激光增材制造骨科用NiTi形狀記憶合金的細(xì)胞毒性與生物相容性研究

孫浚源，張煜宸，王連雷，王協(xié)彬，劉新宇

鈦合金具有良好的生物相容性、耐腐蝕性及抗疲勞性，在骨科疾病的診斷、治療等方面應(yīng)用廣泛，已經(jīng)成為骨科領(lǐng)域最為常用的金屬材料之一[1]。但作為骨科常用的植入物材料，鈦合金仍存在諸多不足，如彈性模量過(guò)高，容易產(chǎn)生應(yīng)力屏蔽效應(yīng)，生物力學(xué)性能曲線與骨骼相差較大，表面耐磨性能較差，且Ti6Al4V 等傳統(tǒng)鈦合金中所含的鋁、釩等元素對(duì)人體存在著潛在的危害性[2-3]。因此，仍需開(kāi)發(fā)與人體骨骼生物力學(xué)性能更為相似，且具備低細(xì)胞毒性與良好的生物相容性的生物應(yīng)用材料以滿足臨床應(yīng)用需求。

鎳鈦（NiTi）合金表現(xiàn)有形狀記憶效應(yīng)和超彈性，在合適的外界刺激下可以恢復(fù)其預(yù)設(shè)的形狀，是集感知（溫度、載荷、應(yīng)變）與驅(qū)動(dòng)（輸出力與變形）于一體的智能材料。NiTi 合金還表現(xiàn)有良好的生物相容性、低彈性模量（25～90 GPa）、優(yōu)良的力學(xué)性能、應(yīng)力-應(yīng)變特性與人體骨骼類似等特點(diǎn)，是一種極具應(yīng)用前景的骨植入材料[4-6]。目前已研發(fā)出以NiTi 合金為材料的骨科植入物，如應(yīng)用于脊柱外科的NiTi 椎間融合器[7]、NiTi 內(nèi)固定棒[8]，應(yīng)用于關(guān)節(jié)畸形矯正的NiTi 夾板等[9]。然而，NiTi 合金表現(xiàn)有加工硬化能力強(qiáng)、焊接性能差等特點(diǎn)，使其成形加工非常困難[10]。除此之外，醫(yī)用NiTi 合金器件一般由絲、板、管等加工而成，通常結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、功能單一，嚴(yán)重限制了其作為骨植入材料的應(yīng)用和推廣。

增材制造或3D 打印是基于“離散-堆積”的原理，依據(jù)預(yù)先設(shè)定的三維模型，通過(guò)“分層制造-逐層累積”方式成形所需構(gòu)件的一種加工技術(shù)。激光粉末床熔融（laser powder bed fusion,LPBF）作為一種增材制造技術(shù)，除了能夠根據(jù)三維計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)（computer aided design,CAD）模型直接成形復(fù)雜構(gòu)件外，還能提供較高的成形精度及表面質(zhì)量，是制備復(fù)雜骨植入物的理想手段[11-12]。目前，LPBF 制備的鈦合金、鉭金屬等多孔結(jié)構(gòu)已在臨床有較多應(yīng)用[13-15]。然而，增材制造NiTi合金植入物的研究尚在起步階段。

本研究團(tuán)隊(duì)前期開(kāi)展了LPBF 制備NiTi 合金的基礎(chǔ)研究，發(fā)現(xiàn)LPBF 不僅能夠作為一種成形工藝加工復(fù)雜NiTi 合金構(gòu)件，同時(shí)也可作為一種物理化學(xué)冶金手段來(lái)調(diào)控NiTi 合金的相變溫度及功能特性，使其在彈性模量、生物力學(xué)曲線等方面與人體骨骼更為相似[16]，為制備新型NiTi 合金植入體奠定了基礎(chǔ)。然而，盡管已有研究證明NiTi 合金具備良好的生物相容性，但增材制造NiTi 合金與傳統(tǒng)NiTi 合金具備不同顯微組織及表面形貌，而目前尚缺乏對(duì)增材制造NiTi 合金生物性能的研究。因此，本研究計(jì)劃對(duì)增材制造NiTi 形狀記憶合金的細(xì)胞毒性、生物相容性進(jìn)行研究，同時(shí)檢測(cè)其對(duì)血管生成及細(xì)胞結(jié)構(gòu)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與化學(xué)藥品

