不同濃度L-Met 在擬南芥幼苗根系發(fā)育中的功能分析

王 雷，劉國蘭,2,3

（1. 濱州學(xué)院 生物與環(huán)境工程學(xué)院，山東 濱州 256603; 2. 山東省黃河三角洲生態(tài)環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濱州 256603; 3. 山東省黃河三角洲野生植物資源開發(fā)利用工程技術(shù)研究中心，山東 濱州 256603）

根是植物吸收土壤水分和礦質(zhì)營養(yǎng)的重要器官，為植物體提供機(jī)械支撐使其固定在土壤里。根系發(fā)育好壞直接影響作物地上部的生長狀況，很大程度上決定著作物的產(chǎn)量，因此對(duì)根系生長發(fā)育的研究具有重要的理論價(jià)值和實(shí)踐意義[1-2]。擬南芥作為雙子葉植物，其根系屬于直根系，主根發(fā)達(dá)，發(fā)揮著重要的作用，而作為根生命活動(dòng)最為旺盛的部位-主根根尖，在根生長發(fā)育中作用是極其重要的[2-3]。從縱向上來看，擬南芥的根尖從向上依次可劃分為根冠、分生區(qū)、伸長區(qū)和成熟區(qū)[2,4]。其中，根冠位于根尖的最頂端內(nèi)含淀粉粒，可以保護(hù)幼嫩的分生區(qū)并與根向地性有關(guān)。根尖的頂端分生組織（root apical meristem, RAM）也叫根尖生長點(diǎn)，該區(qū)域的細(xì)胞具有持續(xù)分裂產(chǎn)生新的細(xì)胞的能力[2,4]。分生區(qū)與伸長區(qū)之間的區(qū)域被稱為過渡區(qū)，過渡區(qū)的細(xì)胞分裂速度變慢，細(xì)胞變長并向伸長區(qū)轉(zhuǎn)化[2,4]。伸長區(qū)細(xì)胞進(jìn)行伸長生長，細(xì)胞體積變大，最終細(xì)胞分化形成成熟區(qū)，此區(qū)表皮細(xì)胞部分發(fā)育成根毛，因此又稱之為根毛區(qū)[3-4]。根分生區(qū)從縱切面看，從外到內(nèi)依次為表皮，皮層，內(nèi)皮層，中柱鞘和中柱[4-5]。擬南芥根尖的幾大區(qū)域的組織和細(xì)胞都起源于位于根尖的一群具有無限增殖能力而本身保持未分化狀態(tài)，可以自我更新并能夠持續(xù)分裂形成新的子細(xì)胞－根干細(xì)胞[2,7]。根干細(xì)胞及中央的是幾乎不進(jìn)行分裂的細(xì)胞組成根干細(xì)胞靜止中心（quiescent Center，QC）[6-8]。

