乳桿菌耐藥風(fēng)險(xiǎn)及其藥敏檢測標(biāo)準(zhǔn)

宋可 王俊豪 萬曉寶 郝海紅

摘要：本文簡述了乳桿菌作為益生菌的商業(yè)應(yīng)用情況和作為致病菌造成臨床感染的致病情況及乳桿菌耐藥傳播風(fēng)險(xiǎn)，總結(jié)了與乳桿菌相關(guān)的4個(gè)國際權(quán)威機(jī)構(gòu)對(duì)其制定的抗菌藥敏試驗(yàn)（antimicrobial susceptibility test， AST）標(biāo)準(zhǔn)程序方法，對(duì)近15年內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)的乳桿菌耐藥表型、基因型進(jìn)行了匯總。發(fā)現(xiàn)在我國，對(duì)嗜酸乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、羅伊乳桿菌和植物乳桿菌的應(yīng)用最多，乳桿菌可能聯(lián)合其他致病菌對(duì)免疫低下者造成合并感染，但總體而言乳桿菌的致病風(fēng)險(xiǎn)較低，乳桿菌的可轉(zhuǎn)移耐藥問題更值得關(guān)注，目前發(fā)現(xiàn)的乳桿菌的耐藥基因包括tet、van、erm、mef、gyr、par、aad、aph、ant、aac、sul、dfr、cat、fex、rpo、mef和lnu等。值得關(guān)注的是，乳桿菌存在與四環(huán)素、紅霉素和氯霉素相關(guān)的抗性基因（tet、erm和cat）的轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)，4個(gè)組織機(jī)構(gòu)制定的抗菌藥敏試驗(yàn)方法在藥敏肉湯和選擇測試藥物上存在主要差異。

關(guān)鍵詞：乳桿菌抗菌藥敏試驗(yàn)；國際乳品聯(lián)合會(huì)；益生菌

中圖分類號(hào)：S859文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

Risk of Lactobacillus drug resistance and standards for its antibiotic susceptibility test

Song Ke1，2， Wang Junhao1，2， Wan Xiaobao1，2， and Hao Haihong1，2，3，4

（1 State Key Laboratory of Agricultural Microbiology， Huazhong Agricultural University， Wuhan 430070;

2 MOA Laboratory for Risk Assessment of Quality and Safety of Livestock and Poultry Products， Huazhong Agricultural University， Wuhan 430070; 3 Huazhong Agricultural University， Shenzhen Institute of Nutrition and Health， Shenzhen 518000;

4 Shihezi University， Shihezi 832000）

Abstract This paper briefly describes the commercial application of Lactobacillus as a probiotic， the pathogenic situation of clinical infections caused by Lactobacillus as a pathogenic bacteria， and the risk of Lactobacillus drug resistance transmission. It also summarizes the standard procedure methods of the antimicrobial susceptibility test （AST） developed by four international authorities related to Lactobacillus and collects the Lactobacillus resistance phenotypes and genotypes from research in the last 15 years. It was found that in China， Lactobacillus rhamnosus， Lactobacillus acidophilus， Lactobacillus reuteri and Lactobacillus plantarum are most used. Lactobacillus may combine with other pathogenic bacteria to cause co-infection in immunocompromised people， but overall， Lactobacillus has a low risk of causing disease. The transferable drug resistance of Lactobacillus is more worthy of attention， and the drug resistance genes of Lactobacillus found so far include tet， van， erm， mef， gyr， par， aad， aph， ant， aac， sul， dfr， cat， fex， rpo， mef， lnu， etc. It is concerned that the risk of transfer of resistance genes associated with tetracycline， erythromycin， and chloramphenicol in Lactobacillus （tet， erm， cat）， and the main differences in antimicrobial susceptibility testing methods developed by the four organizing institutes are in the drug-sensitive broth and the selection of the test drug.

Key words Lactobacillus antimicrobial susceptibility test; International dairy federation; Probiotics

乳桿菌屬在分類學(xué)上十分復(fù)雜，包括260多個(gè)物種，是乳酸菌中最大的群體，這些物種在表型上不容易區(qū)分，常需進(jìn)行分子鑒定[1]。一部分乳桿菌是人類正常菌群的組成部分，傳統(tǒng)意義上乳桿菌在人體腸道菌群中通常扮演著有益菌的角色，對(duì)維持健康人體腸道平衡起到重要作用，因此乳桿菌被廣泛用于各種商業(yè)產(chǎn)品中，如益生菌保健品、發(fā)酵食品等[2]。在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，一方面，乳桿菌作為益生菌與抗生素聯(lián)合使用，可用于預(yù)防抗生素相關(guān)性腹瀉（antibiotic-associated diarrhea， AAD）、艱難梭菌感染（Clostridium difficile infection， CDI）等胃腸道疾病；另一方面，臨床上，特別是重癥加強(qiáng)護(hù)理病房（intensive care unit， ICU）里，近年發(fā)現(xiàn)的多起乳桿菌感染情況，使得乳桿菌菌屬“安全”的地位動(dòng)搖[3]。

相對(duì)于傳統(tǒng)致病菌而言，關(guān)于乳桿菌耐藥和耐藥轉(zhuǎn)移的研究較少且標(biāo)準(zhǔn)分散[4]，本文闡述并比較了美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)（Clinical and Laboratory Standards Institute， CLSI）、歐盟藥敏試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)（European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing， EUCAST）、歐洲食品安全局（European Food Safety Authority， EFSA）[5]、國際乳品聯(lián)合會(huì)（International Dairy Federation， IDF）4個(gè)機(jī)構(gòu)根據(jù)不同分類標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)乳桿菌提出的抗菌藥敏試驗(yàn)（antimicrobial susceptibility test， AST）標(biāo)準(zhǔn)程序方法，另外對(duì)我國常用幾種益生乳桿菌的商業(yè)應(yīng)用狀況、國內(nèi)外乳桿菌臨床發(fā)生的感染情況、耐藥風(fēng)險(xiǎn)情況作出了整理匯總，以期為更好地了解乳桿菌的耐藥現(xiàn)狀，更規(guī)范的進(jìn)行乳桿菌的抗菌藥敏試驗(yàn)，更安全的應(yīng)用乳桿菌提供科學(xué)參考依據(jù)。

1 常用乳桿菌分類

乳桿菌不僅存在于環(huán)境和各種食品（主要是乳制品、發(fā)酵食品）中，在人類胃腸道中也廣泛分布。目前已從腸道中分離出了發(fā)酵乳桿菌、植物乳桿菌、干酪乳桿菌和鼠李糖乳桿菌等[6]，從胃黏膜中分離出了安特里乳桿菌、胃乳桿菌和羅伊乳桿菌等[7]，從陰道中分離出了卷曲桿菌、詹氏乳桿菌、陰道乳桿菌和惰性乳桿菌等[8]，嗜酸乳桿菌天然存在于人和動(dòng)物的胃腸道和口腔中，一般來說，最常見的人類臨床分離株是鼠李糖乳桿菌和干酪乳桿菌[9]。

