響應(yīng)面法優(yōu)化釀酒酵母發(fā)酵產(chǎn)谷胱甘肽工藝

林偉鈴 朱宏陽 李泳寧

林偉鈴，朱宏陽，李泳寧.響應(yīng)面法優(yōu)化釀酒酵母發(fā)酵產(chǎn)谷胱甘肽工藝［J］.福建農(nóng)業(yè)科技，2023，54（12）：27-34.

收稿日期：2023-11-10

作者簡介：林偉鈴，女，1984年生，碩士，實驗師，主要從事微生物在生產(chǎn)中的應(yīng)用研究。

*通信作者：朱宏陽，男，1979年生，博士，副教授，主要從事微生物在生產(chǎn)中的應(yīng)用研究（E-mail：zhuhongyang@fjwzy.cn）。

基金項目：福建省自然科學(xué)基金項目（2022J01394），福建省衛(wèi)健委青年基金項目（2019-1-97）。

摘? 要：為了探索釀酒酵母發(fā)酵生產(chǎn)谷胱甘肽（Glutathione，GSH）的最佳工藝條件。在單因素試驗基礎(chǔ)上，通過Plackett-Burman試驗結(jié)合響應(yīng)面設(shè)計方法對液體發(fā)酵培養(yǎng)基進行優(yōu)化。結(jié)果表明：釀酒酵母發(fā)酵生產(chǎn)GSH的最優(yōu)培養(yǎng)基配方為葡萄糖71 g·L-1、酵母膏4 g·L-1、NH4Cl 6 g·L-1、KH2PO4 2.0 g·L-1、MgSO4 0.5 g·L-1，pH 6.0，在此條件下，GSH理論產(chǎn)量達(dá)79.51 mg·L-1。經(jīng)3批次平行試驗驗證，GSH實際產(chǎn)量均值為80.5 mg·L-1，與預(yù)測值相近，較優(yōu)化前產(chǎn)量（65.03 mg·L-1）提高了約19.2%。

關(guān)鍵詞： 釀酒酵母； 谷胱甘肽; Plackett-Burman設(shè)計； 響應(yīng)面分析； 優(yōu)化

中圖分類號：TQ 921? ???文獻標(biāo)志碼：A? ???文章編號：0253-2301（2023）12-0027-08

DOI： 10.13651/j.cnki.fjnykj.2023.12.004

Technology Optimization for the Production of Glutathione Fermented by Saccharomyces cerevisiae

LIN Wei-ling， ZHU Hong-yang*， LI Yong-ning

（Department of Pharmacy， Fujian Health College， Fuzhou， Fujian 350101， China）

Abstract： In order to explore the optimal technological conditions for the production of glutathione （GSH） fermented by Saccharomyces cerevisiae， based on the single factor experiment， the liquid fermentation medium was optimized through Plackett-Burman design experiment combined with the response surface methodology. The results showed that the optimal culture medium for the production of GSH fermented by Saccharomyces cerevisiae was as follows： glucose of 71 g·L-1， yeast extract paste of 4 g·L-1， NH4Cl of 6 g·L-1， KH2PO4 of 2.0 g·L-1， MgSO4 of 0.5 g·L-1， pH of 6.0. After three batches of parallel experiments， the mean value for the actual yield of GSH was 80.5 mg·L-1， which was similar to the predicted value and increased by about 19.2% higher than that before optimization （65.03 mg·L-1）.

Key words： Saccharomyces cerevisiae； Glutathione； Plackett-Burman design； Response Surface analysis； Optimization