Met 是脊椎動(dòng)物包括人體的一種必需的含硫氨基酸[2,9-10]，具有多種生理功能，在植物中，Met 也是一種基本的代謝物，在胞內(nèi)代謝中處于一個(gè)核心環(huán)節(jié)的位置[2,11-12]。前人研究發(fā)現(xiàn)，小部分的Met將用來參與蛋白質(zhì)的合成，大部分的Met 將作為腺苷甲硫氨酸（SAM）的合成前體發(fā)揮作用[2,13-14]。Met 作為體內(nèi)最重要的甲基供體，為DNA、RNA、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、生物堿、膽堿、果膠、植物甾醇等甲基化修飾提供甲基[2,13-14]。作為甲基供體，Met 通過SAM 調(diào)控細(xì)胞分裂、細(xì)胞壁合成、葉綠素合成，以及膜的合成等重要生物學(xué)過程[2,14]。此外，在高等植物中，Met 也是植物激素乙烯的合成前體物質(zhì)[15-16]。研究發(fā)現(xiàn)，Met 也可為多胺合成過程提供丙胺基，在細(xì)胞分裂分化、細(xì)胞凋亡、基因表達(dá)，以及穩(wěn)態(tài)維持等生物學(xué)過程發(fā)揮作用[2,15,17]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，L-Met 亦可作為一種信號(hào)分子行使功能，激活位于擬南芥活性氧ROS 形成的上游GLR Ca2+通道來調(diào)節(jié)氣孔運(yùn)動(dòng)和植物生長發(fā)育[18]。前人利用營養(yǎng)缺陷突變體篩選單倍體煙草原生質(zhì)體得到了第一個(gè)需要Met 的皺葉煙草突變體（10.1/9）[13,19]。此外，土豆反義CBL 轉(zhuǎn)基因植株，Met 含量降低，導(dǎo)致植株表現(xiàn)出發(fā)育遲緩矮小，土豆塊莖變小，數(shù)量降低等產(chǎn)量降低性狀[20]。目前發(fā)現(xiàn)，外源氨基酸特別是外源Met 對(duì)植物根系生長發(fā)育的影響鮮有報(bào)道，待補(bǔ)充完善。本研究在基礎(chǔ)培養(yǎng)基上添加不同濃度梯度的外源L-Met 培養(yǎng)擬南芥幼苗，通過對(duì)幼苗主根長度、分生組織長度、皮層細(xì)胞數(shù)目的統(tǒng)計(jì)分析，探究不同濃度L-Met 在擬南芥根生長發(fā)育中的的功能。本研究結(jié)果有益獲得利于根系生長的最佳外源甲硫氨酸添加濃度，這將為促進(jìn)植物生長，作物增產(chǎn)增收提供重要的理論參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 植物材料 本研究中擬南芥材料均為擬南芥哥倫比亞型種子Columbia（Col-0）。

1.1.2 主要儀器與試劑 本研究用到的儀器包括高壓滅菌鍋（北京發(fā)恩科貿(mào)D-1），純水機(jī)（北京普析GWB-2T），電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒DHP-9082)，試驗(yàn)電爐（天津市泰斯特儀器DK-98-Ⅱ），電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒），移液器（2.5 μL，10 μL，20 μL，200 μL，1mL（Thermo Scientific）），電子天平（北京艾科勒ALC-210.3），DIC 和熒光顯微鏡（OLYMPUS BX51），解剖鏡（NIKON SMZ1000）。雙人單面凈化工作臺(tái)（SW-CJ-2D，蘇州凈化設(shè)備有限公司），pH 計(jì)（SARTORIOUS PB-10），智能光照培養(yǎng)箱（上海一恒）。

本研究用到的試劑包括1/2MS 培養(yǎng)基（Phyto Technology Laboratories 公司，M5519），瓊脂（廣東環(huán)凱微生物科技有限公司），蔗糖（上海生工生物工程有限公司），氫氧化鈉（天津市福晨化學(xué)試劑廠），LMet（Sigma），阿拉伯樹膠（Sigma），水合三氯乙醛（Sigma），甘油（Sigma）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 植物MS 培養(yǎng)基的配制 1/2MS 固體培養(yǎng)基：每700 mL 超純水加入4.48 g MS 培養(yǎng)基干粉，8 g 瓊脂Agar，15 g 蔗糖，定容到1 000 mL。1 mol·L-1NaOH 調(diào)節(jié)pH 至5.6～5.8，121 ℃，高壓滅菌20 min。

滅菌結(jié)束后，超凈工作臺(tái)倒平板，對(duì)照組采用1/2MS 培養(yǎng)基直接倒平板，500 mL 可倒20 個(gè)平板。含不同L-Met 濃度梯度1/2MS 培養(yǎng)基：L-Met 配制成0.3 mg·mL-1的母液，0.2 μm 過濾膜過濾除菌分裝-20 ℃保存?zhèn)溆?；分別向冷卻至60 ℃的1/2MS 固體培養(yǎng)基中加入配制好的不同體積L-Met 母液，配制成含L-Met 濃度分別為0 μmol·L-1（A）、30 μmol·L-1（B）、60 μmol·L-1（C）、120 μmol·L-1（D）的梯度濃度培養(yǎng)基。