由于乳桿菌屬種類繁多，對(duì)其抗生素耐藥的研究一直較為困難，2020年國際上基于全基因組測序技術(shù)對(duì)乳桿菌屬進(jìn)行了拆分，將原乳桿菌屬的260多個(gè)物種重新劃分歸為25個(gè)屬[10-11]，并在相關(guān)的國際食品和貿(mào)易領(lǐng)域中開始使用，這有利于開展對(duì)乳桿菌系統(tǒng)的耐藥研究。我國對(duì)新劃分的已經(jīng)修改名稱的菌種，基于其拉丁文名稱的原始詞根、結(jié)合國際上對(duì)該詞根的注解進(jìn)行中文翻譯，給出了新規(guī)范的菌屬和菌種的中文名[12]。

基于我國乳桿菌的應(yīng)用情況，綜合參考《飼料添加劑品種目錄》[13]、《可用于食品的菌種名單》&《可用于嬰幼兒食品的菌種名單》[14]、《可用于保健食品的益生菌菌種名單》[15]3個(gè)法規(guī)文件，并結(jié)合當(dāng)前的研究熱點(diǎn)，總結(jié)了18種常用乳桿菌的新規(guī)范拉丁學(xué)名、中文名及法規(guī)允許的應(yīng)用方向，如表1所示。其中嬰幼兒食品允許添加的益生菌明確到具體菌株，這種帶編號(hào)的菌株是獲得了國際多個(gè)監(jiān)督機(jī)構(gòu)認(rèn)證安全的，如美國食品藥品監(jiān)督管理局（Food and Drug Administration， FDA）認(rèn)證的“公認(rèn)安全”（Generally Recognized as Safe， GRAS）資格，在表中進(jìn)行相關(guān)標(biāo)注。

由表1可以看出我國法律規(guī)范中，嗜酸乳桿菌、羅伊乳桿菌、德氏乳桿菌保加利亞亞種和干酪乳桿菌被允許在飼料添加（獸用）、食品（人用）和保健品中使用，應(yīng)用面最廣，鼠李糖乳桿菌是研究最深入的益生菌種類之一，在明確規(guī)定可用于嬰幼兒食品的7株乳桿菌中，鼠李糖乳桿菌占據(jù)了3/7。我國為菌株的名稱更替設(shè)置了2年的過渡期，過渡期內(nèi)新舊菌種名稱均可以使用，在本文之后的討論中，為了便捷，依然使用舊命名進(jìn)行敘述。

2 乳桿菌的商業(yè)應(yīng)用情況

乳桿菌是具有益生潛力的菌種儲(chǔ)存庫，作為一種優(yōu)質(zhì)添加劑，在食品和醫(yī)療領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景。

在發(fā)酵食品中：長期應(yīng)用于風(fēng)味發(fā)酵食品的開發(fā)和制作，包括乳制品（酸奶、奶酪、黃油）、魚/肉制品（香腸、火腿、臘肉）、腌菜制品（酸黃瓜、泡菜、橄欖）以及特殊食品（咖啡豆、發(fā)酵調(diào)味品、發(fā)酵酒）等[16]。在中國，乳桿菌還應(yīng)用在一些大豆制品，如臭豆腐、腐乳、毛豆腐中，也參與一些發(fā)酵面包食品的制作，如米糕和饅頭等[17]。

在醫(yī)療、保健品領(lǐng)域：國際范圍內(nèi)益生菌對(duì)宿主健康的影響已在預(yù)防/治療各種不同病癥方面得到了證實(shí)，例如腸道感染和幽門螺桿菌胃感染等[18]。得益于篩選菌株的優(yōu)秀抗逆性和固有耐藥性，在美國、歐洲等發(fā)達(dá)國家和地區(qū)，常將益生菌與抗菌藥物聯(lián)合應(yīng)用降低AAD和CDI的發(fā)病率[19]，一項(xiàng)針對(duì)兒童的大型Meta分析也指出益生乳桿菌對(duì)預(yù)防AAD有長久作用[20]。參考FDA的乳桿菌菌株GRAS認(rèn)證名錄，查詢?nèi)蚴秤靡嫔淆堫^企業(yè)信息，篩選出有相關(guān)實(shí)驗(yàn)性文獻(xiàn)報(bào)告在30篇以上，應(yīng)用方向不同的典型益生乳桿菌菌株[21-23]，列舉如下：由表2可以看出國際上典型乳桿菌的益生效應(yīng)綜合體現(xiàn)在對(duì)口腔、鼻腔黏膜，皮膚炎癥、濕疹，呼吸道疾病，消化道疾病，免疫系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)的調(diào)節(jié)上。

對(duì)國內(nèi)乳桿菌相關(guān)藥物、保健品和飼料添加劑進(jìn)行查詢：在中國國家藥品監(jiān)督管理局查詢到9款含有乳桿菌的藥物，其中明確標(biāo)注包含嗜酸乳桿菌的有6款，包含德氏乳桿菌的有1款，還有1款含有乳酸乳桿菌，在國家市場監(jiān)督管理總局-特殊食品信息查詢平臺(tái)中查詢發(fā)現(xiàn)了98款益生菌保健品，其中68款明確標(biāo)注包含嗜酸乳桿菌，8款包含鼠李糖乳桿菌，3款包含干酪乳桿菌，3款包含植物乳桿菌，2款包含羅伊乳桿菌，2款包含瑞士乳桿菌，2款包含副干酪乳桿菌，2款包含羅伊乳桿菌，1款包含發(fā)酵乳桿菌，1款包含德氏乳桿菌，在農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳（湖北）查詢2018年上下半年對(duì)飼料添加劑產(chǎn)品的審批共341個(gè)，包含38個(gè)乳酸菌產(chǎn)品，其中有13個(gè)產(chǎn)品添加了植物乳桿菌，1個(gè)產(chǎn)品添加了干酪乳桿菌，其余產(chǎn)品未知。綜合而言，我國審批和應(yīng)用較多的益生乳桿菌是嗜酸乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、羅伊乳桿菌和植物乳桿菌。

3 乳桿菌的致病與耐藥潛在風(fēng)險(xiǎn)

根據(jù)世界衛(wèi)生組織（World Health Organization， WHO）和聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織（Food and Agriculture Organization of the United Nations， FAO）聯(lián)合發(fā)布的2002年報(bào)告[24]，乳桿菌可能通過造成全身感染、進(jìn)行有害的代謝活動(dòng)、使敏感個(gè)體的受到過度免疫刺激等途徑對(duì)人體健康造成威脅。