CCK-8 試劑盒、Calcein/PI 細(xì)胞活性與細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒、Actin-Tracker Green（微絲綠色熒光探針）由Beyotime（中國(guó)）提供，Matrigel matrix（基質(zhì)膠）由Counting（USA）提供。胎牛血清和細(xì)胞培養(yǎng)試劑由Gibico（中國(guó)）提供。本研究采用由深圳微納增材技術(shù)有限公司生產(chǎn)的NiTi 二元形狀記憶合金球形粉末，成分為Ti-50.6at.%Ni（原子分?jǐn)?shù)）。粉末粒徑范圍為15～53 μm，D50=33.8 μm。

1.2 3D打印NiTi形狀記憶合金

利用LPBF 工藝成形NiTi 合金支架。增材制造設(shè)備為英國(guó)Renishaw 公司生產(chǎn)的RenAM 500E 激光粉末床熔融系統(tǒng)，配有500 W 光纖激光器，激光光斑直徑為80 μm。為了降低成形過(guò)程中氧等雜質(zhì)元素對(duì)材料性能的影響，采取如下措施：首先，對(duì)成形倉(cāng)抽真空至-900 mbar（1 bar=100 kPa），然后充入高純氬氣（＞99.999%），并重復(fù)此過(guò)程3 次；其次，在成形過(guò)程中保持成形倉(cāng)中氬氣壓力略高于外界壓力（約20 mbar）。上述措施可以保證激光開(kāi)啟前成形倉(cāng)中氧含量低于20 ppm。

本研究設(shè)計(jì)了如圖1所示的NiTi合金支架結(jié)構(gòu)，整體尺寸為10.0 mm×10.0 mm×1.5 mm，點(diǎn)陣單元為1.0 mm×1.0 mm×1.0 mm 的體心立方結(jié)構(gòu)（bodycentered cubic,BCC）。成形NiTi 合金支架所采用的工藝參數(shù)為：激光功率140 W，掃描速度800 mm/s，掃描間距80 μm，鋪粉層厚30 μm。選用條帶掃描策略，條帶寬度為5 mm，層間旋轉(zhuǎn)角67°。利用COXEM EM-30+掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope,SEM）觀察NiTi合金支架形貌。

圖1 本研究設(shè)計(jì)的NiTi合金支架結(jié)構(gòu)示意圖

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

小鼠成骨細(xì)胞前體細(xì)胞（MC-3T3-E1 細(xì)胞）和人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelial cell,HUVEC）的培養(yǎng)方案按照既往研究操作[17-18]。將MC-3T3-E1 細(xì)胞種植到α-MEM 培養(yǎng)基（Gibco，添加10%胎牛血清、100 U/ml 青霉素和100 μg/ml 鏈霉素），于37℃、5% CO2的加濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2 日傳代1 次。HUVEC 種植到ECM 培養(yǎng)基（Gibco，添加10%胎牛血清、100 U/ml 青霉素和100 μg/ml 鏈霉素），于37℃、5% CO2的加濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2 日傳代1次。

1.4 金屬浸出液及細(xì)胞用金屬支架的獲取

每組3 個(gè)金屬樣品在121℃下高壓滅菌30 min。然后將每一個(gè)樣品放置于盛有15 ml 細(xì)胞培養(yǎng)基的離心管中[19]。在37℃條件下，以240 rpm 的速度持續(xù)離心攪拌7 d[20]。提取的浸出液制備含100%、50%、10%浸出液的稀釋液（選擇α-MEM 完全培養(yǎng)基和ECM完全培養(yǎng)基進(jìn)行稀釋）。

1.5 細(xì)胞的處理方式和分組

M3T3-E1 細(xì)胞和HUVEC 隨機(jī)分為4 個(gè)組：對(duì)照組（使用正常培養(yǎng)基），10%浸出液組（培養(yǎng)基為10%浸出液，90%正常培養(yǎng)基），50%浸出液組（培養(yǎng)基為50%浸出液，50%正常培養(yǎng)基），100%浸出液組（培養(yǎng)基為100%浸出液）。

1.6 細(xì)胞活力和細(xì)胞凋亡能力的評(píng)估

將指數(shù)生長(zhǎng)期的MC3T3-E1 細(xì)胞以1×105個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種于6孔板中，孵育24 h。在給定上述各種處理后，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞孵育24 h，用于以下檢測(cè)。使用CCK-8 試劑盒檢測(cè)細(xì)胞毒性，同時(shí)依照下面的公式計(jì)算不同濃度金屬浸出液作用下的MC3T3-E1細(xì)胞的存活率：

