北美鵝掌楸YABBY轉(zhuǎn)錄因子家族的鑒定與表達(dá)分析

劉換換，楊立春，張成閣，郝自遠(yuǎn)，李火根

（1.南京林業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，江蘇 南京 210037；2.江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院 風(fēng)景園林學(xué)院，江蘇 句容 212400）

YABBY家族是種子植物特有一類轉(zhuǎn)錄因子，暫未在苔蘚類、石松類和蕨類植物的轉(zhuǎn)錄組和基因組中識別到Y(jié)ABBY家族的同源序列，在對植物的早期胚胎發(fā)育、果實(shí)發(fā)育、次生代謝物合成、逆境應(yīng)答、側(cè)生器官分化和背腹極性建立等方面均具有重要作用[1-3]。YABBY家族基因編碼的蛋白具有2個(gè)保守的結(jié)構(gòu)域：N端的Cys2/Cys2（C2C2）鋅指結(jié)構(gòu)域和C端的helix-loop-helix（bHLH），也稱為YABBY結(jié)構(gòu)域[4-5]。目前已對眾多物種的YABBY家族進(jìn)行了成員分析和功能預(yù)測與驗(yàn)證。擬南芥Arabidopsis thaliana中共6個(gè)YABBY成員：CRABS CLAW（CRC）、YABBY1/FILAMENTOUS FLOWER（FIL）、YABBY2、YABBY3、YABBY5和INNER NO OUTER（INO），共 分 為5個(gè) 亞族：FIL/YABBY3、CRC、INO、YABBY2和YABBY5[6]。其中FIL/YABBY3、YABBY2、YABBY5基因不僅在植株地上部分的遠(yuǎn)軸區(qū)的特異表達(dá)，也在花器官中表達(dá)，如萼片、花瓣、雄蕊和心皮等，但在胚珠中不表達(dá)，因此，這3類基因被稱為營養(yǎng)生長YABBY基因（Vegetative genes）；CRC在被子植物的心皮、核心雙子葉植物的蜜腺發(fā)育中發(fā)揮重要作用，INO參與植物胚珠的發(fā)育調(diào)控，被稱為生殖生長YABBY基因（Reproductive genes）[6-10]。不同物種的YABBY家族成員數(shù)量不同，但其功能與模式植物擬南芥仍然相似。如在單子葉植物玉米Zea mays中YABBY家族成員有13個(gè)，而小麥Triticum aestivum為21個(gè)；在雙子葉植物桃Prunus persica中有6個(gè)，葡萄Vitis vinifera為7個(gè)、石榴Punica granatum為6個(gè)、番茄Solanum Lycopersicon為9個(gè)、辣椒Capsicum annuum則有7～8個(gè)[11-18]。雙子葉植物的YABBY家族成員數(shù)量明顯少于單子葉植物。進(jìn)化研究表明，現(xiàn)存的開花植物最后的共同祖先至少有5個(gè)YABBY成員[19]。

水稻Oryza sativa的8個(gè)YABBY成員，分別命名為YABBY1-7和披葉基因DROOPING LEAF（DL），編碼了170～314 aa，均預(yù)測定位到細(xì)胞核，其外顯子有6～7個(gè)。研究發(fā)現(xiàn)，水稻的YABBY家族出現(xiàn)4次片段重復(fù)事件，表明水稻基因組可能至少經(jīng)歷了2次基因組復(fù)制[20]。玉米YABBY家族的13個(gè)成員ZmYAB1-13同樣具有基因擴(kuò)張現(xiàn)象，ZmYAB1/12是OsDL的同源基因[12]。小麥YABBY家族中的18個(gè)基因編碼了185～297 aa，外顯子數(shù)目為5～7個(gè)。在TaYABBY啟動(dòng)子區(qū)檢測到與植物生長發(fā)育、激素誘導(dǎo)和逆境脅迫有關(guān)的順式作用元件，基因具有明顯的組織表達(dá)特異性[21]。桃有6個(gè)YABBY基因，可分為CRC、INO、FIL/YAB3、YAB2和YAB5共5類，成員具4～6個(gè)內(nèi)含子，啟動(dòng)子含有大量光應(yīng)答、激素響應(yīng)等順式作用元件，表明該家族基因的表達(dá)可能會(huì)受到環(huán)境、激素等的影響[14]。石榴（6個(gè)）和葡萄（7個(gè)）在進(jìn)化過程中沒有YABBY家族基因擴(kuò)張現(xiàn)象[15-16]。石榴YABBY家族成員具有7個(gè)外顯子，與擬南芥相似，結(jié)構(gòu)相對保守，將石榴與雙子葉植物：擬南芥、大豆Glycine max、番茄和葡萄，單子葉植物：水稻、菠蘿Ananas comosus和玉米的YABBY家族進(jìn)行進(jìn)化分析，發(fā)現(xiàn)YABBY5亞族最小，且是雙子葉植物特有的[22]。