雖然乳桿菌是正常人類共生菌群的一部分，致病潛力極低，但仍有研究從人類感染中分離出了乳桿菌。大多數(shù)乳桿菌感染被歸類為內(nèi)源性感染，但其中一些也與使用含有乳桿菌的益生菌產(chǎn)品有關(guān)[25]，例如2022年一份報(bào)告指出一例乳桿菌菌血感染的病例，患者在給予鼠李糖乳桿菌治療后出現(xiàn)了菌血感染[26]。

乳酸桿菌病原體很少感染免疫功能正常的人類，但在免疫功能低下的患者中容易引起臨床侵襲性感染，2018年阿根廷舉行了一項(xiàng)調(diào)查臨床感染乳桿菌的研究[27]，從菌血癥（占比67%）等炎癥疾病和糖尿病等慢性疾病患者的患處中分離出了乳桿菌，其中鼠李糖乳桿菌的分離率最高，其次是發(fā)酵乳桿菌、副干酪乳桿菌、加塞里乳桿菌和內(nèi)氏乳桿菌[27]。由乳桿菌單獨(dú)引起嚴(yán)重感染的報(bào)道較少，通常是伴隨其他菌種的合并感染情況，主要引起心內(nèi)膜炎、菌血癥和胸膜肺炎等局部感染[28]，由乳桿菌單獨(dú)（無論是內(nèi)源或是外源益生菌補(bǔ)劑）引起的嚴(yán)重感染的情況尚無臨床報(bào)告，因此我們認(rèn)為乳桿菌的致病風(fēng)險(xiǎn)較低，只需對(duì)免疫功能低下的患者考慮乳桿菌致病問題。

乳桿菌對(duì)人類健康的最大威脅不在于其本身引起的疾病問題，而在于其耐藥轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)[29]：耐藥基因可能會(huì)傳遞給致病菌，造成致病菌的多重耐藥，發(fā)酵食品或其他乳桿菌添加產(chǎn)品可能成為抗生素耐藥性從非致病菌傳播給消費(fèi)者的關(guān)鍵傳播渠道[30]?；蚪M中可移動(dòng)組分是細(xì)菌獲得性耐藥性的主要來源，也被稱作是抗生素耐藥基因（antibiotic resistance genes， ARGs）[31]，通常，水平基因轉(zhuǎn)移是ARGs轉(zhuǎn)移的主要方式，由移動(dòng)基因元件（MGEs）介導(dǎo)[32]。理論上含有ARGs的益生菌可能成為潛在致病菌抗生素抗性基因的來源。

2022年一項(xiàng)針對(duì)分析126個(gè)完整的益生菌細(xì)菌基因組的抗生素抗性基因分析的研究，使用了全基因組序列分析來測定全部細(xì)菌的抗生素抗性基因[33]，測出的有關(guān)乳桿菌的ARGs為：Lactobacillus： vat（E）， tet（L）， tetW， dfrG和dfrK。

用生物信息法分析乳桿菌耐藥基因：在NCBI數(shù)據(jù)庫中以Lactobacillus， Lacticaseibacillus， Limosilactobacillus， Lactiplantibacillus， Ligilactobacillus， Latilactobacillus和Lentilactobacillus為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索（截止至2022年12月8日），得到175株乳桿菌的全基因測序結(jié)果，下載FASTA格式的基因組并上傳至CARD數(shù)據(jù)庫進(jìn)行相關(guān)耐藥基因分析。發(fā)現(xiàn)這175株公開信息的乳桿菌中有13株含有耐藥基因，在這13株有2株值得關(guān)注。根據(jù)我國法規(guī)適用于人/獸的乳桿菌菌株，分別是卷曲乳桿菌DC21.1（被預(yù)測含有ErmB、InuC和tet（W/N/W）耐藥基因）和約氏乳桿菌GHZ10a（被預(yù)測含有ErmB、fexA、tet（W/N/W）耐藥基因），其他11株乳桿菌菌株還被預(yù)測含有vanI、tetM和tetO等耐藥基因。

由此可見乳桿菌確實(shí)存在耐藥現(xiàn)象，為評(píng)估商用乳桿菌的耐藥風(fēng)險(xiǎn)及轉(zhuǎn)移可能性，對(duì)乳桿菌進(jìn)行抗生素敏感性試驗(yàn)（AST）是非常必要的。

4 乳桿菌的抗生素敏感性試驗(yàn)（AST）

相對(duì)于其他細(xì)菌，進(jìn)行乳桿菌的AST有3個(gè)問題：①藥敏肉湯的選擇：乳桿菌屬于苛養(yǎng)菌，常規(guī)的藥敏肉湯（MH肉湯）無法提供給乳桿菌適宜的生長環(huán)境，但乳桿菌培養(yǎng)通用的MRS肉湯卻對(duì)多種藥物的活性有影響；②藥物的選擇：考慮到乳桿菌耐藥基因轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)的問題，需要對(duì)更多種類的藥物進(jìn)行試驗(yàn)；③耐藥折點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)：乳桿菌屬所包含菌種種類多，基因差距大，個(gè)體之間耐藥差異大，其耐藥折點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)的選擇是一個(gè)復(fù)雜的問題。

因此關(guān)于乳桿菌的AST，除了參考目前全球公認(rèn)的兩大折點(diǎn)制定權(quán)威機(jī)構(gòu)——CLSI和EUCAST外，還可以參考其他兩個(gè)國際食品組織：一是EFSA屬下的動(dòng)物飼料添加劑和產(chǎn)品或物質(zhì)小組（The Panel on Additives and Products or Substances used in Animal Feed， FEEDAP）給出的EFSA-FEEDAP指南[34]；第二個(gè)是IDF，IDF成立了專門的委員會(huì)制定乳品的分析方法和其他方面的標(biāo)準(zhǔn)，直接參與國際標(biāo)準(zhǔn)化組織（International Organization for Standardization， ISO）、國際食品法典委員會(huì) （Codex Alimentarius Commission， CAC）的國際標(biāo)準(zhǔn)制定工作，在乳桿菌抗菌藥敏方面，IDF聯(lián)合ISO推出了ISO10932/IDF233標(biāo)準(zhǔn)，用于規(guī)范對(duì)奶和奶制品中雙歧桿菌和乳酸菌的MIC測定。下面分別進(jìn)行敘述。

4.1 CLSI對(duì)乳桿菌AST的標(biāo)準(zhǔn)

CLSI推出文件標(biāo)準(zhǔn)CLSI M45（更新于2016年8月15日）[35]，對(duì)多種少見細(xì)菌/苛養(yǎng)菌給出了藥敏紙片法和肉湯稀釋法所考慮的測試藥物和相關(guān)折點(diǎn)，在M45文件中，CLSI重點(diǎn)考慮從人類感染臨床中分離的乳桿菌株，關(guān)注機(jī)會(huì)致病乳桿菌引起的免疫力低下患者的感染情況，對(duì)這種臨床致病乳桿菌，給出了9種藥物建議進(jìn)行AST，并給出折點(diǎn)，如下表3所示。