1.2.2 擬南芥無菌苗的培養(yǎng)及外源L-Met 添加試驗(yàn) 種子表面消毒及播種：擬南芥哥倫比亞型種子（col-0）70%乙醇依次消毒3 次，每次消毒1 min；用50%次氯酸鈉溶液（含去污劑）消毒1 次，5 min；轉(zhuǎn)移至超凈工作臺(tái)，無菌水清洗3 次至溶液變清；將種子上下顛倒混勻后傾倒在滅菌濾紙上；隨后用無菌牙簽將種子點(diǎn)播在含不同濃度L-Met 的1/2 MS培養(yǎng)基平板上，15 粒均勻排成一行，封口膜封口后置于4 ℃冰箱冷暗處理48 h。

將平皿垂直放入光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)，并保持一定的間距（以便有充分的光照）。光照培養(yǎng)條件：溫度（22±1）℃，濕度70%，16 h 光照/8 h 黑暗，16 000 lx光照強(qiáng)度。

1.2.3 幼苗表型分析 根長分析：擬南芥幼苗在1/2 MS 固體培養(yǎng)基上垂直培養(yǎng)7 d，高清像素相機(jī)拍照后用Image J 軟件（http://rsbweb.nih.gov/ij/），測(cè)量幼苗的主根長度，每次測(cè)量30～50 株。

幼苗根分生組織分析：分生組織的大小主要由從根尖靜止中心至伸長區(qū)之前的皮層細(xì)胞數(shù)目決定，取萌發(fā)7 d 的擬南芥幼苗加透明液（7.5 g 阿拉伯樹膠，100 g 水合三氯乙醛，5 mL 甘油，60 mL 水，室溫?cái)嚢杌靹?～5 h 或過夜）制片，于顯微鏡（20x 物鏡）下對(duì)根分生組織進(jìn)行拍照（n＞30）觀察。

1.3 數(shù)據(jù)分析

用Excel 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，用SPSS 進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 L-Met 參與擬南芥主根的伸長生長

生長在不含有L-Met 的1/2 MS 培養(yǎng)基上的垂直培養(yǎng)的擬南芥WT 幼苗主根生長狀態(tài)良好，生長速度較快（圖1-A）。當(dāng)L-Met 的處理濃度為30μmol·L-1時(shí)，WT 幼苗根系生長程較發(fā)達(dá)狀態(tài)（圖1-B），側(cè)根增多，主根長度與對(duì)照差異不大，或稍長。但隨著L-Met的處理濃度不斷提高，L-Met 的處理濃度為60 μmol·L-1時(shí)，WT 幼苗根系生長受到抑制（圖1-C），主根長度明顯變短，約為對(duì)照處理的三分之一長度，除此之外，地上部分的生長也稍受抑制。L-Met 的處理濃度為120 μmol·L-1時(shí)，主根生長抑制程度更顯著（圖1-D）。

圖1 不同濃度L-Met 處理下的擬南芥根系生長狀況

2.2 梯度濃度L-Met 處理下擬南芥主根長度統(tǒng)計(jì)