鵝掌楸屬Liriodendron隸屬木蘭科Magnoliaceae，主要包括2個(gè)自然種，即鵝掌楸L.chinense和北美鵝掌楸L.tulipifera。鵝掌楸屬植物為基部被子植物，在植物系統(tǒng)發(fā)生中處于關(guān)鍵位置，因此其進(jìn)化關(guān)系、花器官特征、花發(fā)育調(diào)控一直是研究的熱點(diǎn)[23-30]。YABBY家族對花早期發(fā)育、心皮、雄蕊、蜜腺等花器官發(fā)育調(diào)控均發(fā)揮重要作用，因此對鵝掌楸屬植物YABBY基因進(jìn)行分析研究是非常必要的。而且相比其他物種，目前在鵝掌楸屬植物中關(guān)于YABBY基因家族的鑒定與功能研究很少?；诖?，本研究基于鵝掌楸基因組和北美鵝掌楸轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，擬開展北美鵝掌楸YABBY家族的生物信息學(xué)分析，并對其中的差異表達(dá)基因進(jìn)行克隆和表達(dá)分析，以期為進(jìn)一步闡明北美鵝掌楸YABBY的功能打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

本研究所用植物材料為北美鵝掌楸（種源為佐治亞），來自于江蘇省句容市南京林業(yè)大學(xué)下蜀實(shí)習(xí)林場的鵝掌楸屬種源試驗(yàn)林，地理位置119°14′E，31°59′N。試驗(yàn)林營建于1993年，試驗(yàn)林內(nèi)樹木均已成年。采集北美鵝掌楸根、莖、葉、花瓣、萼片、雄蕊和雌蕊組織，做好標(biāo)記，迅速置于液氮中，帶回實(shí)驗(yàn)室于超低溫冰箱中-80℃下保存。亞細(xì)胞定位材料為本實(shí)驗(yàn)室保存的本氏煙草Nicotiana benthamiana，pBI121-eGFP表達(dá)載體和P19輔助載體為本實(shí)驗(yàn)室保存的載體。

1.2 方 法

1.2.1 總RNA提取和cDNA合成

總RNA提取、完整性和濃度檢測參考天根生化科技有限公司離心柱型多糖多酚植物總RNA提取試劑盒的說明書進(jìn)行。按照PrimeScript RT Master Mix (Perfect real time)反轉(zhuǎn)錄試劑盒（寶日醫(yī)生物科技有限公司）的步驟獲得cDNA。

以反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA作為克隆目的基因中間片段的模板，根據(jù)北美鵝掌楸RNA-seq數(shù)據(jù)中LtYABBY1,5序列，使用Oligo7軟件設(shè)計(jì)引物，引物序列見表1。配制50 μL反應(yīng)體系：2×Phanta Max Buffer 25 μL，dNTP Mix (10 mmol/L each)1 μL，cDNA模板2 μL，引物F/R各2 μL，Phanta Max Super-Fridelity DNA Polymerase 1 μL，ddH2O補(bǔ)足至50 μL，冰上操作，反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性3 min；95℃變性15 s，60℃退火15 s，72℃延伸60 s/kb，35個(gè)循環(huán)；72℃徹底延伸5 min。目的片段的切膠回收和連接轉(zhuǎn)化參照EasyPure Quick Gel Extraction Kit試劑盒和pEASY-Blunt Cloning Kit克隆載體試劑盒的說明書進(jìn)行。挑選片段大小正確的克隆送至上海杰李生物技術(shù)有限公司測序，使用BioXM 2.6軟件和NCBI網(wǎng)站比對分析測序結(jié)果。

表1 擴(kuò)增PCR引物序列Table 1 Primer sequences for PCR reactions

1.2.2 北美鵝掌楸LtYABBY1/5基因全長擴(kuò)增

3′RACE和5′RACE PCR擴(kuò)增分別按照3′-Full RACE Core Set with PrimeScrip RTase Kit和SMARTer RACE5′/3′ Kit試劑盒進(jìn)行，采用巢式PCR反應(yīng)法，引物見表1。將3′RACE和5′RACE Inner PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳，并切膠回收PCR產(chǎn)物，連接、轉(zhuǎn)化、克隆檢測、測序及序列比對分析與1.2.1相同。

