三陰性乳腺癌組織長鏈非編碼RNA-P21、microRNA-17-3p的表達及其臨床意義*

劉凡，施文瑜，劉益飛，王國華

（南通大學附屬醫(yī)院 1.腫瘤化療科，2.病理科，江蘇 南通 226001；3.南通大學特種研究所，江蘇 南通 226001）

三陰性乳腺癌占全部乳腺癌的10%～20%，侵襲性強、轉移率高，且臨床治療機會和時間窗有限，術后易復發(fā)，生存率較低[1]。長鏈非編碼RNA（long noncoding RNA，LncRNA）是長度大于200個核苷酸且不具編碼蛋白質功能的RNA，但可調節(jié)mRNA、microRNA的活性和穩(wěn)定性，在轉錄后發(fā)揮作用，幾乎參與細胞的所有生理活動，與膀胱癌、結直腸癌、乳腺癌等多種惡性腫瘤的發(fā)病和惡性進展有關[2]。LncRNA-P21是P53依賴性轉錄靶基因，參與細胞周期調控、代謝和重編程，與癌癥進展相關[3]。MicroRNA-17-3p（miR-17-3p）是一種致癌microRNA。有研究發(fā)現(xiàn)，miR-17-3p在多發(fā)性骨髓瘤中通過抑制LMLN基因下調P21表達，促使腫瘤細胞增殖[4]。本研究擬檢測三陰性乳腺癌組織中LncRNA-P21、miR-17-3p的表達，分析其與三陰性乳腺癌患者的臨床病理特征及預后的關系，以期為三陰性乳腺癌的治療和預后提供參考。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取2016年1月—2017年5月南通大學附屬醫(yī)院收治的106例三陰性乳腺癌患者經手術切除的癌組織和癌旁組織（距離癌組織至少5 cm）標本及患者的臨床資料。年齡51～65歲，平均（55.23±7.31）歲；乳腺腫塊直徑0.62～3.56 cm，平均（2.58±0.34）cm；分化程度：低、中度分化65例，高度分化41例；臨床分期：Ⅰ、Ⅱ期72例，Ⅲ期34例；腋窩淋巴結轉移31例，絕經43例；細胞增殖指數(shù)Ki-67陽性表達（≥ 30%）71例。納入標準：①術后病理提示免疫組織化學染色雌激素受體、孕激素受體陰性，熒光原位雜交提示人表皮生長因子受體2陰性，人表皮生長因子受體2/Neu基因無擴增；②病理資料完整，接受隨訪；③年齡≥ 18周歲。排除標準：①術前接受化療、放療、免疫等任何形式的抗腫瘤治療；②術前已經發(fā)生遠處轉移或此次因復發(fā)再次住院治療的患者；③Luminal型、Her-2型、basal-like型等其他類型乳腺癌。本研究已經獲得醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準[通大倫理（2018）20號]。

1.2 實時熒光定量聚合酶鏈反應檢測LncRNAP21、miR-17-3p表達

取手術切除的癌組織和癌旁組織石蠟標本，二甲苯脫蠟，無水乙醇脫二甲苯，選取100 mg勻漿研磨，離心棄上清液。TRIzol法（美國Invitrogen公司）提取總RNA，用紫外分光光度計（美國NanoDrop公司）分別在260 nm和280 nm處檢測吸光度，260/280 nm吸光度比值為1.8～2.0，取該比值區(qū)間的RNA進行后續(xù)實驗，采用M-MLV逆轉錄酶（美國Epicentre公司）逆轉錄為cDNA，反應條件：15℃ 30 min，45℃ 30 min，85℃ 5 min 滅 活。CFX96實時熒光PCR儀，美國Bio-Rad公司。采用實時熒光定量聚合酶鏈反應檢測LncRNA-P21、miR-17-3p表達，反應體系： cDNA 1 μL，正反向引物0.4 μL，2×TransTaq?Tip Green qPCR SuperMix 10 μL，Passive Reference Dye（50×）0.4 μL，最后添加ddH2O至20 μL；反應條件：50℃預變性2 min，97℃變性20 s，60℃退火20 s，70℃延伸15 s，共40個循環(huán)。引物序列由寶生物工程（大連）有限公司設計：LncRNA-P21正向5'-CCACATTGCTGTTCATCAC C-3'，反 向5'-TGAGCAAGCTAGTGGAAGCA-3'，引物長度20 bp；miR-17-3p正向5'-TGCGTTGACGTC ACTCCCG-3'，反 向5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3'，引物長度18 bp；U6正向5'-CTCGCTTCGGCAGCAC A-3'，反向5'-ACGCTTCACGAATTTGCGT-3'，引 物長度19 bp。以U6為內參，采用2-ΔΔCt法計算LncRNA-P21、miR-17-3p mRNA相對表達量。

