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    穩(wěn)心顆粒調(diào)節(jié)心肌梗死大鼠心肌縫隙連接蛋白43表達(dá)及自噬的研究

    2023-03-16 06:45:02紀(jì)曉迪劉珂珂婁利霞趙久麗吳愛明
    關(guān)鍵詞:模型

    呂 夢,紀(jì)曉迪,劉珂珂,婁利霞,聶 波,趙久麗,吳愛明

    心肌梗死后繼發(fā)的快速型室性心律失??蓪?dǎo)致心源性猝死的發(fā)生[1]??p隙連接可作為心肌梗死后心律失常的有效治療靶點(diǎn)。在心臟中,縫隙連接介導(dǎo)心肌細(xì)胞間的電偶聯(lián),是維持正常心律、調(diào)節(jié)血管張力和細(xì)胞間代謝交換的基礎(chǔ)[2]。縫隙連接蛋白43(CX43)主要在心房和心室肌細(xì)胞中表達(dá),是心臟中最豐富的CX亞型[3]。自噬是細(xì)胞內(nèi)受損細(xì)胞器和蛋白質(zhì)降解的保守過程,心肌細(xì)胞可以通過自噬降解錯誤折疊或老化的蛋白質(zhì)以及細(xì)胞器,為心肌細(xì)胞提供能量供應(yīng)從而維持正常的心肌功能,而在心肌梗死病理?xiàng)l件下過度激活的自噬則可引起大量細(xì)胞死亡,加重病情進(jìn)展[4]。研究表明,誘導(dǎo)自噬的條件對連接蛋白的表達(dá)水平有直接影響[5-6]。

    穩(wěn)心顆粒由黃精、三七、黨參、琥珀、甘松5味藥配伍而成,對于多種原因引起的心律失常有顯著療效。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn),穩(wěn)心顆粒可通過調(diào)控CX43的表達(dá)分布,從而改善心律失常[7];而在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)層面,已發(fā)現(xiàn)穩(wěn)心顆??烧{(diào)節(jié)肥大心肌細(xì)胞自噬水平[8]?;谝陨暇€索,本研究通過結(jié)扎冠狀動脈左前降支,建立心肌梗死大鼠模型,初步探討心肌梗死后心律失常病理?xiàng)l件下,穩(wěn)心顆粒對CX43的表達(dá)以及心肌自噬水平變化的影響,以此進(jìn)一步揭示心肌梗死后心律失常的發(fā)病機(jī)制并闡明穩(wěn)心顆粒新的干預(yù)靶點(diǎn)。

    1 材料與方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)動物 無特定病原體(SPF)級雄性SD大鼠40只,體質(zhì)量(200±20)g,購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)技術(shù)有限公司,許可證號:SCXK(京)2016-0006。通過醫(yī)學(xué)倫理審批后,于中醫(yī)內(nèi)科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室屏障環(huán)境動物室中飼養(yǎng)。

    1.2 藥物及試劑 穩(wěn)心顆粒,每袋5 g(山東步長制藥股份有限公司,國藥準(zhǔn)字Z10950026)。酒石酸美托洛爾片,每片25 mg(阿斯利康制藥有限公司,批準(zhǔn)文號H32025391)。自噬相關(guān)蛋白微管相關(guān)蛋白/輕鏈3(LC3)、酵母自噬相關(guān)基因6哺乳動物同原體(Beclin1) 、P62、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)抗體(Proteintech抗體公司,貨號分別為14600-1-AP、11306-1-AP、18420-1-AP、10494-1-AP),CX43抗體(Abcam公司,貨號ab11370)。辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗(蘭博利德公司,貨號S0101),免疫組化通用SP試劑盒、3,3-N-二氨基聯(lián)苯胺四鹽酸(DAB)顯色試劑盒(中杉金橋公司,貨號分別為SP-9000、ZLI-9018),超敏增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法(ECL)試劑盒(新賽美公司,貨號P10100)。

    1.3 儀器 超高分辨率小動物超聲成像系統(tǒng)(加拿大VisualSonics公司,型號:Vevo 2100),泰盟BL-420S生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng),徠卡石蠟切片機(jī)(型號:RM2235),電泳儀(北京龍方科技有限公司,型號:LF-2000),水平式脫色搖床(北京龍方科技有限公司,型號:LF-TS03),光學(xué)顯微鏡(德國徠卡顯微系統(tǒng),型號:DMC5400),ECL化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(上海天能科技有限公司,型號:Tanon-4600)。

