中藥白果毒性物質(zhì)4’-O-甲基吡哆醇的高效液相色譜-紫外檢測(cè)器檢測(cè)技術(shù)

黃強(qiáng)燕 李 莉 顧崢嶸 徐晶星 錢(qián)怡云 韋 敏 劉旻虹*

白果為銀杏科植物銀杏（Ginkgo biloba L.）的干燥成熟種子。2020 版《中華人民共和國(guó)藥典》記載，白果，甘、苦、澀，平，有毒，歸肺、腎經(jīng)。具有斂肺定喘，止帶縮尿的功效，用于痰多喘咳，帶下白濁，遺尿尿頻等癥狀[1]。目前，白果資源大部分供食用，既在國(guó)內(nèi)市場(chǎng)銷(xiāo)售又出口他國(guó)，是藥食同源之品，收載于國(guó)家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)規(guī)定的藥食兩用中藥品種目錄中?！侗静菡饕吩啤按_有小毒，生食及熟者多食，均易中毒，小兒尤當(dāng)慎之[2]”。現(xiàn)代文獻(xiàn)報(bào)道，過(guò)多食用白果，容易出現(xiàn)驚厥抽搐，甚至死亡，尤其是兒童更易中毒。中毒患者主要表現(xiàn)為中樞神經(jīng)系統(tǒng)及胃腸道癥狀，偶有末梢神經(jīng)功能障礙[3]。白果中毒沒(méi)有特殊解毒劑，臨床治療白果中毒患者時(shí)，對(duì)于輕度中毒患者，多采用催吐方法，中、重度中毒患者需進(jìn)行洗胃，并根據(jù)情況給予地塞米松、鹽酸納洛酮靜脈滴注，適當(dāng)補(bǔ)充能量合劑與維生素等進(jìn)行綜合治療[4]。

2020 版《中華人民共和國(guó)藥典》中明確提示“生食有毒”，但未見(jiàn)對(duì)其毒性成分的限量標(biāo)準(zhǔn)及相關(guān)檢測(cè)方法。1985年，Wada 等[5]首次從白果中分離得到4’-O-甲基吡哆醇（MPN）或銀杏毒素（ginkgotoxin），并證實(shí)其是導(dǎo)致白果急性中毒癥狀的主要毒性物質(zhì)，之后在銀杏葉中亦發(fā)現(xiàn)這一成分，并廣泛存在于各類(lèi)銀杏葉制品中[6-7]。Leuendorf 等[8]從銀杏中克隆了基因Gbpdx1，并證實(shí)這一基因參與了MPN 結(jié)構(gòu)類(lèi)似化合物的合成過(guò)程，這一基因在銀杏的種子、葉片以及樹(shù)干組織中均有表達(dá)，尤其在種子的表達(dá)最強(qiáng)，這可能是白果種子中MPN 含量較其他部位含量更高的原因之一。

隨著科技的進(jìn)步及人們對(duì)白果安全性的逐步重視，已有多種方法應(yīng)用到了檢測(cè)白果及其制品中的MPN 含量中。然而已建立的熒光檢測(cè)、離子對(duì)色譜法、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC-MS）等檢測(cè)方法，對(duì)檢測(cè)條件的要求較高，推廣應(yīng)用受到了限制[9-13]。目前，仍然缺乏一種更加便捷準(zhǔn)確的檢測(cè)方法，對(duì)中藥白果中吡哆醇類(lèi)毒性成分MPN 進(jìn)行檢測(cè)，以此有效監(jiān)管和保證白果及其制品的安全。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

高效液相色譜儀（Thermo U3000 美國(guó)賽默飛世爾科技有限公司），電子天平（XP105DR，十萬(wàn)分之一，瑞士梅特勒-托利多公司），電子天平（XP504，萬(wàn)分之一，瑞士梅特勒-托利多公司），超聲波清洗器（KQ5200DE，昆山市超聲儀器有限公司）。選定Inertil?ODS-SP（4.6 mm×250 mm，5 μm）為分析色譜柱。

1.2 藥品與試劑

白果（均購(gòu)自市場(chǎng)）；4’-O-甲基吡哆醇（MPN）對(duì)照品（Sigma-Aldrich 公司，批號(hào)：89960-BCCD4482）；乙腈、甲醇為色譜純，其他試劑均為分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Inertil?ODS-SP（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈-10 mmol/L 甲酸銨水溶液（7∶93）；流速：1.0 ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：220 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μl。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液精密稱(chēng)取MPN 對(duì)照品適量，加甲醇溶解稀釋成對(duì)照品貯備液（414.4 μg/ml）。

2.2.2 供試品溶液取樣品粉末（過(guò)4 號(hào)篩）2.5 g，精密加入純水20 ml，稱(chēng)定重量，浸泡30 min，超聲提取30 min。用水補(bǔ)足減失的重量，取上清液以0.45 μm 濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，精密吸取10 μl 注入高效液相色譜儀。

2.3 方法學(xué)驗(yàn)證

2.3.1 線性關(guān)系的考察精密吸取“2.2.1”項(xiàng)下MPN對(duì)照品貯備液適量，稀釋成系列對(duì)照品溶液。以進(jìn)樣濃度X（μg/ml）為橫坐標(biāo)，色譜峰面積Y 為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。見(jiàn)表1。

