貝萊斯芽孢桿菌JK-1 可濕性粉劑研制及對辣椒褐腐病的防治效果

趙春燕，安良聰，趙秋玲，孫中濤

（1.聊城市茌平區(qū)農業(yè)農村局，山東 茌平 252100；2.山東農業(yè)大學生命科學學院，山東 泰安 271000；3.聊城市茌平區(qū)信發(fā)集團，山東 茌平 252100）

貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）是一種常見的生防細菌，能夠有效抑制多種植物病原菌生長[1]。貝萊斯芽孢桿菌通過代謝為植物生長提供N、P、K 和Fe 等礦質營養(yǎng)元素，合成生長激素促進植物生長[2]。貝萊斯芽孢桿菌能誘導植物產(chǎn)生系統(tǒng)抗病性[3]，與病原菌共存時彼此產(chǎn)生競爭作用[4]，達到抑菌和防病的效果[5]。肖倩等[6]分離的貝萊斯芽孢桿菌HMQAU19044 對黃瓜霜霉病的防效高達59.82%，有很好的治療作用，并且持效期長；遲惠榮等[7]分離得到的貝萊斯芽胞桿菌ZJU-3 發(fā)酵液中，脂肽粗提物可明顯抑制尖孢鐮刀菌菌絲的生長，抑制率達到51.6%，同時該菌株對多花黃精具有顯著促生效果；長江大學植物與微生物互作研究室分離得到的貝萊斯芽孢桿菌D61-A 對水稻紋枯病具有很好的抑制效果[8]。目前國內外已有部分貝萊斯芽孢桿菌被制作成微生物菌肥或生物殺菌劑，用于多種植物病害的防治[9]，貝萊斯芽孢桿菌TK2019 微生物菌劑田間試驗證實，對棉花黃萎病的防效高達92.69%[10]；貝萊斯芽孢桿菌BV03 菌劑在工廠化育苗中促生效果達到30%,能使壯苗指數(shù)提升45%以上[11]。由此可見貝萊斯芽孢桿菌的應用前景廣闊。

本試驗中的貝萊斯芽孢桿菌JK-1 是在辣椒根際土壤中篩選得到的，前期試驗證明JK-1 菌株抗菌譜廣。為了進一步挖掘貝萊斯芽孢桿菌JK-1 的生防潛力，廣泛開展實際應用，本文開展了該菌劑的研究，并以辣椒褐腐病為例，測定了其對病害的防治效果，篩選出適合制造該菌可濕性粉劑的理想助劑，以期能為該菌株的商品化開發(fā)奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試菌種 貝萊斯芽孢桿菌JK-1，辣椒褐腐病病原菌角擔菌（Ceratobasidium ramicola）BING-15，由山東農業(yè)大學生命科學學院實驗室提供。

1.1.2 供試菌粉制備及病原菌活化 玉米秸稈75%，麩皮25%、玉米2.60%、硫酸銨1.48%、硫酸錳0.10%、接種量8%、pH 值7.03，在37 ℃培養(yǎng)箱固態(tài)發(fā)酵48 h在45 ℃烘箱烘干后，進行超微粉碎，制成菌粉?；罹鷶?shù)最高達到620.00 億·g-1、芽孢生成率最高為85%。

病原菌活化：將病原菌BING-15 菌種接種到新的PDA 培養(yǎng)基上，28 ℃的恒溫培養(yǎng)箱內培養(yǎng)72 h。

1.1.3 供試試劑 載體：硅藻土、高嶺土、白炭黑、凹凸棒土；濕潤劑：十二烷基硫酸鈉（SDS）、聚乙二醇（PEG2000）、CaCl2；分散劑：木質磺酸鈉、三聚磷酸鈉、亞甲基二磺酸鈉（NNO）、阿拉伯樹膠、羧甲基纖維素鈉；保護劑：腐殖酸鈉、黃原膠、高嶺土、糊精、可溶性淀粉。

1.1.4 室內盆栽試驗材料 線辣椒幼苗，品種為：‘帝王336’，濰坊壽光鑫青種苗公司提供。供試土壤：濟南市佐田氏生物有限公司試驗田土壤。栽培花盆規(guī)格：上內徑20 cm、下內徑14 cm、高16 cm。

1.2 相關指標的測定方法

1.2.1 生物相容性（活菌數(shù)）的測定 將樣品稀釋制成發(fā)酵液，按照不同梯度在LB 平板上涂布，計算每個平板的菌落數(shù)，最終換算出活菌數(shù)。