隨后，將中間片段、3′RACE和5′RACE擴(kuò)增得到的序列通過BioXM 2.6軟件進(jìn)行序列拼接，最終得到LtYABBY1/5基因的全長。將全長序列于NCBI數(shù)據(jù)庫中的ORF Finder網(wǎng)站進(jìn)行在線預(yù)測開放閱讀框（Open reading frame, ORF），根據(jù)預(yù)測的ORF設(shè)計(jì)引物，驗(yàn)證完整性，引物見表1。其中，LtYABBY5在中間片段擴(kuò)增時(shí)已經(jīng)獲得完整ORF，且測序正確，因此不需再進(jìn)行ORF驗(yàn)證試驗(yàn)。將驗(yàn)證后的ORF于NCBI數(shù)據(jù)庫中的BLAST Protein進(jìn)行蛋白序列比對，結(jié)合比對結(jié)果、其他物種的序列以及保守結(jié)構(gòu)域，對目的基因進(jìn)行命名。

1.2.3 基因生物信息學(xué)分析

基因家族的生物信息學(xué)分析主要參考付鴻博等[31]所用的方法和軟件。通過ExPASy ProtParam（https://web.expasy.org/protparam/）、ProtScale（https://web.expasy.org/protscale/） 和SignalP-5.0 Server（https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?SignalP-5.0）在線分析蛋白化學(xué)性質(zhì)、疏水性和信號肽；通過TMpred（http://sbcb.bioch.ox.ac.uk/TM_noj/TM_noj.html） 和TMHMM（https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?TMHMM-2.0）在線分析蛋白跨膜區(qū)；通過SOPMA（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html） 和SWISSMODEL（https://swissmodel.expasy.org/）在線預(yù)測分析蛋白的二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)；蛋白亞細(xì)胞定位通 過TargetP1.1 Server（https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?TargetP-1.1） 和WOLF PSORT（https://wolfpsort.hgc.jp/）在線軟件預(yù)測；通過Motif Scan（https://myhits.sib.swiss/cgi-bin/motif_scan）在線分析蛋白的結(jié)構(gòu)域；通過DNAMAN軟件進(jìn)行蛋白同源性比對分析，使用MEGA 10軟件構(gòu)建進(jìn)化樹。

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

以北美鵝掌楸的根、莖、葉、花芽、萼片、花瓣、雄蕊和雌蕊共8個(gè)組織的cDNA為模板，檢測YABBY1,5基因的組織特異性表達(dá)。首先，使用20 μL體系驗(yàn)證引物的特異性擴(kuò)增：2×Taq Master Mix 10 μL，引物F/R各1 μL，cDNA模板50 ng，ddH2O補(bǔ)足至20 μL。熱循環(huán)程序：94℃，5 min；94℃，30 s，60℃，30 s，72℃，30 s，35個(gè)循環(huán)；72℃，7 min。RT-qPCR試驗(yàn)參照TB Green Premix Ex Taq (Tli RNaseH Plus)試劑盒操作，配制10 μL反應(yīng)體系，每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)重復(fù)，使用ABI Step one plus 熱循環(huán)儀，設(shè)置熱循環(huán)程序：95℃，1 min；95℃，5 s，60℃，34 s，40個(gè)循環(huán)；溶解曲線為95℃，15 s，60℃，1 min，95℃，15 s。以LcActin97作為內(nèi)參基因，使用相對定量表達(dá)法2-ΔΔCT計(jì)算基因的相對表達(dá)量，并用ORIGIN軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和繪圖。該部分試驗(yàn)步驟、分析方法參考文獻(xiàn)[32]。

1.2.5 亞細(xì)胞定位表達(dá)載體質(zhì)粒構(gòu)建

通用引物檢測pBI121-eGFP載體（表1），隨后，按照高純質(zhì)粒DNA提取試劑盒說明書進(jìn)行提取質(zhì)粒。載體的酶切位點(diǎn)分別為XbaI、BamHI，體系為50 μL：10×QuickCut Buffer 5 μL，質(zhì) 粒DNA 1 μg，XbaI/BamHI各1 μL，ddH2O補(bǔ)足至50 μL，37℃下反應(yīng)30 min，80℃下酶失活20 min。

