復(fù)方阿莫西林乳房注入劑無(wú)菌檢查方法的優(yōu)化

韓寧寧，彭文繡，王 軒，趙 暉，楊秀玉，戴 青，趙富華

(中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081)

阿莫西林乳房注入劑是由阿莫西林、舒巴坦、潑尼松龍與礦物油制成的供乳房灌注用滅菌混懸油溶液，用于奶牛泌乳期乳房炎的治療。β-內(nèi)酰胺酶抑制劑舒巴坦與β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素阿莫西林聯(lián)用，可起到增效和擴(kuò)大抗菌譜作用[1-2]，糖皮質(zhì)激素藥物潑尼松龍可增加機(jī)體對(duì)炎癥的耐受性以及降低炎癥的血管反應(yīng)與細(xì)胞反應(yīng)。無(wú)菌檢查是控制乳房注入劑安全性的重要項(xiàng)目。復(fù)方阿莫西林乳房注入劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)收載于《獸藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)匯編》(2013年版)[3]中，無(wú)菌檢查采用直接接種法。經(jīng)國(guó)家獸藥基礎(chǔ)數(shù)據(jù)庫(kù)[4]查詢(xún)，目前有4家獸藥生產(chǎn)企業(yè)獲得了該品種的批準(zhǔn)文號(hào)，相應(yīng)產(chǎn)品執(zhí)行該標(biāo)準(zhǔn)。2019年，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公告第150號(hào)[5]批準(zhǔn)了該品種的變更注冊(cè)，并發(fā)布了修訂后的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，但無(wú)菌檢查方法并未發(fā)生變更。部分企業(yè)在執(zhí)行該無(wú)菌檢查標(biāo)準(zhǔn)的過(guò)程中反映，供試品接種后呈混懸狀態(tài)，無(wú)法準(zhǔn)確判斷是否有菌生長(zhǎng)，且操作繁瑣，易受外源性微生物污染，對(duì)人員操作和環(huán)境潔凈程度要求較高。而薄膜過(guò)濾法作為各國(guó)藥典收載的無(wú)菌檢查的首選方法[6-7]，可克服上述問(wèn)題。因此，擬將復(fù)方阿莫西林乳房注入劑無(wú)菌檢查方法進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)先考慮采用薄膜過(guò)濾法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試品 共收集到來(lái)自2家獸藥生產(chǎn)企業(yè)的4批樣品，見(jiàn)表1。

表1 樣品信息Tab1 Information of samples

1.1.2 試驗(yàn)菌種 金黃色葡萄球菌[CMCC (B) 26003]、大腸埃希菌[CMCC (B) 44102]、銅綠假單胞菌[CMCC (B) 10104]、枯草芽孢桿菌[CMCC (B)63501]、生孢梭菌[CMCC (B) 64941]、白色念珠菌[CMCC (F) 98001]和黑曲霉[CMCC (F)98003] 均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。

1.1.3 培養(yǎng)基 硫乙醇酸鹽液體培養(yǎng)基、胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基、胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基、沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基均購(gòu)自北京中海生物科技有限公司。

1.1.4 儀器及耗材 無(wú)菌隔離器(HTY-1650G3)和一次性無(wú)菌濾器(EVS3、EVS2)均購(gòu)自浙江泰林生物技術(shù)股份有限公司。青霉素酶(30萬(wàn)單位/mL)購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。

1.2 方法

1.2.1 薄膜過(guò)濾無(wú)菌檢查方法的建立

1.2.1.1 萃取溶劑種類(lèi)的篩選 萃取的油相溶劑采用無(wú)抑菌干擾作用且破乳效果良好的肉豆蔻酸異丙酯。將10 g供試品(來(lái)源/批號(hào)：齊魯/1709007)置200 mL肉豆蔻酸異丙酯中，混勻，得均勻混懸液。采用三種水相溶劑0.1%蛋白胨溶液、pH 7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液和pH 6.0磷酸鹽緩沖液分別對(duì)破乳后的混懸液進(jìn)行萃取，并對(duì)水油分離效果進(jìn)行比較，以選擇適宜的水相溶劑。

