韓瑞芳[15]研究表明，在冠心病合并血脂升高的病人中長期服用匹伐他汀，能明顯降低病人的血脂水平，但并不增加病人發(fā)生糖尿病的風險。Carmena等[16]研究顯示，降血脂藥物瑞舒伐他汀的副作用主要表現(xiàn)為對胃腸道的刺激癥狀、肌肉酸痛無力，可能導致內(nèi)分泌失調(diào)，而將匹伐他汀應用到早發(fā)冠心病的治療中，不存在上述副作用。司曉鳳等[17]研究表明，在急性心肌梗死病人中應用匹伐他汀，能夠全面改善病人的血脂水平，升高其脂聯(lián)素水平，調(diào)控血糖水平。本研究在成功構建代謝綜合征大鼠后，模型組大鼠出現(xiàn)類似人類的代謝綜合征臨床癥狀，采用匹伐他汀進行干預，實驗組動物肝臟、胰腺組織損傷明顯緩解，血清中血糖、血脂、炎性因子指標明顯改善，肝臟組織中血糖、血脂代謝相關基因的表達趨于正常，證實了匹伐他汀對代謝綜合征的治療作用。

NF-κB是炎性應激的調(diào)控樞紐，炎性因子經(jīng)NF-κB轉錄激活后表達，慢性炎性應激與脂肪在內(nèi)臟中異常堆積是代謝綜合征的基本病理改變[18]。研究表明，在高脂、高糖、高鹽的誘導下，NF-κB激活TNF-α、IL-6等炎性因子的表達，而TNF-α、IL-6作為脂肪細胞因子，不僅干擾胰島素受體的功能，使機體出現(xiàn)胰島素抵抗狀態(tài)，還能將炎性信號級聯(lián)放大，誘發(fā)更劇烈的炎癥性反應，使病人出現(xiàn)代謝綜合征[19]。PPAR-α是一種核受體超家族的轉錄因子，主要在肝臟、心、腎以及脂肪組織中表達。PPAR-α在機體內(nèi)主要參與調(diào)控糖脂代謝和抑制炎性應激[20]。華慧英等[21]研究表明，在代謝綜合征小鼠模型中，PPAR-α不僅能激活多種糖、脂基因的表達，還能降低血脂、升高HDL-C，并且能夠抑制炎癥性反應的發(fā)展，改善小鼠的胰島素抵抗。本研究中，實驗組大鼠肝臟與脂肪組織中PPARα蛋白表達升高，NF-κB蛋白表達下降，推斷匹伐他汀可能是通過調(diào)節(jié)PPAR-α/NF-κB信號來調(diào)控代謝綜合征大鼠的糖、脂代謝。

綜上所述，匹伐他汀能夠調(diào)節(jié)代謝綜合征大鼠的糖、脂代謝，可能與PPAR-α/ NF-κB信號有關。但是將匹伐他汀用于臨床治療代謝綜合征時仍需進一步考察其遠期療效。