谷胱甘肽（Glutathione，簡稱GSH）是普遍存在于細(xì)胞中的一種含巰基的功能活性三肽，由L-谷氨酸、L-半胱氨酸和L-甘氨酸縮合而成，是真核細(xì)胞中小肽類巰基化合物的重要組成部分［1］。GSH在細(xì)胞內(nèi)存在還原型及氧化型兩種形式，還原型GSH是生物細(xì)胞抵抗氧化損傷的關(guān)鍵，有著多種重要的生理功能［2］。GSH具有增強機體免疫、抗氧化、解毒、提高動物生殖能力等功效，被廣泛應(yīng)用于農(nóng)作物種植、畜禽水產(chǎn)養(yǎng)殖、食品及醫(yī)藥等領(lǐng)域［3-6］，具有良好的市場前景。研究發(fā)現(xiàn)，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中使用GSH灌溉澆種可以提高農(nóng)作物對鉛、砷、鎘、微塑料以及鹽堿的耐受性［7-11］。此外，在食品應(yīng)用領(lǐng)域，Tang等［12］的研究發(fā)現(xiàn)GSH可以通過氫鍵與淀粉相互作用，加速淀粉顆粒的膨脹，促進有序雙螺旋結(jié)晶的形成，從而抑制淀粉的消化，可應(yīng)用于減肥食品。

目前，直接萃取法、化學(xué)合成法、酶法與微生物發(fā)酵法是生產(chǎn)GSH主要方法［5］。其中，微生物發(fā)酵法具備生產(chǎn)效率高、成本低、污染少等特點，是目前生產(chǎn)GSH的主要方法［13］。在產(chǎn)GSH微生物中，釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae因其在廉價原料培養(yǎng)基中生長迅速，且具有在細(xì)胞中積累高含量GSH的潛力而脫穎而出［14］。此外，釀酒酵母是FDA規(guī)定的無害食品添加劑，屬于一般公認(rèn)的安全類添加劑，適合用于GSH的商業(yè)化生產(chǎn)［15］。自1970年開始，日本協(xié)和發(fā)酵生物株式會社（Kyowa Hakko Bio）用酵母發(fā)酵生產(chǎn)GSH，目前占據(jù)我國GSH市場供應(yīng)的主要份額。國內(nèi)GSH生產(chǎn)還停留在工廠實驗階段或生產(chǎn)起步階段，制約國內(nèi)生產(chǎn)GSH的主要原因是生產(chǎn)水平較低、提取率低下。因此如何提高GSH生產(chǎn)效率、降低生產(chǎn)成本、提高競爭力，對于實現(xiàn)GSH自主生產(chǎn)、打破外國企業(yè)的壟斷具有非常重要的意義。本研究對前期篩選獲得的具有GSH生產(chǎn)能力的菌株Saccharomyces cerevisiae ZF-11進行發(fā)酵條件優(yōu)化，旨在提升GSH產(chǎn)量，為大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)GSH提供依據(jù)。

1? 材料與方法

1.1 ??菌株

釀酒酵母S.cerevisiae ZF-11，由本實驗室篩選并保藏。

1.2? 試劑與培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基與菌種活化培養(yǎng)基：葡萄糖30 g·L-1、酵母膏3 g·L-1、蛋白胨3 g·L-1、牛肉膏3 g·L-1、瓊脂粉20 g·L-1，pH 6.0，121℃滅菌20 min。種子培養(yǎng)基：葡萄糖30 g·L-1、酵母膏3 g·L-1、蛋白胨3 g·L-1、牛肉膏3 g·L-1，pH 6.0，121℃滅菌20 min?；A(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖50 g·L-1、酵母膏5

g·L-1、蛋白胨5 g·L-1、KH2PO4 2 g·L-1、MgSO40.5 g·L-1，pH 6.0，121℃滅菌20 min。

試劑：四氧嘧啶為分析純。

1.3? 主要儀器

SW-CJ-1F超凈工作臺（上海蘇凈實業(yè)有限公司）、ZQZY-88CN全溫振蕩培養(yǎng)箱（上海知楚儀器有限公司）、SPX-100-B-Z細(xì)菌生化培養(yǎng)箱（福建省科學(xué)器材中心）、SBA-40E型生物傳感儀（山東省科學(xué)院生物研究所）、SQ810C全自動高壓蒸汽滅菌器（雅馬拓）、H2-16KR臺式高速冷凍離心機（湖南可成儀器設(shè)備有限公司）、DHG-9070電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海精宏）、UV-1800型紫外可見分光光度計（上海美譜達(dá)儀器有限公司）。