使用CE Design軟件分別設(shè)計(jì)LtYABBY1,5基因的雙酶切引物（表1），進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得酶切產(chǎn)物。將pBI121-eGFP載體質(zhì)粒酶切產(chǎn)物與目的片段酶切DNA重組，配制20 μL反應(yīng)體系：線性化載體長度×0.02 ng，插入片段片段長度×0.04 ng，ExnaseⅡ 2 μL，5×CEⅡ Buffer 4 μL，ddH2O補(bǔ)足至20 μL，37℃ PCR反應(yīng)30 min。取10 μL重組產(chǎn)物轉(zhuǎn)化、菌落檢測，將測序正確、無變異位點(diǎn)的質(zhì)粒于-20℃下存放備用。

1.2.6 瞬時(shí)轉(zhuǎn)化煙草及亞細(xì)胞定位觀察

取5 μL重組質(zhì)粒加入100 μL剛?cè)诨霓r(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞GV3101，輕彈混勻，置于冰中20 min，液氮中速凍1 min，37℃下熱激5 min，冰上冰浴5 min，加入250 μL LB培養(yǎng)基，28℃，200 rpm孵育4 h，涂于含Kan抗生素的LB平板28℃下培養(yǎng)48 h。

選擇單克隆菌落進(jìn)行PCR檢測，陽性克隆即為構(gòu)建完成的瞬時(shí)表達(dá)載體。將瞬時(shí)表達(dá)載體、陽性對照空載體及輔助載體P19分別于雙抗（Kan和利福平抗生素）LB培養(yǎng)基中，28℃，200 rpm培養(yǎng)至OD600=0.6～0.8，4℃，5 000 rpm離心5 min，收集菌體，加入相同體積的緩沖液重懸，將瞬時(shí)表達(dá)載體與輔助載體P19按體積1∶1混合，暗培養(yǎng)2～3 h。用注射器將浸染液注射至本氏煙草葉片背面，暗培養(yǎng)8 h，光照培養(yǎng)2～3 d。剪下約0.3 cm×0.3 cm左右大小的葉盤，加入DAPI核染料進(jìn)行核染色，約10～15 min，放于載玻片上，葉片背面向上，滴入超純水，蓋上載玻片。于激光共聚焦顯微鏡（LSM710）下觀察蛋白亞細(xì)胞定位結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 北美鵝掌楸YABB Y家族分析

在北美鵝掌楸的花蜜腺轉(zhuǎn)錄組中共發(fā)現(xiàn)YABBY家族成員6個(gè)，經(jīng)過蛋白家族數(shù)據(jù)庫（Protein family, PFAM）（Pfam: PF04690）、保守結(jié)構(gòu)域數(shù)據(jù)庫（Conserved domain database,CDD）和基序序列預(yù)測（Multiple Em for Motif Elicitation, MEME）網(wǎng)站的分析，發(fā)現(xiàn)其中一個(gè)序列（Lchi07520）的結(jié)構(gòu)域不完整，故將其刪除，對剩余5個(gè)YABBY家族成員進(jìn)行后續(xù)分析。5個(gè)基因編碼的蛋白序列長度為164～212 aa，外顯子數(shù)量為6～7個(gè)。Lchi28144僅有6個(gè)外顯子，其編碼的氨基酸長度僅為164個(gè)，比其他成員短（表2），因此推測該基因編碼區(qū)部分缺失。根據(jù)Nr數(shù)據(jù)庫預(yù)測結(jié)果，他們可能屬于YABBY1/FIL、YABBY2和YABBY5亞族。

表2 北美鵝掌楸YABBY家族基因概況Table 2 Identification of the YABBY family genes based on the RNA-seq and genome data of L.tulipifera

獲得北美鵝掌楸YABBY家族成員的氨基酸序列后，對其進(jìn)行序列比對。并在Plant TFDB數(shù)據(jù)庫（Plant transcription factors database）下載擬南芥YABBY家族成員的氨基酸序列，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，為北美鵝掌楸YABBY家族成員命名及分類提供依據(jù)。由序列比對結(jié)果可知，Lchi28144基因在5′端序列缺失22 aa，這也解釋了該基因外顯子個(gè)數(shù)比其他成員少1個(gè)，說明北美鵝掌楸YABBY家族成員的外顯子數(shù)量和長度是比較保守的，外顯子均為7個(gè)（圖1A）。擬南芥的YABBY家族共6個(gè)成員，根據(jù)系統(tǒng)進(jìn)化樹結(jié)果表明，Lchi01041和Lchi01043屬 于YABBY5亞 族，Lchi28144屬于YABBY2亞 族，Lchi23476和Lchi24373屬 于YABBY1/FIL亞族（圖1B）。