1.3 隨訪

所有患者接受術后5年的電話或門診復查隨訪，統(tǒng)計無病生存期（DFS）、總生存期（OS）及預后。DFS定義為手術日至首次出現(xiàn)疾病復發(fā)或遠處轉移的時間，OS定義為手術日至或因疾病進展或其他任何原因引起死亡的時間。無復發(fā)、轉移和死亡為預后良好，復發(fā)、轉移和死亡為預后不良。

1.4 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 25.0統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，比較用t檢驗；相關分析用Pearson法；Kaplan-Meier法繪制生存曲線，比較用Log rank χ2檢驗；影響因素的分析用單因素或多因素Cox回歸模型。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 癌組織和癌旁組織LncRNA-P21、miR-17-3p mRNA相對表達量比較

癌組織與癌旁組織LncRNA-P21、miR-17-3p mRNA相對表達量比較，經t檢驗，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），癌組織LncRNA-P21 mRNA相對表達量低于癌旁組織，癌組織miR-17-3p mRNA相對表達量高于癌旁組織。見表1。

表1 癌組織和癌旁組織LncRNA-P21、miR-17-3p mRNA相對表達量比較 （n =106，±s）

表1 癌組織和癌旁組織LncRNA-P21、miR-17-3p mRNA相對表達量比較 （n =106，±s）

組別癌組織癌旁組織t 值P 值LncRNA-P21 mRNA 0.85±0.19 1.86±0.32 27.941 0.000 miR-17-3p mRNA 3.84±0.76 1.75±0.41 24.918 0.000

2.2 不同臨床病理特征三陰性乳腺癌組織LncRNA-P21和miR-17-3p mRNA相對表達量的比較

不同臨床分期、腋窩淋巴結轉移、Ki-67表達三陰性乳腺癌組織LncRNA-P21、miR-17-3p mRNA相對表達量比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；臨床Ⅲ期、有腋窩淋巴結轉移、Ki-67≥ 30%三陰性乳腺癌組織LncRNA-P21 mRNA相對表達量低于臨床Ⅰ、Ⅱ期，無腋窩淋巴結轉移和Ki-67＜ 30%；臨床Ⅲ期、有腋窩淋巴結轉移、Ki-67≥ 30%三陰性乳腺癌組織miR-17-3p mRNA相對表達量高于臨床Ⅰ、Ⅱ期，無腋窩淋巴結轉移和Ki-67＜30%。不同年齡、腫瘤直徑、分化程度、絕經狀態(tài)LncRNAP21、miR-17-3p mRNA相對表達量比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表2。

表2 不同臨床病理特征三陰性乳腺癌組織LncRNA-P21和miR-17-3p mRNA相對表達量的比較 （±s）

表2 不同臨床病理特征三陰性乳腺癌組織LncRNA-P21和miR-17-3p mRNA相對表達量的比較 （±s）

臨床病理特征年齡≤ 60歲＞ 60歲腫瘤直徑≤ 2 cm＞ 2 cm分化程度低、中度高度臨床分期Ⅰ、Ⅱ期Ⅲ期腋窩淋巴結轉移有無絕經是否Ki-67≥ 30%＜ 30%n 63 43 48 58 65 41 72 34 31 75 43 63 71 35 LncRNA-P21 mRNA 0.84±0.14 0.87±0.13 0.88±0.12 0.83±0.14 0.84±0.13 0.87±0.12 0.91±0.09 0.72±0.06 0.77±0.08 0.88±0.12 0.88±0.11 0.83±0.16 0.79±0.13 0.97±0.07 t 值1.115 1.951 1.191 11.178 4.685 1.781 7.651 P 值0.268 0.054 0.236 0.000 0.000 0.078 0.000 miR-17-3p mRNA 3.81±0.79 3.89±0.62 3.76±0.69 3.91±0.58 3.93±0.52 3.70±0.80 3.67±0.29 4.21±0.33 4.42±0.18 3.60±0.21 3.90±0.70 3.80±0.79 4.12±0.44 3.27±0.18 t 值0.557 1.216 1.795 8.557 19.030 0.670 10.964 P 值0.579 0.227 0.076 0.000 0.000 0.505 0.000