1.2.2 潤濕時間的測定 按《農藥濕性粉劑之間溫性劑定方法》（GB/T5451—2001）[12]為參考標準測定潤濕時間。

1.2.3 懸浮率的測定 按國家標準《農藥縣浮率測定方法》（GB/T14825—2006）[13]為參考標準測定懸浮率。1.2.4 pH 值的測定 按國家標準《農藥pH 值的測定方法》（GB/T1601—1993）[14]為參考標準測定pH 值。

1.2.5 細度的測定 參考國家標準《農藥粘劑、可濕性粉劑細度測定方法》（GB/T 16150—1995）[15]農藥可濕性粉劑細度測定。

1.3 載體的篩選

母粉的制備：將菌粉分別與4 種載體（硅藻土、高嶺土、凹凸棒土、白炭黑）按3∶2 例混合均勻，超微粉碎后過篩（200 目）備用，每種樣品設置3 組重復，測活菌數(shù)、潤濕時間、懸浮率值。

1.4 潤濕劑的篩選

將各分濕潤劑和母粉按1∶5 比例混合均勻后超微粉碎，過篩（200 目）處理備用，每種樣品設置3 組重復，測活菌數(shù)、潤濕時間、懸浮率值。

1.5 分散劑的篩選

將各分散劑與母粉按1∶4 比例混合均勻超微粉碎后過篩（200 目）處理，制得樣品，每種樣品設置3組重復，測活菌數(shù)、潤濕時間、懸浮率值。

1.6 保護劑的篩選

將各保護劑與母粉按1∶50 比例混合均勻超微粉碎后，過篩（200 目）處理，每種樣品設置3 次重復，各組處理在距離紫外燈（254 nm，20 W）40 cm 處照射40 min。將樣品稀釋后涂布，觀察菌落生長效果，以不添加保護劑、紫外不處理為對照，通過比較紫外線照射前后可濕性粉劑理化性質篩選紫外保護劑。

載體、潤濕劑、分散劑、保護劑篩選中活菌數(shù)、潤濕時間、懸浮率的測定按照1.2.1 中的國家標準和方法進行測定。

1.7 可濕性粉劑配方的研制

將篩選的最佳載體、分散劑、潤濕劑和保護劑設置成四因素三水平L9（34）（表1）的設計進行正交試驗，將各種助劑按照比例混合均勻制成可濕性粉劑，通過測定懸浮率確定可濕性粉劑的最佳配方。

表1 助劑篩選的因素和水平

1.8 可濕性粉劑質量指標的測定

根據(jù)最佳配方研制的可濕性粉劑，按照1.2.1 中的國家標準和方法測定活菌數(shù)、潤濕時間、懸浮率、pH 值、細度。

1.9 貝萊斯芽孢桿菌JK-1 可濕性粉劑效果研究

1.9.1 離體果實防治效果 選取長勢一致的辣椒果實，用75%的酒精消毒后，再用無菌水沖洗3 次擦干備用。將辣椒果實浸泡在可濕性粉劑稀釋液（250倍）2 h 后取出，將活化的病原菌BING-15 打菌餅（5 mm），接種到辣椒上（用滅菌的接種針刺傷），接種的辣椒放置到鋪滿吸水紙的培養(yǎng)皿中，在28 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)3 d，測量辣椒果實的病斑長度，根據(jù)公式計算防治效果。以無菌水浸泡為對照。每組處理設3 個重復，每個重復處理5 個辣椒。

防治效果=（對照組病斑長度徑-試驗組病斑長度徑）/對照組病斑直徑×100%。

1.9.2 盆栽試驗 盆栽試驗設置了3 組分別為CK、T1 和T2，每1 組設置了5 盆，每盆裝土2.5 kg，定植一株長勢大致一致的線辣椒幼苗。在辣椒開花期，分別從每組處理中選取3 盆長勢一致的辣椒植株進行試驗。活化的病原菌菌餅接種在PDA 液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)72 h 后，制成發(fā)酵液。設2 個處理：T1為施加500 mL 病原菌發(fā)酵液+500 mL 無菌水；T2為500 mL 病原菌發(fā)酵液+500 mL 可濕性粉劑稀釋液（250 倍）500 mL；以1 000 mL 無菌水為對照。澆灌辣椒根際土壤，25 d 后通過松土處理，將辣椒植株地上與根系部位完整取出，用清水將根部泥土清洗干凈，并用吸水紙擦拭干凈。本試驗將辣椒植株的株高、莖粗、鮮質量、干質量作為生物量的測定指標。辣椒的株高莖粗通過米尺和游標卡尺測量；辣椒的鮮質量采用直接稱質量法測量；辣椒干質量采用烘干測量法測定。