CLSI M45建議，針對(duì)乳桿菌感染首選藥物為青霉素或氨芐西林，制定的利奈唑胺和萬古霉素折點(diǎn)參照葡萄球菌，其他藥物（除外克林霉素、亞胺培南、美羅培南）參照腸球菌。雖然乳桿菌屬于厭氧菌，但鼠李糖乳桿菌、干酪乳桿菌和發(fā)酵乳桿菌等在有氧環(huán)境下依然可以生存，M45指出在有氧環(huán)境下生長良好的乳桿菌菌種對(duì)萬古霉素是天然耐藥，而嚴(yán)格厭氧的乳桿菌往往對(duì)萬古霉素敏感，如約氏乳桿菌、卷曲乳桿菌等。

4.2 EUCAST對(duì)乳桿菌AST的標(biāo)準(zhǔn)

EUCAST對(duì)所有細(xì)菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)都匯總在其官方網(wǎng)址https：//www.eucast.org/上[36]，將乳桿菌歸為革蘭陽性厭氧菌范疇進(jìn)行考慮，如表4所示，是EUCAST提出的對(duì)于革蘭陽性厭氧菌進(jìn)行AST試驗(yàn)推薦的藥物和折點(diǎn)。

可以看出EUCAST相對(duì)于CLSI，考慮了更多的青霉素類抗生素和氯霉素，沒有考慮達(dá)托霉素和利奈唑胺。對(duì)耐青霉素的折點(diǎn)判定是兩個(gè)組織意見相差最大的地方，EUCAST給出的MIC值更低。

4.3 EFSA對(duì)乳桿菌AST的標(biāo)準(zhǔn)

EFSA屬下的EEDAP小組給出了兩個(gè)相關(guān)指南[29]，EFSA-FEEDAP指南[37-38]：①Guidance on the Characterisation of Microorganisms Used as Feed Additives or as Production Organisms（用作飼料添加劑或生產(chǎn)用生物體的微生物的特征定性指南），用于指導(dǎo)和審核含有活菌成分的動(dòng)物飼料添加劑或生產(chǎn)用微生物；②Guidance on the Assessment of Bacterial Susceptibility to Antimicrobials of Human and Veterinary Importance（細(xì)菌對(duì)人類和獸醫(yī)重要抗菌藥物的敏感性評(píng)估指南），用于對(duì)故意引入食物鏈（人/動(dòng)物）的細(xì)菌進(jìn)行安全性審核。

根據(jù)EFSA-FEEDAP指南，乳桿菌的固有耐藥不被視為安全問題，重點(diǎn)應(yīng)該關(guān)注的是其獲得性耐藥性的情況。EFSA-FEEDAP建議使用全基因組序列法（genome-wide sequencing ， WGS），以確定乳桿菌是否存在抗生素抗性基因。用WGS尋找抗生素抗性基因還可以識(shí)別出與耐藥基因相似的易突變基因，發(fā)現(xiàn)沉默的耐藥基因，這些基因在乳桿菌中的表達(dá)可能受到了抑制，但如果轉(zhuǎn)移到其他物種，或許會(huì)被激活。

EFSA-FEEDAP小組重點(diǎn)關(guān)注菌株是否有獲得性耐藥，定義了乳桿菌對(duì)9種藥物的“微生物臨界值”（microbiological cut-off values），如表5所示，此臨界值可用于區(qū)分敏感菌種和獲得性耐藥菌株[37]，

對(duì)于應(yīng)用乳桿菌，要求提供WGS數(shù)據(jù)，并進(jìn)行AST，測定乳酸菌的MIC值，與微生物臨界值進(jìn)行對(duì)比，以判斷菌株是否有獲得性耐藥風(fēng)險(xiǎn)。

由表5可知，相對(duì)于CLSI和EUCAST兩個(gè)組織，EFSA-FEEDAP小組多考慮了四環(huán)素和3種氨基糖苷類藥物（慶大霉素、卡那霉素、鏈霉素），并且對(duì)氨基糖苷類藥物給出的微生物臨界值較高。

4.4 IDF對(duì)乳桿菌AST的標(biāo)準(zhǔn)

IDF推出ISO 10932/IDF 233標(biāo)準(zhǔn)[39]：Milk and milk products - Determination of the minimal inhibitory concentration （MIC） of antibiotics applicable to bifidobacteria and non-enterococcal lactic acid bacteria （LAB），以對(duì)乳制品中乳酸菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。IDF提出 “流行病學(xué)臨界值”（epidemiological cut-off value）概念，用于區(qū)分野生型（敏感）和非野生型菌株（有獲得性耐藥），這個(gè)概念與EFSA-FEEDAP小組的“微生物臨界值”相似。

ISO 10932/IDF 233標(biāo)準(zhǔn)主要針對(duì)乳和乳制品中的乳酸菌，包括短乳桿菌、植物乳桿菌、戊糖乳桿菌、德氏乳桿菌、清酒乳桿菌、其他乳桿菌和雙歧桿菌、嗜熱鏈球菌、乳酸乳球菌等。測試藥物選擇了慶大霉素、卡那霉素、鏈霉素、新霉素、四環(huán)素、紅霉素、克林霉素、氯霉素、氨芐西林、萬古霉素、利奈唑胺、甲氧芐啶、環(huán)丙沙星、利福平和奎奴普丁/達(dá)福普汀。用IDF標(biāo)準(zhǔn)程序可以測定乳桿菌MIC值，但I(xiàn)DF并未給出不同乳桿菌的MIC折點(diǎn)解釋標(biāo)準(zhǔn)，而是建議將結(jié)果提交給EUCAST進(jìn)行處理。

相比其他3個(gè)機(jī)構(gòu)，IDF對(duì)乳桿菌進(jìn)行AST考慮的藥物種類最多，但缺乏判定標(biāo)準(zhǔn)。

4.5 對(duì)4個(gè)國際組織對(duì)乳桿菌進(jìn)行AST的比較

CLSI和EUCASTA重點(diǎn)關(guān)注導(dǎo)致臨床感染情況的致病乳桿菌，建議進(jìn)行試驗(yàn)的抗生素藥物以青霉素和碳青霉素類為主，給出MIC值意在指導(dǎo)臨床感染上對(duì)致病菌株用藥，而EFSA和IDF關(guān)注的是食品/飼料中添加的乳桿菌，對(duì)多種抗生素都給出考慮，測定MIC值意在與微生物臨界值/流行病學(xué)臨界值進(jìn)行對(duì)比，以判斷所測試的菌株含有獲得性耐藥的可能性，保障乳桿菌的應(yīng)用安全性。