2.3 LncRNA-P21與miR-17-3p的相關性

Pearson相關性分析結果顯示，三陰性乳腺癌組織的LncRNA-P21表達與miR-17-3p表達呈負相關（r=-0.570，P=0.000）。見圖1。

圖1 LncRNA-P21與miR-17-3p相關性的散點圖

2.4 不同LncRNA-P21、miR-17-3p表達三陰性乳腺癌患者的生存分析

隨訪期間，106例患者復發(fā)11例，遠處轉移14例，死亡17例。以三陰性乳腺癌組織LncRNA-P21 mRNA相對表達量的均值0.85為臨界值，分為高表達組和低表達組；LncRNA-P21低表達組的5年DFS、OS生存率低于LncRNA-P21高表達組（χ2=4.952和3.900，P=0.014和0.029）。以三陰性乳腺癌組織miR-17-3p mRNA相對表達量的均值3.84為臨界值，分為高表達組和低表達組；miR-17-3p高表達組的5年DFS、OS生存率低于miR-17-3p低表達組（χ2=4.782和3.873，P=0.019和0.031）。見圖2。

圖2 不同LncRNA-P21、miR-17-3p表達三陰性乳腺癌患者的生存曲線

2.5 影響三陰性乳腺癌患者預后的因素分析

以三陰性乳腺癌患者預后為因變量（0 =預后良好，1 =預后不良），以年齡（0 = ≤ 60歲，1 = ＞60歲）、腫瘤直徑（0 = ≤ 2 cm，1 = ＞ 2 cm）、分化程度（0 =高度分化，1 =低、中度分化）、臨床分期（0 =Ⅰ、Ⅱ期，1 =Ⅲ期）、腋窩淋巴結轉移（0 =無，1 =有）、絕經（0 =否，1=是）、Ki-67（實測值）、LncRNA-P21（實測值）、miR-17-3p（實測值）為自變量，納入單因素Cox回歸模型，結果顯示，分化程度、臨床分期、腋窩淋巴結轉移、LncRNAP21、miR-17-3p是三陰性乳腺癌患者預后的影響因素（P＜0.05）（見表3）。將分化程度、臨床分期、腋窩淋巴結轉移、LncRNA-P21、miR-17-3p納入多因素Cox風險比例回歸模型，α入=0.05、α出=0.10，結果顯示，腋窩淋巴結轉移、miR-17-3p為三陰性乳腺癌患者預后不良的危險因素（P＜0.05），LncRNA-P21為保護因素（P＜0.05）（見表4）。

表3 影響三陰性乳腺癌患者預后的單因素Cox回歸模型參數(shù)

表4 影響三陰性乳腺癌患者預后的多因素Cox風險比例回歸模型參數(shù)

3 討論

三陰性乳腺癌是一種高度侵襲性的乳腺癌亞型，與其他病理類型的乳腺癌相比，三陰性乳腺癌往往發(fā)病年齡更小，組織學分級更高，腫瘤體積更大，復發(fā)和遠處轉移傾向更大，預后更差[5-6]。目前盡管分子靶向、免疫在乳腺癌治療中取得了較大的進展，但是對三陰性乳腺癌患者來講，上述治療方案并未能顯著提高患者的生存率，即便是早期三陰性乳腺癌患者化療后緩解，但仍可能復發(fā)和轉移，而發(fā)生轉移性病變患者的總生存期僅13～18個月[7]。非編碼RNA約占人類DNA的98%，在表觀遺傳調控，染色質修飾、轉錄和翻譯等發(fā)揮關鍵作用，與癌癥發(fā)生和進展密切相關。非編碼RNA主要包括LncRNA和miRNA。其中，miRNA是22 nt長的非編碼RNA，主要通過與靶標mRNA的3'非翻譯區(qū)的靶位點結合誘導基因轉錄。LncRNA是miRNA的前體，通過調節(jié)miRNA表達調控RNA甲基化、組蛋白修飾、染色質重塑等[8]。有研究發(fā)現(xiàn)LncRNA和miRNA失調均與乳腺癌發(fā)生及預后有關[9]。