1.4? 試驗方法

1.4.1? 種子液制備? 將斜面保藏的菌種接入活化培養(yǎng)平板，28℃條件下于細(xì)菌生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，從活化平板上挑取一環(huán)菌接入裝有種子培養(yǎng)基的三角瓶中，28℃、220 r·min-1振蕩培養(yǎng)24 h。

1.4.2? 發(fā)酵條件? 將種子液以10%接種量接入到發(fā)酵培養(yǎng)基中，28℃、220 r·min-1振蕩培養(yǎng)72 h。

1.4.3? 菌體濃度的測定? 取25 mL發(fā)酵培養(yǎng)液，5000 r·min-1離心10 min收集菌體，用蒸餾水重懸菌體后5000 r·min-1離心10 min收集菌體（重復(fù)3次），于電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱中70℃烘至恒重后稱重。

1.4.4? 發(fā)酵液中葡萄糖的測定? 取1 mL發(fā)酵培養(yǎng)液進行適當(dāng)稀釋后用生物傳感儀測定葡萄糖的含量。

1.4.5? GSH含量的測定［16］? 取25 mL發(fā)酵培養(yǎng)液，5000 r·min-1離心10 min收集菌體，用蒸餾水重懸菌體后于-20℃冷凍過夜，沸水浴5 min，

5000 r·min-1離心10 min，取上清液，采用四氧嘧啶法測定GSH含量。

1.4.6? 單因素試驗? （1）不同碳源對釀酒酵母發(fā)酵產(chǎn)GSH的影響。發(fā)酵培養(yǎng)基中的碳源分別為葡萄糖、果糖、蔗糖、麥芽糖、木糖，碳源加入量為5%，其余成分與基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基一致，進行發(fā)酵試驗，考察不同碳源對釀酒酵母菌體生長和產(chǎn)GSH的影響。（2）葡萄糖濃度對釀酒酵母發(fā)酵產(chǎn)GSH的影響。以葡萄糖為碳源，濃度分別40、50、 60、70、80、90、100 g·L-1，其余成分與基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基一致，進行發(fā)酵試驗，考察釀酒酵母菌體生長和產(chǎn)GSH的最佳葡萄糖濃度。（3）不同氮源對釀酒酵母發(fā)酵產(chǎn)GSH的影響。以70 g·L-1葡萄糖作為碳源，氮源分別為酵母膏、牛肉膏、蛋白胨、尿素、NH4Cl、（NH4）2SO4，氮源添加量為1%，其余成分與基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基一致，進行發(fā)酵試驗，考察不同氮源對釀酒酵母菌體生長和產(chǎn)GSH的影響。（4）復(fù)合氮源對釀酒酵母發(fā)酵產(chǎn)GSH的影響。以70

g·L-1葡萄糖作為碳源，酵母膏分別與尿素、NH4Cl、（NH4）2SO4以1∶1的量復(fù)配作為氮源，總氮源添加量為1%，其余成分與基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基一致，進行發(fā)酵試驗，考察不同的有機氮源與無機氮源復(fù)配組合對釀酒酵母菌體生長和產(chǎn)GSH的影響。（5）復(fù)合氮源酵母膏與NH4Cl配比對釀酒酵母發(fā)酵產(chǎn)GSH的影響。以70 g·L-1葡萄糖作為碳源，調(diào)整酵母膏與NH4Cl的配比，分別為4∶1、3∶1、3∶2、1∶1、2∶3、1∶3、1∶4，總氮源添加量為1%，其余成分與基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基一致，進行發(fā)酵試驗，考察復(fù)合氮源酵母膏與NH4Cl的不同配比對釀酒酵母菌體生長和產(chǎn)GSH的影響。

1.4.7? Plackett-Burman試驗設(shè)計? 在單因素試驗基礎(chǔ)上，采用Plackett-Burman（PB）試驗設(shè)計［17］對影響釀酒酵母菌體濃度和產(chǎn)GSH的6個因素的顯著性進行評估，這6個因素分別為：葡萄糖、酵母膏、NH4Cl、KH2PO4、MgSO4、溫度。Plackett-Burman試驗的因素及水平見表1。