在進(jìn)行AST試驗(yàn)的具體過程中，細(xì)節(jié)方面4個(gè)組織各有不同，總結(jié)如表6所示。

在2013年，Mayrhofer等[40]根據(jù)CLSI和IDF標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)22種乳桿菌進(jìn)行了16種抗生素的AST試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)兩種標(biāo)準(zhǔn)之間的關(guān)鍵差異主要是由于不同的藥敏培養(yǎng)基（CAMHB vs. LSM）導(dǎo)致，一半的測試菌株在CAMHB培養(yǎng)基中無法生長，而所有菌株在LSM培養(yǎng)基中均可生長，但是，一些抗生素受到LSM培養(yǎng)基成分的影響：包括甲氧芐啶、慶大霉素、卡那霉素、新霉素和鏈霉素等幾種藥物，在兩種培養(yǎng)基下對(duì)同株乳桿菌的MIC值差異很大，因此，兩種肉湯下必須使用不同的解釋標(biāo)準(zhǔn)來區(qū)分耐藥菌株和易感菌株。

LSM肉湯包含10%的MRS肉湯成分，MRS培養(yǎng)基含有一些針對(duì)甲氧芐啶的拮抗劑，其低pH值也可能會(huì)降低氨基糖苷類抗生素的活性，而相反，可能使β-內(nèi)酰胺類抗生素活性更高，因此LSM肉湯不夠規(guī)范。但對(duì)于一些特殊的乳桿菌種類，即使添加了裂解馬血/β-NAD，CAMHB肉湯仍不足以支持生長。

除此以外，在培養(yǎng)環(huán)境方面EUCAST建議藥敏試驗(yàn)非必要不在CO2環(huán)境下進(jìn)行，因?yàn)镃O2對(duì)某些藥物有影響，如紅霉素等在CO2環(huán)境下活性會(huì)降低[40]。但同時(shí)另兩個(gè)組織考慮到大部分乳桿菌在厭氧環(huán)境下生存能力更好，依然建議統(tǒng)一在厭氧環(huán)境中培育。

5 乳桿菌的耐藥表型和基因型

乳桿菌屬對(duì)不同類別的抗生素表現(xiàn)出很大的耐藥差異。CLSI建議臨床首選藥物為青霉素或氨芐西林，然而，雖然乳桿菌通常對(duì)青霉素敏感，但它們對(duì)同為β-內(nèi)酰胺類的頭孢類藥物卻不一定敏感[41]。

大多數(shù)乳桿菌對(duì)氨基糖苷類（新霉素、卡那霉素、鏈霉素和慶大霉素）、糖肽（萬古霉素和替考拉寧）、核酸合成抑制劑（環(huán)丙沙星、依諾沙星、培氟沙星、諾氟沙星、萘啶酸和甲硝唑）和葉酸合成抑制劑（磺胺甲惡唑、甲氧芐啶和復(fù)方磺胺甲惡唑）具有內(nèi)在耐藥性[42]。

大多數(shù)乳桿菌對(duì)糖肽類藥物（萬古霉素和替考拉寧）表現(xiàn)出高水平的耐藥，對(duì)萬古霉素的耐藥性可能是乳桿菌最好的內(nèi)在耐藥性[43-44]。萬古霉素通過結(jié)合細(xì)胞壁前體肽聚糖五肽D-丙氨酸末端的D-丙氨酸殘基，阻斷細(xì)菌細(xì)胞壁中的肽聚糖的聚合，從而發(fā)揮殺菌作用[45]。而多種乳桿菌在其胞壁五肽中，D-丙氨酸末端的D-丙氨酸殘基被胞壁中的D-乳酸或D-絲氨酸取代，萬古霉素缺乏作用靶點(diǎn)，因此失效[46]。需要注意的是并不是所有的乳桿菌都對(duì)萬古霉素有固有耐藥：大部分在有氧環(huán)境下能很好生存的乳桿菌如干酪乳桿菌、發(fā)酵乳桿菌、植物乳桿菌、鼠李糖乳桿菌等對(duì)萬古霉素有固有耐藥，但嗜酸乳桿菌、卷曲乳桿菌詹氏乳桿菌、約氏乳桿菌等嚴(yán)格厭氧乳桿菌對(duì)萬古霉素敏感[47]。CLSI、EFSA等組織都明確指出固有耐藥并不是問題，反而因?yàn)榇颂匦裕闂U菌可以與藥物同時(shí)給藥，達(dá)到更好的治療效果[48]，值得關(guān)注的是乳桿菌可轉(zhuǎn)移耐藥風(fēng)險(xiǎn)。

乳桿菌對(duì)氯霉素、鏈霉素、克林霉素、四環(huán)素、紅霉素、利奈唑胺和奎奴普丁/達(dá)福普汀敏感[42]。但根據(jù)Gueimonde等[46]報(bào)道，盡管乳桿菌通常對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類藥物敏感，但乳桿菌中的染色體突變（例如鼠李糖乳桿菌）可以降低紅霉素對(duì)核糖體的親和力，通過這樣的機(jī)制，使得紅霉素（殺菌機(jī)制為與細(xì)菌核糖體50S亞單位結(jié)合）失效。另一項(xiàng)研究也觀察到乳桿菌中的染色體突變，鼠李糖乳桿菌E41發(fā)生了 23S rRNA基因的單個(gè)突變，該突變降低了紅霉素對(duì)核糖體的親和力，使菌株獲得了大環(huán)內(nèi)酯類耐藥特性[47]。

表7總結(jié)了近15年來，乳桿菌藥敏領(lǐng)域研究者們分離得到的乳桿菌耐藥情況，這些乳桿菌大部分來源于發(fā)酵食品，對(duì)于菌株耐藥表型、耐藥基因、耐藥基因位置進(jìn)行了匯總，需要注意的是一些研究沒有考慮耐藥基因或基因位置，但菌株本身的耐藥表型仍然很重要。

由表7可見，目前對(duì)乳桿菌獲得性耐藥的研究，主要集中在四環(huán)素、氯霉素和紅霉素等相關(guān)耐藥基因上。在副干酪乳桿菌、羅伊乳桿菌、唾液乳桿菌和發(fā)酵乳桿菌中檢測到位于質(zhì)?；蜣D(zhuǎn)座子上的四環(huán)素抗性基因tet，在發(fā)酵乳桿菌、唾液乳桿菌中檢測到位于質(zhì)粒上的紅霉素抗性基因erm，在嗜酸乳桿菌、德氏乳桿菌中檢測到位于質(zhì)粒上的氯霉素抗性基因cat，一研究還檢測到某株植物乳桿菌轉(zhuǎn)座子上含有對(duì)氨基糖苷類抗生素的抗性基因aac（6）-aph（2″）、ant（6）和aph（3） -III等。