    1.4 方法

    1.4.1 模型制備[9]選取32只大鼠,在大鼠左胸前區(qū)第3、4肋間逐層剪開皮膚、肌肉層,鈍性分離肋骨層,撕開心包膜后,充分暴露手術(shù)視野,采用心臟左冠狀動脈前降支結(jié)扎法建立心肌梗死大鼠模型,肉眼可見結(jié)扎線下左室前壁缺血變白,術(shù)后即刻心電圖可見ST段明顯抬高,術(shù)后24 h心電圖可見病理性Q波形成。

    1.4.2 分組及給藥 以術(shù)后24 h前壁V3~V6導(dǎo)聯(lián)、側(cè)壁Ⅰ導(dǎo)聯(lián)、aVL導(dǎo)聯(lián),同時兼有前間壁V1導(dǎo)聯(lián)或V2導(dǎo)聯(lián)可見病理性Q波為建模成功標(biāo)準(zhǔn)[10]。隨機(jī)分為模型組、美托洛爾組、穩(wěn)心顆粒低劑量組、穩(wěn)心顆粒高劑量組,每組8只,另取8只大鼠為正常組。穩(wěn)心顆粒低劑量組(1.35 g/kg)和美托洛爾組(2.25×10-3g/kg)的給藥劑量參考文獻(xiàn)[11]的等效劑量換算方法進(jìn)行折算,穩(wěn)心顆粒高劑量組(2.7 g/kg)的給藥劑量為低劑量組的2倍。術(shù)后24 h開始灌胃給藥,每日1次,連續(xù)治療4周。正常組及模型組均給予等量生理鹽水。

    1.4.3 超聲心動圖檢測 給藥4周后,使用小動物心臟超聲心動圖測量評價大鼠心臟結(jié)構(gòu)和功能。麻醉大鼠后,測量并記錄左室短軸收縮末期前壁厚度(LVAWs)、左室舒張末期前壁厚度(LVAWd)、左室收縮末期內(nèi)徑(LVIDs)、左室舒張末期內(nèi)徑(LVIDd)以及左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)。所有原始測量值選取至少3個連續(xù)心動周期,取平均值。

    1.4.4 心室顫動閾值測定 在體心臟電刺激誘發(fā)心室顫動。給藥4周后,腹腔注射麻醉大鼠,行氣管插管,連接呼吸機(jī)輔助呼吸,連接BL-420生物機(jī)能系統(tǒng),啟動系統(tǒng)軟件,選擇菜單“輸入信號/通路1/心電”后,出現(xiàn)心電圖波形。沿四五肋間開胸并暴露心臟,刺激電極的正極鉤在心尖,負(fù)極鉤在靠近心底方向與正極相距3 mm,設(shè)置電刺激條件(粗電壓,串刺激,串長10個刺激波,起始強(qiáng)度1 V),圖形穩(wěn)定后,開始電刺激,紀(jì)錄第1次誘發(fā)心室顫動的電壓值,作為心室顫動閾值。

    1.4.5 心臟組織病理學(xué)改變 蘇木精-伊紅(HE)染色觀察心臟組織病理學(xué)改變。

    1.4.6 免疫組織化學(xué)染色檢測相關(guān)蛋白表達(dá) 給藥4周后,麻醉大鼠并取心臟,心臟組織經(jīng)過固定、脫水、透明、石蠟包埋后制成石蠟切片,并行免疫組織化學(xué)染色。參照試劑盒說明書,烤片1 h,脫蠟水化后,進(jìn)行抗原修復(fù),阻斷劑室溫孵育10 min,磷酸緩沖鹽溶液(PBS)沖洗后加入山羊血清封閉,之后加入一抗,一抗稀釋比例分別為LC3(1∶800)、Beclin1(1∶200)、CX43(1∶200),4 ℃孵育過夜。DAB顯色,陽性表達(dá)呈棕色,采用Image J軟件分析LC3、Beclin1、CX43蛋白表達(dá)的平均光密度值(average optical density,AOD)。

    1.4.7 蛋白免疫印跡法(Western Blot)檢測相關(guān)蛋白表達(dá) 每組選取6只大鼠,取出各組大鼠心室梗死邊緣區(qū)組織20 mg,按照1∶10的比例加入RIPA裂解液200 μL,充分超聲勻漿,靜置20 min后,低溫離心移取上清,使用BCA試劑盒測定蛋白濃度,將各組蛋白調(diào)整至4 μg/μL,置于-20 ℃凍存,在半月內(nèi)檢測完畢。進(jìn)行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)電泳的上樣體積為每組10 μL,200 mA恒流將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上,室溫封閉1 h, 緩沖液洗膜后加入稀釋好的一抗,4 ℃過夜孵育。一抗稀釋比例GAPDH、CX43、LC3、P62、Beclin1分別為1∶20 000,1∶8 000,1∶1 500,1∶5 000,1∶5 000。二抗室溫孵育1 h,洗膜后進(jìn)行化學(xué)發(fā)光顯影。使用Image J進(jìn)行分析蛋白條帶,計(jì)算出CX43、LC3、P62、Beclin1蛋白相對表達(dá)量。