采用Calcein/PI細(xì)胞活性與細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒進(jìn)行活/死細(xì)胞檢測(cè)。使用熒光顯微鏡（Andor，英國(guó)）拍攝圖像。使用Image J軟件進(jìn)行熒光定量分析。

1.7 細(xì)胞成血管能力的評(píng)估

將液體狀態(tài)的基質(zhì)膠按照每孔50 μl加入預(yù)冷的96 孔板中，放于37℃細(xì)胞孵箱30 min，待其凝固將指數(shù)生長(zhǎng)期的HUEVC 以每孔5×103接種于96 孔板中，按照上述細(xì)胞分組加入不同的培養(yǎng)基，于5 h 后計(jì)算每孔生成管腔的數(shù)目。

1.8 細(xì)胞生物相容性的評(píng)估

將增材制造的NiTi 形狀記憶合金細(xì)胞支架置于6 孔板中，按照每孔1×105個(gè)細(xì)胞將細(xì)胞接種于孔中共同孵育24 h、48 h 和72 h 后使用Calcein/PI 細(xì)胞活性與細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒進(jìn)行熒光染色，觀察細(xì)胞形態(tài)。

1.9 NiTi形狀記憶合金對(duì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)的影響

將增材制造的NiTi 形狀記憶合金細(xì)胞支架置于6 孔板中，按照每孔2×105個(gè)細(xì)胞將MC3T3-E1 細(xì)胞接種于孔中，共同孵育72 h 后使用胰酶消化液消化后按照1×105進(jìn)行種板，同時(shí)將正常培養(yǎng)條件下的MC3T3-E1 細(xì)胞按照同樣的細(xì)胞量進(jìn)行種板，待二者細(xì)胞貼壁后，使用Actin-Tracker Green 進(jìn)行熒光染色，使用Image J 軟件與正常培養(yǎng)條件下的細(xì)胞Actin-Tracker Green染色進(jìn)行熒光定量分析。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 26.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用單因素方差分析細(xì)胞活力和細(xì)胞凋亡能力的實(shí)驗(yàn)結(jié)果和細(xì)胞成血管能力的實(shí)驗(yàn)評(píng)估結(jié)果；采用t檢驗(yàn)分析NiTi形狀記憶合金對(duì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)影響的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NiTi形狀記憶合金點(diǎn)陣結(jié)構(gòu)

圖2 給出了NiTi 合金點(diǎn)陣結(jié)構(gòu)的SEM 圖像，其中圖2A-C 的觀察方向與打印方向平行，即點(diǎn)陣結(jié)構(gòu)的側(cè)面，圖2D-F 為點(diǎn)陣結(jié)構(gòu)的頂面。圖2 顯示點(diǎn)陣單元的形狀為規(guī)則的矩形，與設(shè)計(jì)的體心立方結(jié)構(gòu)相符。設(shè)計(jì)的棱柱尺寸為150 μm，而通過(guò)SEM 觀察，實(shí)際棱柱尺寸大于200 μm?？梢杂^察到支架側(cè)面黏附較多未熔NiTi 粉末（圖2B），支架側(cè)面棱柱結(jié)合處存在少量裂紋（圖2C），支架的頂面吸附粉末相對(duì)較少（圖2E），支架展現(xiàn)出明顯的臺(tái)階效應(yīng)（圖2F）。

圖2 激光粉末床熔融制備的NiTi合金點(diǎn)陣結(jié)構(gòu)的掃描電子顯微鏡下圖像

2.2 NiTi形狀記憶合金不抑制細(xì)胞生長(zhǎng)

CCK-8結(jié)果顯示，在加入金屬浸出液1 d、3 d、7 d后，不同濃度的浸泡液組與對(duì)照組比較，細(xì)胞活力差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，圖3）。Calcein/PI 細(xì)胞活性與細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒能夠使活細(xì)胞帶綠色熒光，使凋亡的細(xì)胞帶紅色熒光。圖4 所示，不同濃度的金屬浸出液處理后的細(xì)胞沒(méi)有明顯的紅色熒光，說(shuō)明金屬浸出液不具備生物毒性。