1.2.1.2 萃取溶劑體積的選擇 將收集到的兩個(gè)生產(chǎn)企業(yè)的樣品分別采用不同體積的油相溶劑(600 mL和200 mL)和水相溶劑(300 mL和100 mL)進(jìn)行萃取，并對(duì)水油分離效果進(jìn)行比較，以選擇適宜的萃取溶劑體積。

1.2.1.3 萃取回收率的考察 為保證樣品中油相包被的菌均分配至水相中，同時(shí)為驗(yàn)證水相溶劑對(duì)菌的生長(zhǎng)無(wú)抑制作用，對(duì)萃取回收率進(jìn)行了考察。取滅菌后的輔料10 g，置分液漏斗中，加入小于100 cfu/mL的金黃色葡萄球菌菌液2 mL，加600 mL肉豆蔻酸異丙酯，混勻，加入300 mL pH 6.0磷酸鹽緩沖液，振搖后靜置，取水層置二聯(lián)濾器上過(guò)濾。過(guò)濾后取下濾膜置胰酪大豆胨瓊脂平板上培養(yǎng)，32.5 ℃培養(yǎng)24 h后計(jì)數(shù)。

1.2.1.4 沖洗液體積的選擇 取10 g供試品置600 mL肉豆蔻酸異丙酯中，混勻，加入300 mL pH 6.0磷酸鹽緩沖液，振搖后靜置，取水層置二聯(lián)濾器上過(guò)濾后，分別用300 mL/膜、600 mL/膜、900 mL/膜pH 7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液進(jìn)行沖洗后，每個(gè)濾筒加入約100 mL硫乙醇酸鹽液體培養(yǎng)基，再加入小于100 cfu的金黃色葡萄球菌，32.5 ℃培養(yǎng)并與陽(yáng)性對(duì)照菌的生長(zhǎng)情況進(jìn)行比較，以選擇適宜的沖洗體積。

1.2.1.5 青霉素酶用量的選擇 取10 g供試品置600 mL肉豆蔻酸異丙酯中，混勻，加入300 mL pH 6.0磷酸鹽緩沖液，振搖后靜置，取水層置二聯(lián)濾器上過(guò)濾后，用300 mL/膜pH 7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液進(jìn)行沖洗，每個(gè)濾筒加入約100 mL硫乙醇酸鹽液體培養(yǎng)基，重復(fù)制備5個(gè)濾筒，分別加入300萬(wàn)單位/膜、30萬(wàn)單位/膜、3萬(wàn)單位/膜、3千單位/膜、300單位/膜的青霉素酶，再加入小于100 cfu的金黃色葡萄球菌，32.5 ℃培養(yǎng)并與陽(yáng)性對(duì)照菌的生長(zhǎng)情況進(jìn)行比較，以選擇適宜的青霉素酶用量。

1.2.2 擬建立的薄膜過(guò)濾無(wú)菌檢查法 取混勻后的本品10 g，置滅菌的分液漏斗中，加無(wú)菌肉豆蔻酸異丙酯600 mL，充分振搖，再加pH 6.0磷酸鹽緩沖液300 mL，振搖，靜置，取水層用薄膜過(guò)濾法處理，用pH 7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液為沖洗液沖洗濾膜，每次沖洗100 mL/膜，共沖洗3次。每膜加入不少于3萬(wàn)單位青霉素酶。依法檢查(附錄1101)，應(yīng)符合規(guī)定。

1.2.3 方法學(xué)驗(yàn)證 按照《中國(guó)獸藥典》一部附錄1101[8]的要求，對(duì)上述方法進(jìn)行驗(yàn)證。

1.2.3.1 菌液的制備 分別取金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽胞桿菌、大腸埃希菌的新鮮培養(yǎng)物1白金耳，接種于10 mL胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，經(jīng)30～35 ℃培養(yǎng)18～24 h，取1 mL分別加入9 mL pH 7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，作為10-1管，逐管10倍稀釋至小于100 cfu/mL，活菌計(jì)數(shù)備用。