通過使用Image J 軟件對(duì)生長在不同濃度梯度（0、30、60、120 μmol·L-1L-Met）培養(yǎng)基上的擬南芥7 d苗齡WT 幼苗主根進(jìn)行長度測(cè)量（統(tǒng)計(jì)樣本數(shù)平均大于20）, 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)生長在不含有L-Met培養(yǎng)基上幼苗主根平均長度為（33.4±0.9）mm（圖2）。當(dāng)L-Met 的處理濃度增大為30 μmol·L-1時(shí)，主根增大0.9 mm，平均長度為（34.3±1.2）mm（圖2）。與對(duì)照處理相比較，統(tǒng)計(jì)分析，差異未達(dá)到顯著水平（P=0.058）。但隨著L-Met 的處理濃度不斷提高，LMet 的處理濃度為60 μmol·L-1時(shí)，根系生長受到抑制，主根長度明顯變短，統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示平均長度為（12.0±0.4）mm，與對(duì)照處理相比較，差異極顯著（P＜0.01）（圖2）。當(dāng)L-Met 的處理濃度增大至120 μmol·L-1時(shí)，主根生長抑制作用更加顯著，平均長度為（10.0±0.7）mm，與對(duì)照處理相比較，差異極顯著（P＜0.01）（圖2）。

圖2 梯度濃度L-Met 處理下擬南芥主根長度

2.3 L-Met 處理后擬南芥根尖分生組織的變化

通過對(duì)根尖進(jìn)行透明處理，顯微鏡拍照得到不同梯度濃度L-Met 處理下的根尖分生組織照片。圖3-A 為無添加L-met 處理下WT 的根尖分生組織，白色豎線標(biāo)記的為根分生組織區(qū)域，是指從根尖靜止中心到過渡區(qū)的皮層細(xì)胞的區(qū)段。圖3-B 為30 μmol·L-1L-Met 處理下WT 的根尖分生組織照片，處于不斷分裂狀態(tài)的皮層細(xì)胞及根尖干細(xì)胞分裂活動(dòng)比較旺盛。圖3-C 為60 μmol·L-1L-Met 處理下WT 的根尖分生組織的長度狀態(tài)，與對(duì)照相比較，根尖出現(xiàn)分化，分裂細(xì)胞減少。圖3-D 為120 μmol·L-1L-Met 處理下WT 的根尖分生組織的長度狀態(tài)，隨L-Met 濃度的增大，根尖分化程度愈趨嚴(yán)重，分裂細(xì)胞銳減。

圖3 梯度濃度L-Met 處理下擬南芥主根根尖分生組織

2.4 L-Met 處理后擬南芥根尖分生組織長度及皮層細(xì)胞數(shù)的統(tǒng)計(jì)

通過對(duì)生長在不同濃度梯度L-Met 培養(yǎng)基上的擬南芥WT 幼苗主根進(jìn)行根尖分生組織長度進(jìn)行測(cè)量，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)生長在不含有L-Met 的普通培養(yǎng)基上幼苗根尖分生組織平均長度為（243.0±9.1）μm。當(dāng)L-Met 的處理濃度增大至30 μmol·L-1時(shí)，根尖分生組織變長，平均長度增至（254.2±5.6）μm，但與對(duì)照相比差異不顯著。隨L-Met 的處理濃度提高，L-Met 的處理濃度為60 μmol·L-1時(shí)，根尖分生組織變短，平均長度為（165.4±10.9）μm，與對(duì)照處理相比較，差異極顯著（P＜0.01）。當(dāng)L-Met 的處理濃度增大至120 μmol·L-1時(shí)，分生組織繼續(xù)分化，平均長度為（122.1±13.6）μm，與對(duì)照處理相比較，差異極顯著（P＜0.01）（圖4-A）。

筆者同時(shí)對(duì)所統(tǒng)計(jì)的根尖分生組織區(qū)域所對(duì)應(yīng)的皮層細(xì)胞數(shù)目進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，圖4-B 中所示，不含有L-Met 的普通培養(yǎng)基上幼苗根尖皮層細(xì)胞約（36.0±1.5）個(gè)；30 μmol·L-1濃度處理下，皮層細(xì)胞數(shù)增加，平均增至為（38.0±0.9）個(gè)；60 μmol·L-1濃度處理下，皮層細(xì)胞數(shù)銳減，平均降為（23.0±2.1）個(gè)，與對(duì)照處理相比較，差異極顯著（P＜0.01）；濃度增加至120 μmol·L-1時(shí)，皮層細(xì)胞數(shù)繼續(xù)降低，平均降為（18.0±2.0）個(gè)，與對(duì)照處理相比較，差異極顯著（P＜0.01）。