圖3 CCK-8結(jié)果顯示不同濃度金屬浸出液不同處理時(shí)間下的細(xì)胞活力

圖4 不同濃度金屬浸出液處理下的細(xì)胞Calcein/PI染色

2.3 NiTi形狀記憶合金不影響血管的生成

用于制造骨植入體的NiTi 形狀記憶合金的金屬浸出液對(duì)血管生成沒(méi)有負(fù)面作用。不同濃度的金屬浸出液處理下，血管生成未受影響，也沒(méi)有出現(xiàn)管腔的崩解現(xiàn)象（圖5）。各組管腔平均分支數(shù)如下：對(duì)照組57.67±4.78，10% 浸泡液組54.67±4.92，50%浸泡液組57.33±10.92，100%浸泡液組56.67±4.98。各個(gè)組間管腔平均分支數(shù)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖5 不同濃度金屬浸出液處理5 h后的血管生成光鏡圖

2.4 NiTi形狀記憶合金的生物相容性

NiTi 形狀記憶合金具有良好的細(xì)胞黏附性。將MC3T3-E1 細(xì)胞與NiTi 形狀記憶合金樣品共孵育后使用熒光顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)。24 h 時(shí)細(xì)胞已經(jīng)開(kāi)始黏附于NiTi記憶合金表面；48 h后可見(jiàn)細(xì)胞已經(jīng)開(kāi)始長(zhǎng)入NiTi形狀記憶合金樣品的孔隙；72 h后細(xì)胞已經(jīng)完全長(zhǎng)入合金樣品的孔隙，說(shuō)明NiTi 形狀記憶合金有很好的生物相容性，可以為成骨細(xì)胞搭建良好的生物平臺(tái)（圖6）。

圖6 使用Calcein/PI細(xì)胞活性與細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒對(duì)與NiTi形狀記憶合金共孵育的MC3T3-E1細(xì)胞染色

2.5 NiTi形狀記憶合金可以增強(qiáng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)強(qiáng)度

細(xì)胞的結(jié)構(gòu)強(qiáng)度主要由細(xì)胞內(nèi)微絲含量決定，微絲含量越高，細(xì)胞具有越強(qiáng)的結(jié)構(gòu)強(qiáng)度。金屬樣品組細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度為56.69%±6.95%，顯著大于對(duì)照組（36.37%±6.88%，P＜0.05，圖7），說(shuō)明金屬樣品組中細(xì)胞的微絲含量大于對(duì)照組，將細(xì)胞接種于NiTi 形狀記憶合金后，會(huì)獲得更強(qiáng)的細(xì)胞結(jié)構(gòu)強(qiáng)度。

圖7 細(xì)胞Actin-Tracker Green染色熒光圖

3 討論

NiTi 形狀記憶合金因具有優(yōu)良的機(jī)械和生物性能，獨(dú)特的形狀記憶效應(yīng)和超彈性，在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用[21]。但因?yàn)閭鹘y(tǒng)的NiTi 形狀記憶合金存在加工成形困難、彈性模量較人體骨骼仍較高等缺陷，在骨科領(lǐng)域的應(yīng)用受到限制[22]。而激光增材制造技術(shù)基于CAD 數(shù)據(jù)，通過(guò)逐層累積的方法可以對(duì)NiTi 合金粉末材料進(jìn)行加工，既而制造復(fù)雜的結(jié)構(gòu)，為骨科植入物提供新的創(chuàng)新材料[23]。Bartolomeu等[24]研究發(fā)現(xiàn)，可將激光增材制造NiTi合金彈性模量的最小值調(diào)控至3 GPa左右，達(dá)到人體松質(zhì)骨相近的彈性模量。

但目前針對(duì)增材制造NiTi 合金細(xì)胞毒性和生物相容性的研究較少，Habijan 等[25]通過(guò)細(xì)胞與金屬樣品共培養(yǎng)后活死染色的方式證明了人類間充質(zhì)干細(xì)胞可以在樣品上生長(zhǎng)。本研究更為全面地通過(guò)CCK-8試劑盒與Calcein/PI細(xì)胞活性與細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒檢測(cè)了增材制造NiTi 合金的生物毒性與細(xì)胞活性，通過(guò)血管生成實(shí)驗(yàn)與細(xì)胞內(nèi)微絲含量測(cè)定檢測(cè)增材制造NiTi合金對(duì)細(xì)胞功能與結(jié)構(gòu)的影響。