    2 結(jié) 果

    2.1 各組大鼠超聲心動圖指標(biāo)比較 與正常組比較,模型組大鼠LVAWs、LVAWd、LVEF降低,LVIDs、LVIDd升高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);與模型組比較,穩(wěn)心顆粒低劑量組、穩(wěn)心顆粒高劑量組、美托洛爾組LVAWs、LVAWd、LVEF升高,LVIDs、LVIDd降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。詳見表1。

    表1 各組大鼠超聲心動圖指標(biāo)比較(±s)

    2.2 各組大鼠心室顫動閾值比較 模型組大鼠心室顫動閾值明顯低于正常組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);與模型組比較,穩(wěn)心顆粒低劑量組、穩(wěn)心顆粒高劑量組、美托洛爾組心室顫動閾值增高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。詳見表2。

    表2 各組大鼠心室顫動閾值比較(±s) 單位:V

    2.3 各組大鼠心臟組織病理學(xué)改變比較 HE染色顯示,正常組大鼠心肌纖維呈長條狀排列整齊有序,心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰完整,細(xì)胞質(zhì)均勻紅染,細(xì)胞核形態(tài)正常。模型組大鼠心肌纖維呈波浪狀或斷裂溶解,心肌細(xì)胞排列紊亂,結(jié)構(gòu)模糊不清,細(xì)胞核固縮,形態(tài)異常;與模型組比較,穩(wěn)心顆粒低劑量組、穩(wěn)心顆粒高劑量組、美托洛爾組心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)明顯改善,病理改變明顯減輕。詳見圖1。

    圖1 各組大鼠心肌組織病理改變HE染色圖( ×400)

    2.4 各組大鼠心肌LC3、Beclin1、CX43蛋白表達(dá)比較 與正常組比較,模型組LC3、Beclin1蛋白AOD明顯增加,CX43蛋白AOD明顯降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);與模型組比較,穩(wěn)心顆粒高劑量組、美托洛爾組自噬正相關(guān)蛋白LC3、Beclinn1 AOD均明顯降低,CX43蛋白AOD增加,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。正常組CX43陽性表達(dá)主要分布在心肌細(xì)胞間閏盤處,呈線狀排列整齊;模型組CX43表達(dá)明顯減少,呈點(diǎn)狀分布紊亂。詳見表3、圖2。

    表3 穩(wěn)心顆粒對大鼠心肌LC3、Beclin1、CX43蛋白表達(dá)的AOD比較(±s)

    圖2 各組自噬相關(guān)蛋白及CX43表達(dá)及分布情況(免疫組織化學(xué)染色,×400)

    2.5 各組大鼠心肌細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白及縫隙連接蛋白表達(dá)比較 與正常組比較,模型組自噬正相關(guān)蛋白LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin1表達(dá)增加,自噬負(fù)相關(guān)蛋白P62及CX43蛋白表達(dá)降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與模型組比較,穩(wěn)心顆粒低劑量組Beclin1蛋白表達(dá)明顯減少,P62蛋白表達(dá)明顯升高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),穩(wěn)心顆粒高劑量組及美托洛爾組LC3Ⅱ、Beclin1蛋白表達(dá)明顯降低,P62及CX43蛋白表達(dá)明顯升高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見圖3、圖4。

    圖3 Western Blot法檢測各組大鼠自噬相關(guān)蛋白及CX43蛋白表達(dá)條帶圖

    模型組與正常組比較,* P<0.05;與模型組比較,# P<0.05。

    3 討 論

    冠心病在心血管疾病的臨床死亡原因中居首位,而心肌梗死又是冠心病中的一種嚴(yán)重疾病類型,由于心肌血液供應(yīng)減少,心肌細(xì)胞缺血缺氧壞死,心肌功能受損,心肌正常收縮及舒張功能喪失,心搏出量降低,誘發(fā)心源性猝死[12]。心臟中CX43半衰期較短,一般為1~3 h,主要位于心肌細(xì)胞閏盤處,CX43的磷酸化、數(shù)量和分布的病理性改變可使心臟電傳導(dǎo)障礙,最終發(fā)生心律失常[13]。