圖4 梯度濃度L-Met 處理下擬南芥根尖分生組織長度及皮層細(xì)胞數(shù)目

通過梯度濃度的L-Met 對(duì)擬南芥幼苗進(jìn)行處理，擬南芥根尖分生組織長度及皮層細(xì)胞數(shù)都呈現(xiàn)同時(shí)增加或降低的相同趨勢(shì)。這說明L-Met 對(duì)擬南芥幼苗根生長發(fā)育的影響不是通過調(diào)節(jié)細(xì)胞大小體積實(shí)現(xiàn)的，而是通過調(diào)劑具有分裂能力的細(xì)胞數(shù)目的多少影響根的長度。L-Met 通過抑制根尖分生組織的分裂活性進(jìn)而抑制主根生長。

3 討論與結(jié)論

本試驗(yàn)主要是從研究甲硫氨酸對(duì)于植物根系生長發(fā)育的影響出發(fā)，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加梯度濃度的L-Met（0、30、60、120 μmol·L-1），光下培養(yǎng)7 d 后進(jìn)行觀察統(tǒng)計(jì)分析。我們分別測(cè)定了主根長度，根尖分生組織長度以及皮層細(xì)胞數(shù)目等指標(biāo)，試驗(yàn)結(jié)果顯示，低濃度（30 μmol·L-1）的L-Met 可以促進(jìn)擬南芥根系生長，主根變長，側(cè)根數(shù)目目測(cè)增多，但未達(dá)到差異顯著水平。與此同時(shí)，隨著L-Met 濃度的增加，其對(duì)根系生長的促進(jìn)作用并不是梯度增強(qiáng)的。相反，L-Met 濃度越高，表現(xiàn)出對(duì)根系生長的抑制作用越強(qiáng)，即濃度大于60 μmol·L-1時(shí)，擬南芥主根生長明顯受抑制，根尖分生區(qū)細(xì)胞逐步分化，皮層細(xì)胞數(shù)目減少，進(jìn)而導(dǎo)致根尖分生組織變短，且差異極顯著。繼續(xù)增大L-Met 濃度至120 μmol·L-1時(shí)，根尖分生區(qū)細(xì)胞分化愈發(fā)嚴(yán)重，L-Met 通過抑制根尖分生組織細(xì)胞分裂活性進(jìn)而導(dǎo)致主根生長緩慢，根生長受抑制效應(yīng)也更加明顯，統(tǒng)計(jì)分析差異極顯著。由此可以推斷，當(dāng)L-Met 濃度增大至一定范圍，植物將不能正常萌發(fā)生長，甚至死亡。本研究還發(fā)現(xiàn)，LMet 濃度范圍在0～30 μmol·L-1范圍，是可以促進(jìn)植物根系的生長發(fā)育的，因此可以尋找一個(gè)最佳LMet 濃度添加到培養(yǎng)基或其他培養(yǎng)介質(zhì)中，為促進(jìn)植物生長，作物增產(chǎn)增收提供新的思路。

本研究發(fā)現(xiàn)，L-Met 濃度范圍在0～30 μmol·L-1范圍附近，可以促進(jìn)植物根系的生長發(fā)育，但促進(jìn)根系生長的L-Met 最適宜濃度還有待驗(yàn)證。擬南芥根尖在L-Met 濃度在增大至60 μmol·L-1會(huì)抑制根系生長，那么具體添加多少L-Met 濃度對(duì)促進(jìn)擬南芥的生長效應(yīng)最高，從多少L-Met 濃度開始對(duì)擬南芥的根系發(fā)育出現(xiàn)抑制還需要進(jìn)一步探索。