1.4.8? 響應(yīng)面試驗設(shè)計? 根據(jù)Plackett-Burman試驗結(jié)果，選取3個影響菌體濃度和產(chǎn)GSH的關(guān)鍵因素，分別是葡萄糖、酵母膏、NH4Cl。根據(jù)三因素五水平的中心組合設(shè)計試驗原理，以葡萄糖（X1）、酵母膏（X2）、NH4Cl（X3）為自變量，以酵母菌體濃度及GSH產(chǎn)量為響應(yīng)值，設(shè)計中心組合試驗，各因素的試驗水平及編碼值見表2。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 單因素試驗結(jié)果

2.1.1? 不同碳源對釀酒酵母發(fā)酵產(chǎn)GSH的影響? 由圖1可知，以葡萄糖為碳源時，菌體生長良好且GSH產(chǎn)量最高，以果糖、蔗糖為碳源時，菌體生長良好且GSH產(chǎn)量較高，麥芽糖可促使菌體生長但GSH生產(chǎn)能力差，S.cerevisiae ZF-11不能利用木糖。綜合菌體濃度及GSH產(chǎn)量考慮，確定葡萄糖為最佳碳源，此時菌株菌體濃度為12.67 g·L-1，GSH產(chǎn)量為65.03

mg·L-1。

2.1.2? 碳源濃度對釀酒酵母發(fā)酵產(chǎn)GSH的影響? 由圖2可知，隨著葡萄糖濃度的提高，菌株生長逐步受到影響，當(dāng)葡萄糖濃度增至100 g·L-1時，菌株的生長受到抑制。從對菌株生長的影響來看，低碳源濃度有利于菌體生長。從GSH產(chǎn)量上看，隨著碳源濃度的升高，GSH產(chǎn)量逐步增加，當(dāng)碳源濃度升至70 g·L-1時，GSH產(chǎn)量最高（69.32 mg·L-1），而后碳源濃度繼續(xù)上升，GSH產(chǎn)量開始迅速下降。分析原因可能是高濃度的碳源抑制了菌株的生長，進而影響產(chǎn)物GSH的合成。

2.1.3? 不同氮源對釀酒酵母發(fā)酵產(chǎn)GSH的影響? 由圖3可知，以酵母膏為氮源，菌體生長良好且GSH產(chǎn)量最高；以牛肉膏和蛋白胨為氮源，菌體生長良好，但在生產(chǎn)GSH方面的表現(xiàn)不如以酵母膏為氮源；以NH4Cl、尿素和（NH4）2SO4為氮源，在菌體生長方面不如有機氮源，但對GSH生產(chǎn)具有較好的效果。所以后續(xù)試驗選擇酵母膏與無機氮源復(fù)配，進一步考察復(fù)合氮源對GSH發(fā)酵生產(chǎn)的影響。

2.1.4? 復(fù)合氮源對釀酒酵母發(fā)酵產(chǎn)GSH的影響? 由圖4可知，相比以無機氮源為唯一氮源，有機氮源酵母膏與無機氮源復(fù)配的復(fù)合氮源能夠使得菌體生長良好，同時GSH的產(chǎn)量又比以酵母膏作為唯一氮源時得到提高。其中，酵母膏和NH4Cl組成的復(fù)合氮源在發(fā)酵生產(chǎn)中GSH產(chǎn)量最高，所以后續(xù)試驗選擇酵母膏與NH4Cl復(fù)配的復(fù)合氮源。