    基礎(chǔ)水平的自噬在缺血性心肌病、心力衰竭和心肌肥厚期間可明顯上調(diào),保護(hù)心臟,然而過度激活的自噬則可導(dǎo)致大量細(xì)胞器的降解和細(xì)胞死亡[14]。臨床觀察到在心肌梗死病人的壞死心肌組織中,自噬正相關(guān)蛋白LC3Ⅱ、Beclin1表達(dá)有所增加,表明在心肌梗死的發(fā)生發(fā)展進(jìn)程中,自噬可能被激活[15]。自噬參與縫隙連接蛋白的降解,一方面可以為心肌細(xì)胞內(nèi)縫隙連接蛋白的更新提供基礎(chǔ),另一方面則成為心血管疾病的內(nèi)在發(fā)病機(jī)制[16]。超微結(jié)構(gòu)在自噬體內(nèi)部觀察到球狀縫隙鏈接體,自噬相關(guān)基因(如LC3、P62、Atg6)的遺傳沉默導(dǎo)致環(huán)狀縫隙鏈接的積累和LC3與CX43的共定位減少[17]。因此,推測心肌梗死后心律失常病理?xiàng)l件下,縫隙連接蛋白表達(dá)的變化與心肌細(xì)胞自噬水平相關(guān)。

    中藥穩(wěn)心顆粒由黃精、三七、黨參、琥珀、甘松5味中藥組成,循證研究發(fā)現(xiàn)穩(wěn)心顆粒對于多種病因引起的心律失常均有明顯的治療效果,能快速緩解癥狀,改善病人生活質(zhì)量[18]。穩(wěn)心顆??烧{(diào)控CX43的表達(dá)分布,改善心律失常[7]。探索穩(wěn)心顆粒改善縫隙連接蛋白表達(dá)與自噬水平的變化,有助于為心肌梗死后心律失常的治療提供新的方向。

    本研究結(jié)果顯示,建立模型4周后,模型組大鼠左心室前壁變薄,室內(nèi)徑增大,左室射血分?jǐn)?shù)明顯降低,心臟結(jié)構(gòu)和功能改變,心肌細(xì)胞形態(tài)紊亂,以上病理改變?yōu)樾募」K篮笮穆墒С5陌l(fā)生提供了條件;此外,本研究還觀察到心肌組織CX43表達(dá)及分布的異常,與心肌梗死后大鼠發(fā)生心律失常的結(jié)局直接相關(guān)。已有研究證實(shí),心肌梗死后心肌細(xì)胞CX43分布以及表達(dá)量的異常,使得由縫隙連接蛋白構(gòu)成的縫隙連接通道關(guān)閉,導(dǎo)致心肌電傳導(dǎo)障礙從而誘發(fā)心律失常[19],這與本研究中模型組大鼠心室顫動閾值明顯降低、心律失常易感性明顯增加的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致。

    本研究進(jìn)一步深入觀察發(fā)現(xiàn),心肌梗死病理?xiàng)l件下,LC3、Beclin1明顯增加,P62明顯減少;LC3是自噬標(biāo)志蛋白,其C端被半胱氨酸蛋白酶ATG4B切割后形成LC3Ⅰ,LC3Ⅰ與磷脂酰乙醇胺(PE)結(jié)合形成LC3Ⅱ,參與自噬體膜的延伸,因此,LC3Ⅱ表達(dá)量增加時,表明自噬被激活;Beclin1作為自噬特異性蛋白,可調(diào)節(jié)自噬體形成,Beclin1基因活性的明顯上調(diào)表明自噬激活;P62是一種具有多種結(jié)構(gòu)域的自噬底物蛋白,通過其C端的LC3互相作用區(qū)(LIR)與LC3結(jié)合,聚集待降解的蛋白,在蛋白積累過程中,P62表達(dá)增加,隨著自噬溶酶體酶解反應(yīng)的開始,P62表達(dá)降低[20-22]。以上結(jié)果表明心肌梗死后4周模型組大鼠心臟自噬水平過度激活。而自噬參與了縫隙連接蛋白的降解過程[23]。因此,本研究推測心肌梗死后自噬的過度激活介導(dǎo)了CX43經(jīng)自噬途徑降解的增加,這是導(dǎo)致心肌梗死后心律失常不容忽視的潛在機(jī)制。而穩(wěn)心顆粒治療4周后,與模型組比較,心臟結(jié)構(gòu)和功能得到明顯改善,心律失常易感性降低,心肌過度自噬得以減輕,CX43表達(dá)在一定程度上恢復(fù),這是穩(wěn)心顆粒防治心肌梗死后心律失常的新機(jī)制。

    綜上所述,穩(wěn)心顆粒可以調(diào)節(jié)梗死心肌細(xì)胞過度激活的自噬水平,保護(hù)CX43表達(dá),預(yù)防心肌梗死后心律失常的發(fā)生,為臨床應(yīng)用穩(wěn)心顆粒防治心肌梗死后心律失常提供實(shí)驗(yàn)證據(jù)。

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