取生孢梭菌接種于硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基中，取白色念珠菌接種于沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基中，取黑曲霉接種于沙氏葡萄糖瓊脂斜面培養(yǎng)基上，同法操作。

1.2.3.2 活菌計(jì)數(shù) 分別取上述細(xì)菌菌液1 mL加入培養(yǎng)皿，每種菌液做2個(gè)平皿，注入胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基約18 mL，置30～35 ℃培養(yǎng)24～48 h。取生孢梭菌菌液置于硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基中，取真菌菌液注入沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基中，同法操作。

1.2.3.3 培養(yǎng)基的靈敏度檢查 取每管裝量為12 mL的硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基7支，分別接種小于100 cfu的金黃色葡萄球菌、銅綠假單孢菌、生孢梭菌各2支，另1支不接種作為空白對(duì)照，培養(yǎng)3 d。另取每管裝量為9 mL的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基7支，分別接種小于100 cfu的枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉各2支，另1支不接種作為空白對(duì)照，培養(yǎng)5 d。以空白對(duì)照管應(yīng)無(wú)菌生長(zhǎng)，加菌的培養(yǎng)基管生長(zhǎng)良好來(lái)判定該培養(yǎng)基的靈敏度檢查符合規(guī)定。

1.2.3.4 薄膜過(guò)濾無(wú)菌檢查法適用性試驗(yàn) ①供試品陽(yáng)性菌試驗(yàn)組：取供試品10支，擠出內(nèi)容物，混勻，取混合樣品10 g，置滅菌的分液漏斗中，照1.2.2項(xiàng)操作，在最后一次沖洗液中分別加入小于100 cfu/mL的菌液1 mL，過(guò)濾后，每個(gè)濾筒內(nèi)灌注培養(yǎng)基和3萬(wàn)單位青霉素酶，其中金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、生孢梭菌在硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基中，30～35 ℃條件下培養(yǎng)5 d，枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉在胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，20～25 ℃條件下培養(yǎng)5 d，各2組。

②陽(yáng)性菌對(duì)照組：除不加供試品外，其余同法操作。

③供試品組：除不加陽(yáng)性菌外，其余同法操作。

④陰性對(duì)照組：除不加供試品和陽(yáng)性菌外，其余同法操作。

1.2.4 供試品的無(wú)菌檢查 因上市抽驗(yàn)樣品的最少檢驗(yàn)數(shù)量不包括陽(yáng)性對(duì)照用量，因此在進(jìn)行供試品無(wú)菌檢查實(shí)際操作時(shí)應(yīng)增加二分之一的最少檢驗(yàn)數(shù)量作陽(yáng)性對(duì)照用，即取供試品15支，擠出內(nèi)容物，混勻。取混合樣品10 g，置滅菌的分液漏斗中，加滅菌肉豆蔻酸異丙酯600 mL充分振搖，再加pH 6.0磷酸鹽緩沖液300 mL，振搖，靜置，取水層。再取混合樣品5 g，置滅菌的分液漏斗中，加無(wú)菌肉豆蔻酸異丙酯300 mL充分振搖，再加pH 6.0磷酸鹽緩沖液150 mL，振搖，靜置，取水層。將兩次萃取的水層合并，照1.2.2項(xiàng)操作。

2 結(jié)果與分析

2.1 薄膜過(guò)濾無(wú)菌檢查方法的建立

2.1.1 萃取溶劑種類(lèi)的篩選 pH 6.0磷酸鹽緩沖液相對(duì)常規(guī)的無(wú)菌檢查用溶劑0.1%蛋白胨溶液和pH 7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液而言，明顯減輕了乳化現(xiàn)象，實(shí)現(xiàn)了完全分離，提高了萃取效率(表2)。

表2 萃取溶劑種類(lèi)的選擇Tab 2 Selection of extraction solvent

2.1.2 萃取溶劑體積的選擇 齊魯與澳龍兩家企業(yè)的產(chǎn)品黏度差異較大，齊魯?shù)臉悠份^稀，澳龍的樣品較粘稠。因此,在考察了齊魯?shù)臉悠返妮腿⌒Ч?，將供試品換為澳龍的樣品。采用上述萃取溶劑進(jìn)行萃取，結(jié)果發(fā)現(xiàn)又出現(xiàn)了嚴(yán)重乳化現(xiàn)象。因此將萃取溶劑量進(jìn)行了增大。采用600 mL肉豆蔻酸異丙酯與300 mL pH 6.0磷酸鹽緩沖液，對(duì)上述2家企業(yè)的各10 g供試品進(jìn)行萃取，均可完全分層(表3)。