6? ? 結(jié)論

作為益生菌的潛在菌庫，一些被篩選出的乳桿菌菌株已被證明對(duì)多種疾病有效，并被FDA認(rèn)定“GRAS”，因此廣泛參與到人與動(dòng)物的生活中，本文對(duì)我國乳桿菌的使用情況和致病耐藥風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行了相關(guān)總結(jié)，發(fā)現(xiàn)以下幾點(diǎn)。

（1）典型的乳桿菌益生菌的益生效應(yīng)綜合體現(xiàn)在對(duì)口腔、鼻腔黏膜，皮膚炎癥、濕疹，呼吸道疾病，消化道疾病，免疫系統(tǒng)以及神經(jīng)系統(tǒng)的調(diào)節(jié)作用上，我國審批和應(yīng)用較多的益生乳桿菌是鼠李糖乳桿菌、嗜酸乳桿菌、羅伊乳桿菌和植物乳桿菌。

（2）作為條件致病菌，乳桿菌可能引起菌血癥，心內(nèi)膜炎，腦膜炎等疾病[37]，但乳桿菌引起疾病的風(fēng)險(xiǎn)很低，通常并非主要致病菌，而是伴隨其他細(xì)菌的合并感染，只對(duì)免疫低下的患者造成威脅。相比而言，更值得注意的是，益生菌廣泛使用可能造成的耐藥風(fēng)險(xiǎn)[69]。

（3）總結(jié)近年來對(duì)乳桿菌耐藥風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)研究報(bào)告，發(fā)現(xiàn)多種乳桿菌攜帶有抗生素耐藥性基因，包括四環(huán)素類（tet）、糖肽類（van）、大環(huán)內(nèi)酯類（erm、mef）、酰胺醇類（cat，fex）、喹諾酮類（gyr，par）、氨基糖苷類（aac（6）-aph（2″）、ant（6）、aph（3'） -III）、磺胺類（sul，dfr）、利福平類（rpo）、大環(huán)內(nèi)酯類（mef）、林可酰胺類（lnu），在多種乳桿菌中發(fā)現(xiàn)了位于可移動(dòng)元件上的四環(huán)素抗性基因tet，紅霉素抗性基因erm，氯霉素抗性基因cat基因，乳桿菌有耐藥轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)。

7? ? 討論與展望

本文對(duì)CLSI、EUCAST、EFSA和IDF等4個(gè)權(quán)威國際機(jī)構(gòu)給出的乳桿菌AST標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了綜合比較分析，認(rèn)為規(guī)范化進(jìn)行乳桿菌的抗生素敏感性試驗(yàn)（AST）迫在眉睫，建議可從以下方面進(jìn)行。

（1）推進(jìn)對(duì)乳桿菌新分類的研究，從進(jìn)化方向和親緣關(guān)系上對(duì)乳桿菌的固有耐藥和獲得性耐藥進(jìn)行深入研究。

（2）研究出更適合乳桿菌使用的藥敏肉湯，既能滿足菌株生長，又不影響藥物活性。

（3）各標(biāo)準(zhǔn)機(jī)構(gòu)可以根據(jù)關(guān)注點(diǎn)的不同，給出更體系化的對(duì)某種用途乳桿菌的具體藥敏實(shí)驗(yàn)方法和結(jié)果評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)，而不能采用不同的體系進(jìn)行藥敏試驗(yàn)又采取相同的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判定。

（4）對(duì)于臨床感染的乳桿菌耐藥快速檢測，在有質(zhì)控菌株的情況下，紙片法藥敏試驗(yàn)也許更加方便快捷，有報(bào)道稱紙片擴(kuò)散法和 E-test 法得到的嗜酸乳桿菌MIC結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)的微量肉湯稀釋法結(jié)果具有一致性[70]。

（5）乳桿菌在進(jìn)行商業(yè)投產(chǎn)前，除了進(jìn)行表型檢測外，還應(yīng)進(jìn)行全基因組序列（genome-wide sequencing， WGS）以確定乳桿菌是否存在抗生素抗性基因，用WGS尋找抗生素抗性基因可以識(shí)別出相似但不相同的基因，發(fā)現(xiàn)更多沉默的耐藥基因，避免這些基因轉(zhuǎn)移到其他物種中被激活。

最后，呼吁國家制定法規(guī)在規(guī)范乳桿菌應(yīng)用的過程中更應(yīng)謹(jǐn)慎行事[71]，需要進(jìn)一步的研究來表征它們，綜合考慮其作為商業(yè)產(chǎn)品應(yīng)用的有效性和安全性。

參 考 文 獻(xiàn)

王階平， 劉波， 劉欣， 等. 乳酸菌的系統(tǒng)分類概況[J]. 生物資源， 2019， 41（6）： 471-485.

魏長浩， 鄧澤元. 益生菌及其應(yīng)用研究進(jìn)展[J]. 乳業(yè)科學(xué)與技術(shù)， 2018， 41（1）： 26-32.

Fine R L， Mubiru D L， Kriegel M A. Friend or foe？ Lactobacillus in the context of autoimmune disease[J]. Adv Immunol， 2020， 146： 29-56.

Campedelli I， Mathur H， Salvetti E， et al. Genus-wide assessment of antibiotic resistance in Lactobacillus spp.[J]. Appl Environ Microb， 2019， 85（1）： e01738-18.

房詩薇， 黃玲利， 謝書宇， 等. 獸用抗菌藥耐藥判定標(biāo)準(zhǔn)的研究進(jìn)展[J]. 中國抗生素雜志， 2019， 44（6）： 667-673.

趙巖. 中國人群腸道中發(fā)酵乳桿菌的基因差異及其對(duì)腸道的生理調(diào)節(jié)作用[D]. 無錫： 江南大學(xué)， 2021.

陸靜. 中國人群腸道菌群分布特征及影響因素解析[D]. 無錫： 江南大學(xué)， 2022.

張曉宇， 孫茜， 馮旸子， 等. 陰道內(nèi)乳桿菌與糞腸球菌共培養(yǎng)生長狀態(tài)及其上清液對(duì)陰道加德納菌抑制作用的體外研究[J]. 現(xiàn)代婦產(chǎn)科進(jìn)展， 2023， 32（4）： 1-6.

Jespers V， Menten J， Smet H， et al. Quantification of bacterial species of the vaginal microbiome in different groups of women， using nucleic acid amplification tests[J]. BMC Microbiol， 2012， 12： 83.

Zheng J， Wittouck S， Salvetti E， et al. A taxonomic note on the genus Lactobacillus： Description of 23 novel genera， emended description of the genus Lactobacillus Beijerinck 1901， and union of Lactobacillaceae and Leuconostocaceae[J]. Int J Syst Evol Micr， 2020， 70（4）： 2782-2858.

Qiao N， Wittouck S， Mattarelli P， et al. After the storm-Perspectives on the taxonomy of Lactobacillaceae[J]. JDS Commun， 2022， 3（3）： 222-227.