通過(guò)SEM 對(duì)增材制造NiTi金屬支架進(jìn)行觀察時(shí)發(fā)現(xiàn)實(shí)際棱柱尺寸大于預(yù)設(shè)計(jì)棱柱尺寸，這可能是由于LPBF 過(guò)程中，熔池不斷吸收周圍粉末，使棱柱尺寸增加，導(dǎo)致實(shí)際孔隙率比設(shè)計(jì)的孔隙率低。除此之外，研究人員還觀察到未熔的NiTi 粉末與裂紋的產(chǎn)生，這分別可能是由于處在熔池邊界的粉末顆粒部分熔化，凝固后附著在支架表面，及快速冷卻過(guò)程中產(chǎn)生較高熱應(yīng)力，在棱柱結(jié)合處應(yīng)力集中更明顯，導(dǎo)致裂紋產(chǎn)生。除此之外，本研究還觀察到明顯的臺(tái)階效應(yīng)，這主要是由增材制造的分層加工特點(diǎn)引起的。表面未熔粉末、裂紋及臺(tái)階效應(yīng)都會(huì)影響NiTi合金支架表面質(zhì)量及鎳離子析出行為，影響其生物性能。

既往研究在增材制造NiTi 合金的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)鎳離子的釋放[25]。本研究發(fā)現(xiàn)增材制造NiTi 合金支架中存在未熔的NiTi 粉末顆粒，這會(huì)導(dǎo)致支架表面積增加，影響鎳離子釋放由于釋放的鎳離子濃度會(huì)對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)產(chǎn)生影響，本研究選取了不同濃度的金屬浸出液，以更為全面地評(píng)估鎳離子濃度的影響。

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，MC3T3-E1 細(xì)胞和HUEVC 被廣泛應(yīng)用于醫(yī)用植入物[17-18]，本研究選取這兩類細(xì)胞進(jìn)行NiTi 形狀記憶合金制作骨外科植入體的體外實(shí)驗(yàn)。CCK-8 實(shí)驗(yàn)測(cè)定細(xì)胞于NiTi 形狀記憶性合金的生物毒性，Calcein/PI 細(xì)胞活性與細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞活性，說(shuō)明增材制造的NiTi 形狀記憶合金作為植入體，可以滿足極低的生物毒性。

植骨的成功與否很大程度上取決于血運(yùn)[26]。血管形成實(shí)驗(yàn)（tube formation assay）[27]是體外研究血管生成的經(jīng)典方法，該方法可快速確定參與血管生成的各種因素。HUVEC 具有干細(xì)胞的潛能，理論上可以傳代50～60次，因此被選用于此次實(shí)驗(yàn)。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可得，增材制造NiTi 形狀記憶合金對(duì)血管生成沒(méi)有任何負(fù)面影響，同時(shí)作為金屬植入物，可以為植骨提供一個(gè)良好的生物平臺(tái)。

本團(tuán)隊(duì)設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證NiTi 形狀記憶合金細(xì)胞支架可以為小鼠成骨細(xì)胞前體細(xì)胞提供一個(gè)良好的附著平臺(tái)[28]，具有極高的生物相容性，同時(shí)使用微絲綠熒光探針進(jìn)行標(biāo)記附著與NiTi 形狀記憶合金細(xì)胞支架和自由溶脹細(xì)胞的微絲后發(fā)現(xiàn)NiTi 形狀記憶合金上消化下來(lái)的細(xì)胞具有更高的平均熒光強(qiáng)度，熒光強(qiáng)度可以反映微絲的數(shù)目，而微絲數(shù)量可以反映新生骨的強(qiáng)度，即微絲越多細(xì)胞的結(jié)構(gòu)強(qiáng)度越高。

4 結(jié)論

本研究采用激光增材制造技術(shù)，制備了NiTi 形狀記憶合金支架，并用MC3T3-E1 細(xì)胞和HUEVC 證明了增材制造NiTi 合金具備較低的細(xì)胞毒性、良好的生物相容性，并可以通過(guò)增加細(xì)胞內(nèi)微絲含量增強(qiáng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)。本研究較為全面地證明了增材制造NiTi 合金可以安全地在體內(nèi)應(yīng)用，為增材制造NiTi合金在骨科植入物中的應(yīng)用提供基礎(chǔ)。

【利益沖突】所有作者均聲明不存在利益沖突