‘魯麗’ב紅1#’蘋(píng)果雜交群體全基因組KASP標(biāo)記開(kāi)發(fā)及驗(yàn)證

鄭文燕，常源升，何平，何曉文，王森，高文勝，李林光，王海波

‘魯麗’ב紅1#’蘋(píng)果雜交群體全基因組KASP標(biāo)記開(kāi)發(fā)及驗(yàn)證

1山東省果樹(shù)研究所，山東泰安 271000；2山東省農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心，濟(jì)南 250100

【目的】利用‘魯麗’ב紅1#’親本及雜交后代，開(kāi)發(fā)蘋(píng)果葉片性狀競(jìng)爭(zhēng)性等位基因特異PCR（kompetitive allele-specific PCR，KASP）標(biāo)記，為蘋(píng)果光能高效利用育種提供參考?！痉椒ā恳浴旣悺虸型紅肉蘋(píng)果‘紅1#’及其134個(gè)雜交后代的幼嫩葉片為材料，調(diào)查葉片性狀表型（包括葉片長(zhǎng)度、寬度、葉綠素含量、花青苷含量、光合參數(shù)和葉綠素?zé)晒鈪?shù)等）數(shù)據(jù)。采用Illumina HiSeq 2500測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行全基因組重測(cè)序，通過(guò)短序列比對(duì)軟件將測(cè)序序列（reads）回貼到蘋(píng)果參考基因組，利用GATK軟件工具包檢測(cè)單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphisms, SNP）標(biāo)記。【結(jié)果】‘魯麗’和‘紅1#’及其134個(gè)雜交后代重測(cè)序得到有效reads數(shù)分別為164 776 660、149 482 876和3 927 370 200。與蘋(píng)果參考基因組比對(duì)率分別為98.77%、98.89%和97.79%。共檢測(cè)到6 445 766個(gè)SNP。經(jīng)過(guò)濾后獲得94 208個(gè)特異性強(qiáng)，準(zhǔn)確性高的SNP位點(diǎn)。對(duì)每個(gè)SNP進(jìn)行KASP引物設(shè)計(jì)，最終開(kāi)發(fā)了5 802個(gè)蘋(píng)果全基因KASP標(biāo)記。這些KASP標(biāo)記的多態(tài)性信息含量（polymorphism information content，PIC）平均值為0.31，PIC大于0.35的占30.13%。Simpson遺傳多樣性指數(shù)在0.01—0.67，平均每個(gè)位點(diǎn)遺傳多樣性指數(shù)為0.53。觀測(cè)雜合度平均值為0.32。KASP標(biāo)記所在基因的KEGG功能聚類分析顯示，“葉酸介導(dǎo)的一碳代謝途徑”是差異基因富集最顯著的途徑。通過(guò)對(duì)‘魯麗’ב紅1#’雜交群體24個(gè)葉片相關(guān)性狀進(jìn)行表型調(diào)查，結(jié)果顯示親本‘魯麗’和‘紅1#’在葉片凈光合速率、氣孔導(dǎo)度（Gs）等性狀的表型值均存在顯著差異。雜交后代表型變異幅度較大，各性狀分離廣泛。隨后對(duì)雜交群體葉片性狀表型值與KASP標(biāo)記基因型進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)合KASP標(biāo)記注釋，篩選得到21個(gè)與葉片大小、Gs和色素含量性狀顯著相關(guān)的KASP標(biāo)記。【結(jié)論】利用‘魯麗’和‘紅1#’及其134個(gè)雜交后代全基因組重測(cè)序數(shù)據(jù)開(kāi)發(fā)了5 802個(gè)蘋(píng)果全基因組KASP標(biāo)記，獲得21個(gè)與葉片性狀顯著相關(guān)的KASP標(biāo)記，為開(kāi)展標(biāo)記輔助蘋(píng)果光能高效利用育種提供了理論參考。