圖1 北美鵝掌楸YABBY家族氨基酸序列比對（A）及系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建（B）Fig.1 Alignment of the CDS sequences (A) and the phylogenetic tree of YABBY proteins of L.tulipifera and A.thaliana (B)

北美鵝掌楸YABBY家族的保守結(jié)構(gòu)域和Motif分析是在CDD和MEME網(wǎng)站進(jìn)行，將結(jié)果文件導(dǎo)出后使用TB tools進(jìn)行后續(xù)分析和繪圖。保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測結(jié)果顯示，5個(gè)成員均屬于YABBY家族（圖2A—B）。Motif分析結(jié)果顯示5個(gè)成員均含有Motif1和Motif3，Lchi28144的5′端無Motif2，推測由于序列不全導(dǎo)致。同一亞族的基因結(jié)構(gòu)相似，如Lchi23476和Lchi24373結(jié)構(gòu)相似，但與其他亞族基因結(jié)構(gòu)不同。Motif2代表C2C2鋅指結(jié)構(gòu)域的主要序列，Motif1代表YABBY結(jié)構(gòu)域的主要序列（圖2C）。

圖2 北美鵝掌楸YABBY家族進(jìn)化樹（A）及結(jié)構(gòu)域和基序分析（B, C）Fig.2 Phylogenetic trees (A), distribution of conserved domains and motifs (B, C) of YABBY proteins in L.tulipifera

2.2 北美鵝掌楸YABBY1,5基因全長克隆

根據(jù)北美鵝掌楸轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中的表達(dá)量，選擇2個(gè)差異表達(dá)顯著的YABBY家族基因進(jìn)行 克 隆：Lchi23476（LtYABBY1）和Lchi01041（LtYABBY5），獲得全長并分析蛋白的理化性質(zhì)。在擴(kuò)增LtYABBY5基因的中間片段時(shí)，已獲得完整ORF序列且序列正確，因此無須再進(jìn)ORF驗(yàn)證試驗(yàn)（圖1）。

LtYABBY1和LtYABBY5基因全長為1 255和1 078 bp，ORF分 別 為633和558 bp，分 別 編碼了210和185 aa。2個(gè)蛋白均為親水性蛋白，LtYABBY1蛋白總分子式為C1031H1613N295O307S9，分子量為23 341.48 Da，理論等電點(diǎn)為7.14，疏水性平均值為-0.312。LtYABBY5蛋白總分子式為C913H1439N261O273S14，分子量為20 888.89 Da，理論等電點(diǎn)為8.13，疏水性平均值為-0.295。

2.3 北美鵝掌楸YABBY1,5基因生物信息學(xué)分析

采用ProtScale在線軟件分析北美鵝掌楸YABBY蛋白疏水性，結(jié)果顯示LtYABBY1、LtYABBY5均為親水蛋白（圖2A）。分別通過ExPASy TMpred和TMHMM在線分析2個(gè)蛋白的跨膜區(qū)、跨膜方向，ExPASy TMpred結(jié)果表明，預(yù)測LtYABBY1、LtYABBY5均具有1個(gè)跨膜區(qū)，但TMHMM預(yù)測結(jié)果顯示，2個(gè)YABBY蛋白無跨膜區(qū)域。結(jié)合二者結(jié)果，北美鵝掌楸LtYABBY1、LtYABBY5為非跨膜蛋白（圖2B—C）。

登錄SOPMA和SWISS-MODEL網(wǎng)站在線預(yù)測YABBY蛋白質(zhì)的二級和三級結(jié)構(gòu)。YABBY1蛋白的α螺旋占22.86%，延伸鏈占11.90%，β轉(zhuǎn)角占4.29%，無規(guī)則卷曲占60.95%。YABBY5蛋白的α螺旋占24.32%，延伸鏈占17.30%，β轉(zhuǎn)角占5.41%，無規(guī)則卷曲占52.97%。