表3 萃取溶劑體積的選擇Tab 3 Selection of extraction solvent volume

2.1.3 萃取回收率的考察 萃取后每膜菌落數(shù)/每1 mL菌落數(shù)=(77+65)/(63+68)=108%，在50%～200%的范圍內(nèi)。說(shuō)明萃取后樣品中的菌均分配至水相，且pH 6.0磷酸鹽緩沖液對(duì)菌的生長(zhǎng)無(wú)抑制作用。

2.1.4 沖洗液體積的選擇 結(jié)果見(jiàn)表4，該結(jié)果表明即便沖洗900 mL/膜仍不能消除阿莫西林對(duì)菌生長(zhǎng)的抑制作用，需要加青霉素酶使阿莫西林降解以消除影響。

表4 沖洗液體積的選擇Tab 4 Selection of flushing fluid volume

2.1.5 青霉素酶用量的選擇 結(jié)果見(jiàn)表5，該結(jié)果表明，3000單位/膜是可消除阿莫西林抑菌作用的臨界青霉素酶濃度。但考慮到不同品牌和種類(lèi)的濾膜對(duì)阿莫西林的截留量存在差異，亦考慮到不同試驗(yàn)人員操作手法有所差異，擬采用青霉素酶的用量為3萬(wàn)單位/膜。

表5 青霉素酶用量的選擇Tab 5 Selection of penicillin enzyme dosage

2.2 方法學(xué)驗(yàn)證

2.2.1 活菌計(jì)數(shù) 結(jié)果見(jiàn)表6，該結(jié)果表明，在各自對(duì)應(yīng)稀釋級(jí)別下，各檢定菌株濃度均在50～100 cfu/mL范圍，符合無(wú)菌檢查陽(yáng)性菌濃度要求。

表6 活菌計(jì)數(shù)結(jié)果Tab 6 Results of living bacteria counts

2.2.2 培養(yǎng)基的靈敏度檢查 各細(xì)菌檢定菌株均在24 h內(nèi)生長(zhǎng)，各霉菌檢定菌株均在48 h內(nèi)生長(zhǎng)，符合無(wú)菌檢查用菌要求。

2.2.3 無(wú)菌檢查方法適用性試驗(yàn) 薄膜過(guò)濾后，含供試品的陽(yáng)性菌試驗(yàn)組試驗(yàn)菌均生長(zhǎng)良好，供試品對(duì)菌生長(zhǎng)沒(méi)有影響。

2.3 供試品的無(wú)菌檢查 4批供試品進(jìn)行無(wú)菌檢查后，陽(yáng)性對(duì)照菌在24 h內(nèi)生長(zhǎng)良好，陰性對(duì)照14 d內(nèi)均澄清，無(wú)菌生長(zhǎng)，4批供試品14 d內(nèi)均澄清，無(wú)菌生長(zhǎng)，無(wú)菌檢查結(jié)果均符合規(guī)定。

3 討論與小結(jié)

3.1 薄膜過(guò)濾法與直接接種法的優(yōu)劣性分析[9]在樣品有抑菌作用干擾時(shí)，直接接種法由于難以排除樣品干擾，僅可采用減少取樣量的方法進(jìn)行稀釋?zhuān)虼?，樣品取樣量不可過(guò)大，無(wú)菌檢查結(jié)果對(duì)整批樣品的代表性降低；另外，對(duì)于油性基質(zhì)的樣品而言，與培養(yǎng)基混合后會(huì)形成混懸液，難以與陽(yáng)性對(duì)照進(jìn)行區(qū)分，結(jié)果判斷困難，需進(jìn)一步采用轉(zhuǎn)種的方式進(jìn)行次代培養(yǎng)，方可準(zhǔn)確判斷結(jié)果，但操作步驟增多又增大了污染的可能性；再者，直接接種法的所有操作均在開(kāi)放性容器中進(jìn)行，對(duì)人員操作和環(huán)境潔凈度的要求較為嚴(yán)格。