于學(xué)健， 胡海蓉， 曹艷花， 等. 乳桿菌屬分類學(xué)地位變遷后菌種名稱英解漢譯檢索表（三）[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè)， 2020， 46（17）： 296-300.

中華人民共和國農(nóng)業(yè)部畜牧業(yè)司. 飼料添加劑品種目錄（2013）[S]. （2013年）. 北京： 中華人民共和國農(nóng)業(yè)部， 2013 公告第2045號(hào)： 附錄一.

食品安全標(biāo)準(zhǔn)與監(jiān)測評(píng)估司. 可用于食品的菌種名單&可用于嬰幼兒食品的菌種名單[S]. （2022年）. 北京： 中華人民共和國國家衛(wèi)生健康委員會(huì)， 2022第4號(hào)： 附件1-2.

食品安全標(biāo)準(zhǔn)與監(jiān)測評(píng)估司. 可用于保健食品的益生菌菌種名單[S]. （2004年）. 北京： 中華人民共和國國家衛(wèi)生健康委員會(huì)， 2004 衛(wèi)法監(jiān)發(fā)[2001]84號(hào)： 附件5.

Grujovi? M， Mladenovi? K G， Semedo-Lemsaddek T， et al. Advantages and disadvantages of non-starter lactic acid bacteria from traditional fermented foods： Potential use as starters or probiotics[J]. Compr Rev Food Sci F， 2022， 21（2）： 1537-1567.

Azam M， Mohsin M， Ijaz H， et al. Review - Lactic acid bacteria in traditional fermented Asian foods[J]. Pak J Pharm Sci， 2017， 30（5）： 1803-1814.

Mantegazza C， Molinari P， D'Auria E， et al. Probiotics and antibiotic-associated diarrhea in children： A review and new evidence on Lactobacillus rhamnosus GG during and after antibiotic treatment[J]. Pharmacol Res， 2018， 128： 63-72.

Floch M H， Walker W A， Madsen K， et al. Recommendations for probiotic use-2011 update[J]. J Clin Gastroenterol， 2011， 45 Suppl： S168-S171.

Hayes S R， Vargas A J. Probiotics for the prevention of pediatric antibiotic-associated diarrhea[J]. Explore-Ny， 2016， 12（6）： 463-466.

Moal L L， Servin A L. Anti-infective activities of lactobacillus strains in the human intestinal microbiota： From probiotics to gastrointestinal anti-infectious biothera-peutic agents[J]. Clin Microbiol Rev， 2014， 27（2）： 167-199.

Auclair J， Frappier M， Millette M. Lactobacillus acidophilus CL1285， Lactobacillus casei LBC80R， and Lactobacillus rhamnosus CLR2 （Bio-K+）： Characterization， manufacture， mechanisms of action， and quality control of a specific probiotic combination for primary prevention of clostridium difficile infection[J]. Clin Infect Dis， 2015， 60（Suppl 2）： S135-S143.

唐京， 陳明， 柯文燦， 等. 乳酸菌在疾病防治和人體保健中的應(yīng)用研究進(jìn)展[J]. 微生物學(xué)雜志， 2017， 37（4）： 98-107.

Ganguly N K， Bhattacharya S K， Sesikeran B， et al. ICMR-DBT guidelines for evaluation of probiotics in food[J]. Indian J Med Res， 2011， 134（1）： 22-25.

Mikucka A， Deptu?a A， Bogiel T， et al. Bacteraemia caused by probiotic strains of Lacticaseibacillus rhamnosus-Case studies highlighting the need for careful thought before using microbes for health benefits[J]. Pathogens， 2022， 11（9）： 977.

Rubin I M C， Stevnsborg L， Mollerup S， et al. Bacteraemia caused by Lactobacillus rhamnosus given as a probiotic in a patient with a central venous catheter： a WGS case report[J]. Infect Prev Pract， 2022， 4（1）： 100200.

Rocca F， Aguerre L， Cipolla L， et al. Lactobacillus spp. invasive infections in Argentina[M]. Int J Infect Dis， 2018， 73 Suppl： S163.

Rossi F， Amadoro C， Colavita G. Members of the Lactobacillus Genus Complex （LGC） as opportunistic pathogens： A review[J]. Microorganisms， 2019， 7（5）： 126.

吉星， 李俊， 王冉， 等. 常見益生菌耐藥性研究進(jìn)展[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)， 2022， 38（6）： 1722-1728.

Wang K， Zhang H， Feng J， et al. Antibiotic resistance of lactic acid bacteria isolated from dairy products in Tianjin， China[J]. J Agr Food Res， 2019， 1： 100006.

Van den Nieuwboer M， Brummer R J， Guarner F， et al. Safety of probiotics and synbiotics in children under 18 years of age[J]. Benef Microbes， 2015， 6（5）： 615-630.

Oladeinde A， Cook K， Lakin S M， et al. Horizontal gene transfer and acquired antibiotic resistance in Salmonella enterica Serovar Heidelberg following in vitro incubation in broiler ceca[J]. Appl Environ Microb， 2019， 85（22）： e01903-19.

Fatahi-Bafghi M， Naseri S， Alizehi A. Genome analysis of probiotic bacteria for antibiotic resistance genes[J]. Anton Leeuw Int J G， 2022， 115（3）： 375-389.

More S， Bampidis V， Benford D， et al. Evaluation of existing guidelines for their adequacy for the food and feed risk assessment of microorganisms obtained through synthetic biology[J]. EFSA J， 2022， 20（8）： e07479.

CLSI. Methods for antimicrobial dilution and disk susceptibility testing of infrequently isolated or fastidious bacteria[S]. （2015， 3rd ed）. Wayne， PA： Clinical and Laboratory Standards Institute; 2015， 1-21.

Giske C G， Turnidge J， Cantón R， et al. Update from the European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing （EUCAST）[J]. J Clin Microbiol， 2022， 60（3）： e0027621.

Rychen G， Aquilina G， Azimonti G， et al. Guidance on the characterisation of microorganisms used as feed additives or as production organisms[J]. EFSA J， 2018， 16（3）： e05206.

Efsa. Guidance on the assessment of bacterial susceptibility to antimicrobials of human and veterinary importance[J]. EFSA J， 2012， 10（6）： 2740.

ISO/IDF. Milk and milk products-determination of the minimal inhibitory concentration （MIC） of antibiotics applicable to bifidobacteria and non-enterococcal lactic acid bacteria （LAB）[S]. （2010， 1rd ed）. Switzerland： ISO and IDF Institute， 2015： 1-31.

Mayrhofer S， Zitz U， Birru F H， et al. Comparison of the CLSI guideline and ISO/IDF standard for antimicrobial susceptibility testing of lactobacilli[J]. Microb Drug Resist， 2014， 20（6）： 591-603.

宋曉敏， 李少英， 馬春艷， 等. 發(fā)酵食品中乳酸菌的耐藥性現(xiàn)狀分析[J]. 微生物學(xué)通報(bào)， 2015， 42（1）： 207-213.