采用在線軟件SignalP-4.0 Server預(yù)測蛋白的信號肽，發(fā)現(xiàn)北美鵝掌楸的2個(gè)YABBY蛋白均不含信號肽及切割位點(diǎn)。蛋白亞細(xì)胞定位通過TargetP1.1 Server和WOLF PSORT在線軟件預(yù)測，預(yù)測LtYABBY1亞細(xì)胞定位結(jié)果為細(xì)胞核，LtYABBY5則是在細(xì)胞核、胞溶酶體等細(xì)胞器中均有定位，需要結(jié)合亞細(xì)胞定位試驗(yàn)來驗(yàn)證預(yù)測的結(jié)果（表3～4）。

表3 北美鵝掌楸YABBY蛋白亞細(xì)胞定位預(yù)測分析（TargetP1.1 Serve）Table 3 Prediction of the subcellular localization of YABBY proteins by the TargetP1.1 Serve online software %

表4 北美鵝掌楸YABBY蛋白亞細(xì)胞定位預(yù)測分析（WOLF PSORT）Table 4 Prediction of YABBY protein subcellular localization by WOLF PSORT online software

共下載14個(gè)與LtYABBY1同源性較高的蛋白序列，分別為麻雀花ArCRC（Aristolochia ringens，QKK36214.1）、沉水樟CmYABBY4（RWR87502.1）、蠟梅CpFIL（Chimonanthus praecox，AYO86708.1）、蓮NnYABBY4（XP_010264212.1）、橡膠樹HbYABBY1、HbYABBY4（XP_021635450.1、XP_021666324.1）、 葡 萄VvYABBY4（XP_002266233.1）、 木 薯MeYABBY1（XP_021622938.1）、可可樹TcYABBY1（Theobroma cacao，XP_007039924.1）、河岸葡萄VrYABBY1（XP_034702735.1）、黃麻CcYABBY（Corchorus capsularis，OMP02209.1）、博落回McYABBY（OVA06720.1）、開 心 果PvYABBY1（Pistacia vera，XP_031267772.1）、雷蒙德氏棉GrYABBY1（XP_012439507.1），他們之間的同源性高達(dá)88.21%。15個(gè)與LtYABBY5同源性較高的蛋白序列，分別為葡萄VvYABBY5（XP_002285328.1）、蠟梅CpYABBY5-1（AYO86711.1）、蓮NnYABBY 5（XP_010254434.1、XP_010250140.1、XP_010250138.1、XP_010250139.1）、 木 薯MeYABBY5（XP_021634503.1）、 沉水樟CmYABBY5（RWR77395.1）、哥倫比亞錦葵HuYABBY5（XP_021275879.1）、黃麻CcYABBY（OMO81141.1）、可可樹TcYABBY（EOY31098.1、XP_007013479.2）、 榴 蓮DzYABBY5（Durio zibethinus，XP_022730873.1）、麻風(fēng)樹JcYABBY5（XP_012078813.1）、橡膠樹HbYABBY5（XP_021650878.1），他們的同源性達(dá)81.34%。LtYABBY1和LtYABBY5蛋白均具有完整的C2C2鋅指結(jié)構(gòu)域（C-X2-C-X20-C-X1-H-C）和YABBY結(jié)構(gòu)域（圖3A—B）。

圖3 北美鵝掌楸YABBY蛋白的氨基酸序列比對Fig.3 Multiple alignment of the amino acid sequences of LtYABBY with other YABBY proteins

將北美鵝掌楸YABBY1,5蛋白與同源性較高的蛋白、擬南芥6個(gè)成員進(jìn)行進(jìn)化樹構(gòu)建，共31個(gè)蛋白序列（圖4）。結(jié)果顯示，LtYABBY1與麻雀花、蠟梅、沉水樟親緣關(guān)系較近，LtYABBY5與蓮、蠟梅、沉水樟的YABBY5蛋白親緣關(guān)系較近。

圖4 北美鵝掌楸YABBY蛋白的進(jìn)化樹構(gòu)建Fig.4 Construction of the phylogenetic tree of LtYABBY with other YABBY proteins

2.4 組織表達(dá)特異性分析

對北美鵝掌楸LtYABBY1,5基因進(jìn)行半定量PCR分析，其中，LtYABBY1基因在葉片、花芽、萼片和雌蕊中均有較亮條帶，而LtYABBY5基因僅在根和莖中無條帶，在其他6個(gè)組織中均有表達(dá)（圖5A）。實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果表明，LtYABBY1基因整體表達(dá)水平較高，尤其在花芽和雌蕊中大量表達(dá)，葉片和萼片中表達(dá)水平也較高，與半定量PCR結(jié)果一致，在花瓣中也有一定表達(dá)，莖次之；LtYABBY5基因整體表達(dá)水平較低，在葉片、花芽、雌蕊和萼片中均有少量表達(dá)（圖5B）。