2.1.5? 復(fù)合氮源酵母膏與NH4Cl對釀酒酵母發(fā)酵產(chǎn)GSH的影響? 由圖5可知，酵母膏和NH4Cl配比為2∶3時，GSH產(chǎn)量最高，此時產(chǎn)量為74.42

mg·L-1。

2.2? Plackett-Burman試驗結(jié)果

Plackett-Burman試驗各因素水平取值及試驗結(jié)果見表3，分析結(jié)果見表4。利用Statistica 8.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行計算和分析，該模型顯著（R2=0.99927），通過回歸系數(shù)顯著性可知葡萄糖（P=0.0235）、酵母膏（P=0.0360）、NH4Cl（P=0.0362）都在95%的概率水平上差異顯著；KH2PO4、MgSO4和溫度的P值介于0.5～0.1，屬于邊界因素，因此KH2PO4、MgSO4和溫度仍選擇初始值作為后續(xù)試驗參數(shù)。本研究選擇葡萄糖、酵母膏、NH4Cl作為影響菌體生長及GSH產(chǎn)量的關(guān)鍵影響因素。

2.3? 響應(yīng)面試驗設(shè)計結(jié)果

中心組合試驗設(shè)計及結(jié)果見表5。通過Statistica 8.0統(tǒng)計軟件對表5中試驗數(shù)據(jù)進行了二次多項式回歸擬合，獲得了S.cerevisiae ZF-11發(fā)酵生產(chǎn)GSH對葡萄糖、酵母膏、NH4Cl多元回歸方程為：

Y=3.328X1-7.907X12+0.899X2-5.090X22-0.198X3-4.984X32-1.175X1X2-0.720X1X3-1.380X2X3+79.319

該方程R2=0.899，這表明模型可以用來解釋試驗結(jié)果，對擬合方程求極值得：X1=71.03，X2= 4.03，X3=6.00，代入回歸方程得最大值Y=79.51 mg·L-1。上述回歸方程所作出的響應(yīng)曲面圖及其等高線見圖6、7、8，各因素及其交互作用對響應(yīng)值的影響結(jié)果可通過該組圖直觀反映出來。

2.4? GSH發(fā)酵生產(chǎn)最佳條件及驗證試驗

經(jīng)響應(yīng)面分析，比較回歸方程的解，為試驗操作的方便，GSH發(fā)酵生產(chǎn)最佳發(fā)酵培養(yǎng)基配方為葡萄糖71 g·L-1、酵母膏4 g·L-1、NH4Cl 6 g·L-1、KH2PO4 2 g·L-1、MgSO4 0.5 g·L-1， pH 6.0。在該條件下預(yù)測GSH產(chǎn)量為79.51 mg·L-1。在該模型處經(jīng)過3次平行試驗驗證，測得GSH產(chǎn)量均值為80.5 mg·L-1（GSH產(chǎn)量較優(yōu)化前提高19.21%），菌體濃度均值為20.3 g·L-1。此結(jié)果與預(yù)測值接近，證實了模型的有效性及存在著極大值點，能很好地預(yù)測實際發(fā)酵情況。

3? 結(jié)論與討論

本研究考察了碳源以及氮源對S.cerevisiae ZF-11發(fā)酵生產(chǎn)GSH的影響，結(jié)合Plackett-Burman試驗及響應(yīng)面分析結(jié)果表明：在碳源試驗中發(fā)現(xiàn)葡萄糖為最適碳源，氮源以酵母膏與NH4Cl配比為2

∶3時最優(yōu)。通過Plackett-Burman試驗篩選獲得葡萄糖、酵母膏及NH4Cl為顯著影響因素，利用響應(yīng)面試驗設(shè)計優(yōu)化后，獲得最佳培養(yǎng)基配方：葡萄糖71 g·L-1、酵母膏4 g·L-1、NH4Cl 6 g·L-1、KH2PO4 2.0 g·L-1、MgSO4 0.5 g·L-1，pH 6.0。在上述最佳培養(yǎng)條件下GSH產(chǎn)量可達(dá)80.5 mg·L-1，菌體濃度為20.3

g·L-1，GSH產(chǎn)量較優(yōu)化前提高19.21%。本研究證明了S.cerevisiae ZF-11具有生產(chǎn)GSH的商業(yè)價值，有助于開發(fā)更經(jīng)濟的GSH發(fā)酵生產(chǎn)工藝。

參考文獻：

［1］BINATI RL，LARINI I，SALVETTI E，et al.Glutathione production by non-Saccharomyces yeasts and its impact on winemaking：A review［J］.Food Research International，2022，156（111333）：1-11.