Abriouel H， Casado-Mu?oz M D， Lavilla-Lerma L， et al. New insights in antibiotic resistance of Lactobacillus species from fermented foods[J]. Food Res Int， 2015， 78： 465-481.

Goldstein E J， Tyrrell K L， Citron D M. Lactobacillus species： Taxonomic complexity and controversial susceptibilities[J]. Clin Infect Dis， 2015， 60 （Suppl 2）： S98-S107.

Colautti A， Arnoldi M， Comi G， et al. Antibiotic resistance and virulence factors in lactobacilli： Something to carefully consider[J]. Food Microbiol， 2022， 103： 103934.

王煒哲， 翟征遠(yuǎn)， 郝彥玲. 市售酸奶中發(fā)酵劑乳酸菌的耐藥性及耐藥基因研究進(jìn)展[J]. 中國乳品工業(yè)， 2022， 50（2）： 34-37.

Gueimonde M， Sánchez B， Reyes-Gavilán C G L， et al. Antibiotic resistance in probiotic bacteria[J]. Front Microbiol， 2013， 4： 202.

Flórez A B， Ladero V， Alvarez-Martín P， et al. Acquired macrolide resistance in the human intestinal strain Lactobacillus rhamnosus E41 associated with a transition mutation in 23S rRNA genes[J]. Int J Antimicrob Agents， 2007， 30（4）： 341-344.

Das D J， Shankar A， Johnson J B， et al. Critical insights into antibiotic resistance transferability in probiotic Lactobacillus[J]. Nutrition， 2020， 69： 110567.

Nawaz M， Wang J， Zhou A， et al. Characterization and transfer of antibiotic resistance in lactic acid bacteria from fermented food products[J]. Curr Microbiol， 2011， 62（3）： 1081-1089.

Guo H， Pan L， Li L， et al. Characterization of antibiotic resistance genes from Lactobacillus isolated from traditional dairy products[J]. J Food Sci， 2017， 82（3）： 724-730.

Ouoba L I， Lei V， Jensen L B. Resistance of potential probiotic lactic acid bacteria and bifidobacteria of African and European origin to antimicrobials： determination and transferability of the resistance genes to other bacteria[J]. Int J Food Microbiol， 2008， 121（2）： 217-224.

Yang C， Yu T. Characterization and transfer of antimicrobial resistance in lactic acid bacteria from fermented dairy products in China[J]. J Infect Dev Countr， 2019， 13（2）： 137-148.

Zhou N， Zhang J X， Fan M T， et al. Antibiotic resistance of lactic acid bacteria isolated from Chinese yogurts[J]. J Dairy Sci， 2012， 95（9）： 4775-4783.

Thumu S C， Halami P M. Presence of erythromycin and tetracycline resistance genes in lactic acid bacteria from fermented foods of Indian origin[J]. Anton Leeuw Int J G， 2012， 102（4）： 541-551.

Pan L， Hu X， Wang X. Assessment of antibiotic resistance of lactic acid bacteria in Chinese fermented foods[J]. Food Control， 2011， 22（8）： 1316-1321.

Cho G S， Cappello C， Schrader K， et al. Isolation and characterization of lactic acid bacteria from fermented goat milk in Tajikistan[J]. J Microbiol Biotechnol， 2018， 28（11）： 1834-1845.

Comunian R， Daga E， Dupré I， et al. Susceptibility to tetracycline and erythromycin of Lactobacillus paracasei strains isolated from traditional Italian fermented foods[J]. Int J Food Microbiol， 2010， 138（1-2）： 151-156.

Devirgiliis C， Coppola D， Barile S， et al. Characterization of the Tn916 conjugative transposon in a food-borne strain of Lactobacillus paracasei[J]. Appl Environ Microb， 2009， 75（12）： 3866-3871.

Zonenschain D， Rebecchi A， Morelli L. Erythromycin-and tetracycline-resistant Lactobacilli in Italian fermented dry sausages[J]. J Appl Microbiol， 2009， 107（5）： 1559-1568.

Anisimova E A， Yarullina D R. Antibiotic resistance of Lactobacillus strains[J]. Curr Microbiol， 2019， 76（12）： 1407-1416.

Jaimee G， Halami P M. High level aminoglycoside resistance in Enterococcus， Pediococcus and Lactobacillus species from farm animals and commercial meat products[J]. Ann Microb， 2016， 66（1）： 101-110.

Liu C， Zhang Z Y， Dong K， et al. Antibiotic resistance of probiotic strains of lactic acid bacteria isolated from marketed foods and drugs[J]. Biomed Environ Sci （BES）， 2009， 22（5）： 401-412.

Hoek A V， Margolles A， Domig K J， et al. Molecular assessment of erythromycin and tetracycline resistance genes in lactic acid bacteria and Bifidobacteria and their relation to the phenotypic resistance[C]. Int J Probiotics Prebiotics， 2008， 3（4）： 271-280.

Chang Y C， Tsai C Y， Lin C F， et al. Characterization of tetracycline resistance Lactobacilli isolated from swine intestines at western area of Taiwan[J]. Anaerobe， 2011， 17（5）： 239-245.

Egerv?rn M， Lindmark H， Olsson J， et al. Transferability of a tetracycline resistance gene from probiotic Lactobacillus reuteri to bacteria in the gastrointestinal tract of humans[J]. Anton Leeuw Int J G， 2010， 97（2）： 189-200.

Egerv?rn M， Roos S， Lindmark H. Identification and characterization of antibiotic resistance genes in Lactobacillus reuteri and Lactobacillus plantarum[J]. J Appl Microbiol， 2009， 107（5）： 1658-1668.

Zhang S， Oh J H， Alexander L M， et al. d-Alanyl-d-Alanine ligase as a broad-host-range counterselection marker in vancomycin-resistant lactic acid bacteria[J]. J Bacteriol， 2018， 200（13）： e00607-17.

Coton M， Lebreton M， Leyva Salas M， et al. Biogenic amine and antibiotic resistance profiles determined for lactic acid bacteria and a propionibacterium prior to use as antifungal bioprotective cultures[J]. Int Dairy J， 2018， 85： 21-26.

Zheng M， Zhang R， Tian X， et al. Assessing the risk of probiotic dietary supplements in the context of antibiotic resistance[J]. Front Microbiol， 2017， 8： 908.

Mayrhofer S， Domig K J， Mair C， et al. Comparison of broth microdilution， E-test， and agar disk diffusion methods for antimicrobial susceptibility testing of Lactobacillus acidophilus group members[J]. Appl Environ Microbiol， 2008， 74（12）： 3745-3748.

Ojha A K， Shah N P， Mishra V. Conjugal transfer of antibiotic resistances in Lactobacillus spp.[J]. Curr Microbiol， 2021， 78（8）： 2839-2849.