圖5 北美鵝掌楸YABBY-like基因在不同組織中的表達(dá)量Fig.5 Detection of the expression of YABBY-like genes of L.tulipifera in different tissues

2.5 LtYABBY1,5亞細(xì)胞定位分析

亞細(xì)胞定位采用注射本氏煙草葉片的瞬時(shí)轉(zhuǎn)化表達(dá)法，取注射后的葉片于載玻片上，葉背面朝上，置于激光共聚焦顯微鏡下拍攝。根據(jù)北美鵝掌楸YABBY蛋白的亞細(xì)胞定位預(yù)測結(jié)果，推測LtYABBY1,5蛋白為核定位，因此對注射后的煙草葉片進(jìn)行DAPI染色，觀察時(shí)共使用5個(gè)通道，分別為DAPI、GFP自發(fā)熒光、明場Bright field、葉綠素?zé)晒釩hlorophyll和疊加場Merged。pBI121-eGFP為空載陽性對照，在細(xì)胞膜、細(xì)胞核、葉綠體等細(xì)胞器均可看到其熒光。LtYABBY1,5蛋白僅在細(xì)胞核上檢測到熒光信號，二者為核定位蛋白（圖6）。

圖6 北美鵝掌楸YABBY1,5蛋白的亞細(xì)胞定位Fig.6 The subcellular localization of LtYABBY1 and LtYABBY5 proteins

3 討 論

北美鵝掌楸中共鑒定到6個(gè)YABBY成員，屬于YABBY1/FILAMENTOUS FLOWER (FIL)、YABBY2、YABBY5共3個(gè)亞族，說明本物種中YABBY家族沒有發(fā)生基因擴(kuò)張。LtYABBYs基因編碼了164～212個(gè)氨基酸，與前人研究發(fā)現(xiàn)YABBY蛋白較小的結(jié)果一致。預(yù)測亞細(xì)胞定位于細(xì)胞核，符合轉(zhuǎn)錄因子的特性。外顯子數(shù)量為7個(gè)，與已有研究的物種相似，說明YABBY家族的結(jié)構(gòu)較為保守，推測功能也相對保守。

與擬南芥的5個(gè)亞族相比，北美鵝掌楸缺失CRC、INO亞族，二者均為花特異性YABBY基因，主要參與植物胚珠、心皮的發(fā)育調(diào)控[9-10]。CRC是在擬南芥中識別的首個(gè)與蜜腺發(fā)育密切相關(guān)的關(guān)鍵基因，crc突變體的蜜腺缺失，心皮不融合，果莢變粗變短[4,9]。水稻OsDL基因是AtCRC的同系物，其功能得到了深入研究，參與水稻花器官、葉片和芒的發(fā)育，dl突變體會(huì)導(dǎo)致心皮發(fā)育成雄蕊，葉片不能形成中脈[33]。毛茛目花菱草Eschscholtzia californica CRC同源基因在花發(fā)育的整個(gè)過程中表達(dá)，但在花開放期，僅在雌蕊中表達(dá)[34]?；勘蛔又参餆o油樟Amborella trichopoda的雌花中CRC同源基因的表達(dá)模式與其他被子植物中的表達(dá)模式相似，在雄花花絲中也鑒定出了AmbCRC轉(zhuǎn)錄本[35]。大多數(shù)木蘭類植物的CRC位于單子葉植物和雙子葉植物分支的基部，推測在單子葉植物和真雙子葉植物最近的共同祖先中可能發(fā)生重復(fù)事件，木蘭類植物與被子植物分離后CRC亞族發(fā)生了亞功能化和新功能化[36]。CRC亞族在心皮發(fā)育調(diào)控中的功能可能是被子植物中較原始的功能，其在蜜腺中的作用可能是進(jìn)化而來[2]。本研究在北美鵝掌楸轉(zhuǎn)錄組和鵝掌楸的基因組數(shù)據(jù)中沒有識別到CRC亞族基因，推測可能與植物的進(jìn)化過程相關(guān)。