LncRNA-P21是一種新的細胞增殖和凋亡的調節(jié)因子，位于17號染色體，作為P53的直接轉錄靶標，LncRNA-P21可通過直接與E3泛素蛋白連接酶結合，導致P53從E3泛素蛋白連接酶中釋放并與P300結合繼而增強P53的活性，從而調節(jié)細胞周期和介導P53依賴性細胞凋亡，抑制細胞增殖[10-11]。研究顯示，LncRNA-P21在食管癌、膀胱癌、直腸癌等多種實體腫瘤中表達下調，發(fā)揮抑癌基因作用，LncRNA-P21通過上調P21表達或通過P53非依賴性途徑抑制細胞周期蛋白Cyclin D的表達，誘導G1期阻滯，促使食管癌細胞凋亡[12]。LncRNAP21還可通過抑制谷氨酰胺酶和谷氨酰胺分解代謝抑制膀胱癌細胞生長[13]。LncRNA-P21高表達可提高直腸癌對術后放療的敏感性，延長患者的總生存期[14]。本研究發(fā)現(xiàn)LncRNA-P21在三陰性乳腺癌組織中表達下調，LncRNA-P21低表達與Ki-67≥30%、臨床Ⅲ期、腋窩淋巴結轉移，以及更低的5年DFS和OS生存率有關，提示LncRNA-P21低表達可能促使乳腺癌細胞增殖、侵襲和轉移，與三陰性乳腺癌預后不良有關。LncRNA-P21在三陰性乳腺癌的發(fā)病機制尚不明確，可能為LncRNA-P21低表達介導癌基因MDM2引發(fā)蛋白酶體依賴性降解P53，激活核因子-κB和轉錄信號轉導子和激活子3通路，促使巨噬細胞向促炎性M1表型轉化，誘導腫瘤微環(huán)境改變，繼而促使乳腺癌進展[15]。

miR-17-3p由前體miR-17的3'臂加工而成，可促進細胞增殖和抑制細胞死亡，在細胞增殖分化、凋亡和遷移過程中發(fā)揮重要作用[16-17]。miR-17-3p在結腸癌、前列腺癌等多種惡性腫瘤中表達上調，通過靶向抑制Par4表達促使結腸癌細胞存活和增殖[18]，還可通過靶向金屬蛋白酶組織抑制劑3誘導前列腺腫瘤細胞生長和侵襲[19]。本研究結果顯示，與癌旁組織比較，三陰性乳腺癌組織miR-17-3p表達上調，且miR-17-3p高表達與Ki-67≥ 30%、臨床Ⅲ期、有腋窩淋巴結轉移有關，表明miR-17-3p過表達可能促使乳腺癌細胞惡性增殖，miR-17-3p在三陰性乳腺癌中可能為致癌基因。本研究結果發(fā)現(xiàn)，miR-17-3p高表達與5年DFS和OS低生存率有關，miR-17-3p是乳腺癌患者預后不良的危險因素，提示其與三陰性乳腺癌預后不良有關，可作為乳腺癌預后評估的參考指標。miR-17-3p參與三陰性乳腺癌的機制可能為：miR-17-3p過表達可能下調E-上皮鈣黏附素表達，上調波形蛋白表達，促使乳腺癌細胞增殖，增加集落形成數(shù)量，增強侵襲和遷移能力[20]，進而促使三陰性乳腺癌病情進展。本研究相關性分析結果顯示，LncRNA-P21表達與miR-17-3p表達呈負相關，表明在三陰性乳腺癌發(fā)病機制中LncRNA-P21和miR-17-3p可能存在相互調控作用機制。敖翔等[20]也指出LncRNA-P21可負性調控miR-17-3p，LncRNA-P21表達缺失可促使miR-17-3p過表達，進而促使乳腺癌細胞增殖，抑制其凋亡，導致癌細胞的侵襲和遷移。

綜上所述，三陰性乳腺癌組織LncRNA-P21表達下調，miR-17-3p表達上調；LncRNA-P21低表達、miR-17-3p高表達可能與乳腺癌細胞的增殖、侵襲、轉移等惡性行為有關，是三陰性乳腺癌預后的影響因素；LncRNA-P21可能通過負向調控miR-17-3p表達促使三陰性乳腺癌進展。