［2］GASMI A，NASREEN A，LENCHYK L，et al.An Update on Glutathione′s Biosynthesis，Metabolism，F(xiàn)unctions，and Medicinal Purposes［J］.Curr Med Chem，2023，10（26）：1-23.

［3］蔡友華，吳子豪，黃曉辰，等.還原型谷胱甘肽的特性、工業(yè)生產(chǎn)及在大健康行業(yè)的應(yīng)用研究進展［J］.食品與機械，2022，38（11）：1-10.

［4］楊世慧，王軍，秦永發(fā)，等.谷胱甘肽生理功能、發(fā)酵生產(chǎn)及其在動物生產(chǎn)中應(yīng)用的研究進展［J］.動物營養(yǎng)學(xué)報，2022，34（11）：6927-6935.

［5］李敏，殷述亭，遲曉丹.谷胱甘肽生產(chǎn)及在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用［J/OL］.飼料工業(yè)，1-8.［2024-01-01］.

［6］苗啟慶.谷胱甘肽的生理功能及其在食品加工中的應(yīng)用前景［J］.科技風(fēng)，2010（8）：247.

［7］AHMED S，KHAN M，SARDAR R.Glutathione primed seed improved lead-stress tolerance in Brassica rapa L.through modulation of physio-biochemical attributes and nutrient uptake［J］.Int J Phytoremediation，2023，25（12）：1614-1624.

［8］ARIANMEHR M，KARIMI N，SOURI Z.Exogenous supplementation of Sulfur （S） and Reduced Glutathione （GSH） Alleviates Arsenic Toxicity in Shoots of Isatis cappadocicaDesv and Erysimum allionii L［J］.Environ Sci Pollut Res Int，2022，29（42）：64205-64214.

［9］LI GZ，CHEN SJ，LI NY，et al.Exogenous Glutathione Alleviates Cadmium Toxicity in Wheat by Influencing the Absorption and Translocation of Cadmium［J］.Bull Environ ContamToxicol，2021，107（2）：320-326.

［10］CHEN F，AQEEL M，KHALID N，et al.Glutathione treatment suppresses the adverse effects of microplastics in rice［J］.Chemosphere，2023，322：138079.

［11］AHMED AMA，KHALID KA.Glutathione to ameliorate growth criterions and chemical constituents of geranium irrigated with salt water［J］.Heliyon，2023，9（7）：1-14.

［12］TANG YF，ZHAN WX，LI MZ，et al.Glutathione inhibited starch digestion：Structural and kinetic analysis of substrate and α-amylase［J］.Food Chemistry，2023，405（134979）：1-9.

［13］HU X，SHEN X，ZHU S，et al.Optimization of glutathione production in Saccharomyces cerevisiae HBSD-W08 using Plackett-Burman and central composite rotatable designs［J］.BMC Microbiol，2023，23（11）：2-9.

［14］SANTOS LO，SILVA PGP，Lemos Junior WJF，et al.Glutathione production by Saccharomyces cerevisiae：current state and perspectives［J］.Appl MicrobiolBiotechnol，2022，106（5-6）：1879-1894.

［15］IMURA M，NITTA K，IWAKIRI R，et al.Comparison of metabolic profiles of yeasts based on the difference of the Crabtree positive and negative［J］.J BiosciBioeng，2020，129（1）：52-58.

［16］劉娟，王雅琴，劉剛，等.發(fā)酵液中還原型谷胱甘肽三種測定方法的改進及其比較［J］.北京化工大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2004（3）：35-38.

［17］YU H S，LEE N K，KIM W J，et al.Optimization of an Industrial Medium and Culture Conditions for Probiotic Weissellacibaria JW15 Biomass Using the Plackett-Burman Design and Response Surface Methodology［J］.J MicrobiolBiotechnol，2022，32（5）：630-637.

（責(zé)任編輯：柯文輝）