北美鵝掌楸LtYABBY1在花芽和雌蕊中表達(dá)量極高，與水稻的YABBYs基因表達(dá)模式相似，說明北美鵝掌楸的YABBY1基因可能具有參與雌蕊形成和花器官發(fā)育的功能。綠竹Bambusa oldhamiiBoYAB1基因編碼167 aa，與水稻OsYABBY1的同源性為88.76%，異源表達(dá)分析和原位雜交結(jié)果表明，該基因可能參與了葉片發(fā)育和開花時(shí)間的調(diào)控[37]。玉米YABBY家族的ZmYAB1/12是水稻OsDL的同源基因，其表達(dá)具有明顯的組織特異性，除了ZmYAB1不在雌穗表達(dá)外，其余成員在生殖器官中的表達(dá)量均明顯高于營養(yǎng)器官。ZmYAB5/7/9/13基因整體表達(dá)水平比較高，而ZmYAB3/4/8基因則幾乎不表達(dá)[12]。北美鵝掌楸LtYABBY1基因整體表達(dá)水平較高，尤其是在繁殖器官花芽、雌蕊中大量表達(dá)。而LtYABBY5基因整體表達(dá)水平較低，與玉米的表達(dá)模式不同，具有物種特異性，不同植物間表達(dá)模式明顯不同，但在繁殖器官表達(dá)量是高于營養(yǎng)器官的。通過研究木蘭類植物的YABBY家族發(fā)現(xiàn)YABBY5不是雙子葉植物所特有的，在7個(gè)木蘭類植物中鑒別到22個(gè)YABBY5基因，說明YABBY5基因存在于基部被子植物、木蘭類植物和真雙子葉植物中，YABBY基因可能是來源于早期被子植物的YABBY5基因[36]。番茄SlYABBY5基因編碼182 aa，預(yù)測定位于細(xì)胞核，結(jié)果初步證實(shí)SlYABBY5參與番茄的生長發(fā)育和響應(yīng)非生物逆境脅迫[38]。小麥的YABBY家族成員在根中表達(dá)量偏低或不表達(dá)，在穗部和籽粒中的表達(dá)量高于其余組織，TaYAB1/2/6在穗部的表達(dá)量隨時(shí)間推移逐漸上升，TaYAB3/4/5在穗部的表達(dá)量隨時(shí)間推移呈下降趨勢[21]。小麥與北美鵝掌楸的YABBY基因表達(dá)模式有相似的地方，在營養(yǎng)器官中低表達(dá)。水稻的YABBY7主要在雌蕊中特異性表達(dá)，這表明YABBY7可能參與調(diào)控雌蕊的形成，YABBY1/2/6主要在花、葉鞘和胚乳中表達(dá)，YABBY3/4/5也主要在花器官和胚胎中表達(dá)[20]。以上研究結(jié)果表明，被子植物中YABBY家族成員的結(jié)構(gòu)和功能比較保守，但在進(jìn)化過程中基因也表現(xiàn)出了結(jié)構(gòu)和功能的多樣性。

本研究中北美鵝掌楸共鑒定到6個(gè)YABBY成員，僅克隆和分析了其中2個(gè)基因，其他成員未進(jìn)行進(jìn)一步分析。經(jīng)過分析發(fā)現(xiàn)LtYABBY1在花芽中特異表達(dá)，推測該基因可能參與了北美鵝掌楸花芽的早期分生組織的發(fā)育調(diào)控，但是后續(xù)功能驗(yàn)證試驗(yàn)尚未開展。北美鵝掌楸為蜜源植物，花蜜量豐富，目前已鑒定到Y(jié)ABBY家族的CRC基因?qū)γ巯侔l(fā)育極其重要，但卻未在北美鵝掌楸轉(zhuǎn)錄組中發(fā)現(xiàn)該成員，原因仍需要進(jìn)一步分析。下一步研究工作將繼續(xù)對YABBY家族成員進(jìn)行分析、鑒定和功能分析，以期為北美鵝掌楸發(fā)育調(diào)控提供理論支持。

4 結(jié) 論

北美鵝掌楸YABBY家族共6個(gè)成員，編碼了164～212 aa，外顯子7個(gè)，屬于YABBY1/FILAMENTOUS FLOWER (FIL)、YABBY2、YABBY5共3個(gè)亞類。克隆LtYABBY1,5基因的全長1 255、1 078 bp，分別編碼了210、188 aa，均為親水蛋白與非跨膜蛋白。LtYABBY1和LtYABBY5為核定位蛋白。LtYABBY1在北美鵝掌楸的花芽和雌蕊高表達(dá)，LtYABBY5整體表達(dá)水平較低，據(jù)此推測LtYABBY1可能參與了北美鵝掌楸花芽的早期分生組織的發(fā)育調(diào)控。