1.10 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2013 軟件進行數(shù)據(jù)處理，利用SPSS 22.0 軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，采用正交試驗進行數(shù)據(jù)處理。

2 結果與分析

2.1 載體的篩選

通過表2 可知，以凹凸棒土和高嶺土為載體的樣本活菌數(shù)較高，分別522.00 億·g-1和576.00 億·g-1，兩者差距不大。硅藻土和高嶺土潤濕時間和懸浮率分別為47.67s、50%和82.77s、78%。潤濕性是農藥可濕性粉劑的一個重要性能指標，懸浮率高，菌劑能均勻懸浮在水中，在噴頭中均勻噴出，達到好的防治效果。同時，也要考慮到制劑的實用性，選擇成本低、原材料豐富、運輸便利的載體。綜合考慮，選擇高嶺土為最佳載體。

表2 載體的篩選

2.2 潤濕劑的篩選

由表3 可知，以聚乙二醇為濕潤劑的樣本活菌數(shù)為600.00 億·g-1，最高，SDS 和聚乙二醇懸浮率較高，分別為75%、77%，潤濕時間聚乙二醇潤濕時間最少50 s；潤濕劑能夠降低水的表面張力，有利于有效成分盡快被水潤濕，更好發(fā)揮可濕性粉劑的藥效。因此，篩選潤濕劑時中應著重考慮其懸浮率和潤濕性。綜合考慮，選擇聚乙二醇為最佳潤濕劑。

表3 潤濕劑的篩選

2.3 分散劑的篩選

由表4 可知，以羧甲基纖維素鈉為分散劑的樣本活菌數(shù)、懸浮率最高分別為576.00 億·g-1、78.27%，潤濕時間為亞甲基二磺酸鈉夫＞對照＞阿拉伯樹膠＞羧甲基纖維素鈉＞木質磺酸鈉＞三聚磷酸鈉。分散劑可以降低菌粉表面張力,使其在介質中均勻分散，有利于可濕性粉劑發(fā)揮穩(wěn)定性能。羧甲基纖維素鈉的活菌數(shù)高、懸浮率高，潤濕效果較優(yōu)，成本相對較低.綜合考慮,選擇羧甲基纖維素鈉為最佳分散劑。

表4 分散劑的篩選

2.4 保護劑的篩選

由表5 可知，經(jīng)紫外線照射后，保護劑為可溶性淀粉時，菌劑的活菌數(shù)最高，為557.00 億·g-1；黃原膠和可溶性淀粉為保護劑是，菌劑懸浮率最高，為79.67%。在篩選保護劑的過程中，活菌數(shù)是重要的衡量指標。綜合考慮，選擇可溶性淀粉為最佳保護劑。

表5 保護劑的篩選

2.5 可濕性粉劑配方的篩選

通過單因素試驗確定高嶺土、聚乙二醇、羧甲基纖維素鈉和可溶性淀粉為可濕性粉劑的最佳載體和助劑。以這4 種材料為篩選因素進行正交試驗，設置3 個質量分數(shù)。將懸浮率作為指標，由表6極差分析可知，極差分析可知4 個因素結合R 值（因素極差值）對比可知4 個因素優(yōu)劣排序為：R3＞R2＞R4＞R1；4 個影響因素按影響程度依次為: C 羧甲基纖維素鈉＞B 聚乙二醇＞D 可溶性淀粉＞A 高嶺土。因此，可濕性粉劑的最佳方案A2B3C2D3，即高嶺土35%、聚乙二醇8%、羧甲基纖維素鈉12%和可溶性淀粉0.8%。

表6 助劑正交試驗結果

2.6 可濕性粉劑質量指標測定

如表7 可知，根據(jù)JK-1 菌株可濕性粉劑的篩選試驗確定最優(yōu)組分為高嶺土35%、聚乙二醇8%、羧甲基纖維素鈉12%和可溶性淀粉0.8%，菌粉補足至100%制成可濕性粉。此工藝制成可濕性粉劑測得活菌數(shù)為580.00 億·g-1、懸浮率為86.00%、潤濕時間為89 s、pH 值為7.06、細度為94.16%。因此可知，各項指標均符合農藥可濕性粉劑的國家標準，說明制成的可濕性粉劑合格。