表1 MPN 線性方程

2.3.2 系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn)取“2.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液、供試品溶液按“2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜。見(jiàn)圖1。在該色譜條件下待測(cè)成分能達(dá)到基線分離（分離度＞1.5）；其他成分對(duì)測(cè)定無(wú)干擾。

圖1 白果對(duì)照品及樣品MPN 分析色譜

2.3.3 定量限與檢測(cè)限取對(duì)照品溶液（濃度0.103 6 μg/ml），按上述色譜條件下分別進(jìn)不同體積進(jìn)行分析。以信噪比為10∶1 時(shí)相應(yīng)濃度計(jì)算定量限，以信噪比為3∶1 時(shí)相應(yīng)濃度計(jì)算檢測(cè)限。MPN 定量限為0.166 μg/g，檢測(cè)限為0.066 μg/g。

2.3.4 進(jìn)樣精密度取對(duì)照品溶液（濃度20.72 μg/ml），按上述色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6 次，計(jì)算峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。結(jié)果表明：其進(jìn)樣精密度為0.4%，進(jìn)樣精密度良好。

2.3.5 重復(fù)性取編號(hào)8 的白果，按上述供試品溶液的制備方法，平行制備6 份供試品溶液，各精密吸取10 μl，注入液相色譜儀，按上述色譜條件進(jìn)行分析，測(cè)定峰面積，計(jì)算含量，結(jié)果重復(fù)性試驗(yàn)的RSD 為1.5%，方法的重復(fù)性良好。

2.3.6 穩(wěn)定性取“2.3.5”重復(fù)性項(xiàng)下一份溶液，分別于0、1、2、4、6、8、10、12 h 進(jìn)樣10 μl，記錄峰面積，計(jì)算 RSD 為1.9%，結(jié)果表明穩(wěn)定性良好。

2.3.7 加樣回收率精密吸取“2.2.1”項(xiàng)下對(duì)照品貯備液7 ml 加水稀釋至500 ml，作為加標(biāo)對(duì)照溶液。取白果熟粉（過(guò)4 號(hào)篩，MPN 含量104.852 μg/g）取約1.25 g，精密稱(chēng)定，置具塞錐形瓶中，分別精密加入20 ml 加標(biāo)對(duì)照溶液，稱(chēng)定重量，浸泡30 min，超聲提取30 min。用水補(bǔ)足減失的重量，取上清液以0.45 μm 濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。精密吸取供試品溶液10 μl，注入液相色譜儀，測(cè)定峰面積，計(jì)算回收率，平均回收率為90.79%，均在80%～120%，平均RSD 為1.4%。

2.4 樣品含量測(cè)定

取樣品12 批，分別按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算含量。見(jiàn)表2。

表2 12 批次樣品中MPN 測(cè)定結(jié)果

3 討論

3.1 色譜條件的選擇

MPN 是白果中主要的吡哆醇類(lèi)毒性成分，由于MPN 的親水性較強(qiáng)，故其在色譜系統(tǒng)的保留較差。為此，通過(guò)在流動(dòng)相中加入離子對(duì)試劑或利用三氟醋酐對(duì)MPN 進(jìn)行衍生化以克服這一缺點(diǎn)。故本實(shí)驗(yàn)前期考察了流動(dòng)相乙腈與10 mmol/L 甲酸銨水溶液，流動(dòng)相流速（0.8 ml/min 和1.0 ml/min），柱溫（15 ℃、25 ℃、35 ℃和40 ℃），發(fā)現(xiàn)色譜條件為1.0 ml/min乙腈-10 mmol/L 甲酸銨水溶液（7∶93），柱溫30 ℃時(shí)，目標(biāo)峰峰型較好，且均能達(dá)到較好的分離效果、純度等要求。在此檢測(cè)條件下，MPN 在220、256、328 nm 處有最大吸收，為獲得更好的峰型及更準(zhǔn)確的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本研究采用220 nm 作為含量測(cè)定的檢測(cè)波長(zhǎng)。不同品牌高效液相（Waters e2695、島津LC-20A、Agilent1200）、不同品牌4.6×250 mm，5 μm的色譜柱（島津的Inertil?ODS-SP 或AtlantisTMT3色譜柱）均能使目標(biāo)峰達(dá)到較好的分離效果、純度等要求。

3.2 前處理方法的考察

經(jīng)查閱相關(guān)文獻(xiàn)資料，MPN 親水性較強(qiáng)，在供試品溶液制備過(guò)程前期，考察了不同的提取溶劑：水、10%甲醇、30%甲醇、50%甲醇、70%甲醇、純甲醇、95%乙醇超聲處理30 min 后進(jìn)樣，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明以水為提取溶劑含量測(cè)定結(jié)果較高。同時(shí)考察了不同提取時(shí)間，如超聲30 min、超聲1 h、浸泡30 min 后超聲30 min、浸泡45 min 后超聲30 min，結(jié)果表明浸泡30 min 后超聲30 min，可達(dá)到較為滿(mǎn)意的提取效果。

另外實(shí)驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)MPN的含量與藥材粉碎的粗細(xì)程度密切相關(guān)，故分別采用了粉碎后不過(guò)篩網(wǎng)、過(guò)3 號(hào)篩網(wǎng)、過(guò)4 號(hào)篩網(wǎng)、過(guò)5 號(hào)篩網(wǎng)的樣品進(jìn)行制備供試品溶液，發(fā)現(xiàn)過(guò)4 號(hào)篩網(wǎng)的樣品含量最高，且操作簡(jiǎn)便，最終確定了上述供試品溶液提取方法。