薄膜過(guò)濾法由于可采用沖洗液將樣品沖洗去除，取樣量較直接接種法可有所增大，結(jié)果代表性增強(qiáng)；對(duì)于油性基質(zhì)的樣品，可選擇采用聚山梨酯80等水油互溶性表面活性劑溶解后過(guò)濾，但如果采用上述手段仍無(wú)法使樣品順利過(guò)膜，可考慮破乳萃取水相的方式，但需注意選擇適宜的萃取溶劑以避免乳化；另外，薄膜過(guò)濾法可采用全封閉式濾器，避免了外源性微生物的污染，操作更為簡(jiǎn)便；再者，薄膜過(guò)濾法的培養(yǎng)基避免了油相的干擾，結(jié)果易于觀(guān)察。

對(duì)于本方法而言，萃取乳化嚴(yán)重的特殊情況導(dǎo)致即便采用薄膜過(guò)濾法亦無(wú)法較直接接種法[10]進(jìn)一步增大取樣量，但方法操作更為便捷，方法可靠性增強(qiáng)，結(jié)果判斷準(zhǔn)確性提高。

3.2 萃取用溶劑的選擇分析 乳房注入劑用于奶牛乳房炎的治療時(shí)，需向患病乳區(qū)灌注藥物，藥物在乳區(qū)局部留置，以充分發(fā)揮藥效，基于藥效設(shè)計(jì)的乳房注入劑多為油性基質(zhì)的混懸液或乳膏狀半固體[11]。但對(duì)于上述基質(zhì)的樣品而言，無(wú)菌的薄膜過(guò)濾法如將樣品直接過(guò)膜往往會(huì)因?yàn)槎履ざ鵁o(wú)法進(jìn)行。對(duì)現(xiàn)有乳房注入劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中無(wú)菌檢查項(xiàng)方法進(jìn)行了梳理，發(fā)現(xiàn)采用薄膜過(guò)濾法的方法大部分將樣品進(jìn)行了萃取，再取水相過(guò)膜。萃取用的油相溶劑多采用肉豆蔻酸異丙酯，萃取的水相溶劑多采用附錄1101推薦的常用溶劑0.1%蛋白胨溶液或pH 7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液。但本制劑采用上述常規(guī)溶劑萃取乳化現(xiàn)象嚴(yán)重，無(wú)法實(shí)現(xiàn)兩相分離。分析認(rèn)為乳化現(xiàn)象嚴(yán)重的原因是主藥阿莫西林三水合物在pH中性的緩沖液中溶解性差，而酸性緩沖液中阿莫西林溶解度提高，可使乳化現(xiàn)象減輕。但酸性過(guò)強(qiáng)的緩沖液亦會(huì)對(duì)菌的生長(zhǎng)產(chǎn)生影響，因此，嘗試采用弱酸性的pH 6.0磷酸鹽緩沖液作為萃取的水相溶劑，在解決乳化問(wèn)題的同時(shí)亦避免了溶劑本身對(duì)菌的損傷。

本試驗(yàn)采用薄膜過(guò)濾法對(duì)復(fù)方阿莫西林乳房注入劑進(jìn)行無(wú)菌檢查。通過(guò)萃取溶劑的選擇，解決了萃取乳化嚴(yán)重、萃取效率低的問(wèn)題；通過(guò)增大萃取溶劑體積，實(shí)現(xiàn)了對(duì)不同生產(chǎn)企業(yè)制劑的通用性；通過(guò)萃取后過(guò)濾水相，解決了供試品直接過(guò)濾容易堵膜甚至因系統(tǒng)壓力過(guò)高而崩裂濾器管路的問(wèn)題；通過(guò)青霉素酶加入量的考察，選擇適宜的酶加入量，在去除了供試品干擾作用的前提下，實(shí)現(xiàn)了試劑的節(jié)約。