表7 可濕性粉劑指標的測定

2.7 貝萊斯芽孢桿菌JK-1 可是濕性粉劑效果

2.7.1 離體果實防治效果 將辣椒褐腐病病原菌接種到辣椒果實上，結果發(fā)現(xiàn)經(jīng)JK-1 可濕性粉劑稀釋液浸泡之后，果實發(fā)病程度明顯小于清水處理組（圖1）。清水處理的果實腐爛程度嚴重，腐爛面積大，腐爛病斑長度達到6.38 cm；稀釋液處理的果實，腐爛程度明顯受到抑制，腐爛病斑長度為2.27 cm（表8）。通過計算得知，JK-1 菌株能夠防治辣椒褐腐病，防治效果為64.4%。

圖1 JK-1 可濕性粉劑處理后辣椒褐腐病對辣椒果實的侵染狀況

表8 JK-1 可濕性粉劑對辣椒果實的防治效果

2.7.2 可濕性粉劑對辣椒的促生作用 可濕性粉劑對辣椒的生長的促進作用如9 表所示。與對照組相比，T2 處理組長勢良好，無褐腐病病害發(fā)生，株高、莖粗、鮮質量、干質量、根長均增加，分別增加了32.65%、17.39% 、1.17%、7.78%、14.10%；T1 處理的株高、莖粗、鮮質量、干質量、根長均下降，說明辣椒褐腐病病原菌能夠抑制辣椒生長，施加JK-1 可濕性粉劑不僅能夠有效防治辣椒褐腐病，對辣椒生長也有一定促進作用。

表9 可濕性粉劑對辣椒生長的影響

3 討論與結論

微生物制劑中的可濕性粉劑是最主要的類型，可濕性粉劑比液體菌劑運輸和貯藏方便，比其他固體菌劑有效成分多，潤濕性和懸浮效果好，農業(yè)應用更為廣泛。常常用潤濕性、與生物相容性、含水量、懸浮率、細度等對可濕性粉劑的性能進行評價[16]。莊新亞等[17]在研制防除野燕麥的可濕性粉劑時發(fā)現(xiàn)硅藻土作為載體，潤濕性較好，懸浮率較高。李姝江等[18]研制防治核桃根腐病的可濕性菌劑時認為高嶺土作為載體，可濕性粉劑的懸浮率較高。本研究認為，高嶺土和凹凸棒土與菌株的生物相容性較高，但凹凸棒土懸浮率低，因此選擇高嶺土為最佳載體?？蓾裥苑蹌┰谔镩g防治過程中，紫外線的照射將會影響粉劑內菌體的生長，在制備過程中需要添加可溶性淀粉作為紫外線保護劑，對菌體進行保護。

載體和助劑與可濕性粉劑的懸浮率、潤濕時間等各項性能指標有密切關系。李磊等[19]在研制解淀粉芽胞桿菌Ht-q6 可濕性粉劑時選用硅藻土作為載體、分散劑為木質素磺酸鈉、十二烷基苯磺酸鈉為潤濕劑、保護劑為抗壞血酸，此時潤濕時間為45 s、懸浮率為85.6%。本試驗研制的可濕性粉劑的配方為高嶺土、聚乙二醇、羧甲基纖維素鈉和可溶性淀粉，制成的可濕性粉劑活菌數(shù)580.00 億·g-1、懸浮率86%、潤濕時間為89 s，主要指標均性能優(yōu)于農藥可濕性粉劑的國家標準[20]，與李磊等[19]研究結果比較接近。但是潤濕時間增加一半，可能是載體和助劑的細度不一樣導致。通過辣椒果實離體試驗和盆栽試驗證實，貝萊斯芽孢桿菌JK-1 可濕性粉劑能減輕辣椒褐腐病的發(fā)生，防治效果為64.40%，同時能促進辣椒植株的生長，株高增加32.65%、莖粗增加17.39%、根長增加14.10%。相關研究表明，貝萊斯芽孢桿菌能產(chǎn)生IAA 和鐵離子載體，促進植物生長[21]。因此，貝萊斯芽孢桿菌制成的可濕性粉劑既可作為殺菌劑也可作為微生物菌肥使用。