蘋(píng)果；全基因組重測(cè)序；葉片性狀；KASP標(biāo)記

0 引言

【研究意義】蘋(píng)果（Borkh.）是我國(guó)最重要的栽培果樹(shù)之一，其產(chǎn)量和面積均居世界首位，在鄉(xiāng)村產(chǎn)業(yè)振興中發(fā)揮了舉足輕重的作用[1]。近年來(lái)，在國(guó)家引導(dǎo)“林果業(yè)上山上坡，鼓勵(lì)利用‘四荒’資源，不與糧爭(zhēng)地”的政策背景下，如何提高果樹(shù)生產(chǎn)力，成為重要課題。目前，生產(chǎn)中主要通過(guò)高光效樹(shù)形改造，構(gòu)建豐產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)的葉幕結(jié)構(gòu)，提高光能利用效率，以提高蘋(píng)果果實(shí)品質(zhì)和產(chǎn)量，而比較不同品種的光合性能，挖掘光能利用潛力，加強(qiáng)光能高效利用品種的選育將為蘋(píng)果高光效研究提供更多的有效途徑，同時(shí)對(duì)提升蘋(píng)果產(chǎn)量和質(zhì)量具有重要意義[2-4]。長(zhǎng)期以來(lái)，常規(guī)雜交仍是蘋(píng)果育種的主要手段，但童期長(zhǎng)，自交不親和，遺傳雜合度高，缺乏對(duì)目標(biāo)性狀早期預(yù)選方法，導(dǎo)致蘋(píng)果常規(guī)雜交育種周期長(zhǎng)、成本高、效率低。隨著測(cè)序技術(shù)日趨成熟，遍布于基因組且易于檢測(cè)的共顯性單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphisms，SNP）標(biāo)記被廣泛開(kāi)發(fā)，已成為作物基因分型和遺傳研究的基本工具[5-6]，其高效、快速、高通量的特點(diǎn)，對(duì)蘋(píng)果育種實(shí)現(xiàn)早期選擇，提高效率具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】競(jìng)爭(zhēng)性等位基因特異性PCR（kompetitive allele-specific PCR，KASP）是SNP高通量分型的主流技術(shù)，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于作物的遺傳圖譜構(gòu)建、基因精細(xì)定位、分子標(biāo)記輔助育種和品種鑒定等[7-9]。在蘋(píng)果中，已經(jīng)開(kāi)發(fā)了不同性狀的KASP標(biāo)記，如蘋(píng)果抗黑星病、抗白粉病和抗綿蚜性狀[10]、果實(shí)酸含量[11]、水分利用效率相關(guān)性狀[12]、蘋(píng)果果實(shí)輪紋病抗病性[13]、蘋(píng)果果皮著色度[14]、硬度脆度保持性[15]、砧木耐鹽堿性[16]、蘋(píng)果虎皮病性狀[17]等。利用這些KASP標(biāo)記可大幅度提高分子檢測(cè)可視化程度，實(shí)現(xiàn)了高通量、低成本應(yīng)用，推動(dòng)蘋(píng)果分子育種發(fā)展[18]。葉片光合特性和葉綠素?zé)晒鈪?shù)是用于評(píng)價(jià)CO2固定光能利用效率的有用指標(biāo)[19]，鑒定出這些參數(shù)的遺傳位點(diǎn)，則可以利用標(biāo)記輔助育種改善光合特性，對(duì)進(jìn)行光能高效利用育種提供參考。【本研究切入點(diǎn)】葉片性狀正受到高度重視[20-22]，植物葉片形狀，葉綠素含量、凈光合速率和葉綠素?zé)晒鈪?shù)等均屬于微效多基因控制的數(shù)量性狀，由復(fù)雜的遺傳網(wǎng)絡(luò)調(diào)控[23-24]。分子標(biāo)記技術(shù)可快速、準(zhǔn)確地鑒定植物數(shù)量性狀，目前分子標(biāo)記技術(shù)已應(yīng)用于多種作物葉片性狀研究，但尚未獲得與蘋(píng)果葉片性狀相關(guān)的KASP標(biāo)記[25]。研究表明，蘋(píng)果光合效率表現(xiàn)出明顯的雜種優(yōu)勢(shì)，雜交后代有更強(qiáng)固定大氣CO2的能力，更具豐產(chǎn)潛能。通常綠葉凈光合速率較高，紅葉光合功能期較長(zhǎng)，使用凈光合速率或光合功能期變異較大的品種雜交，更易于從雜交群體中選出具有光合優(yōu)勢(shì)的后代[26-27]?；诖?，本研究以‘魯麗’與I型紅肉蘋(píng)果‘紅1#’構(gòu)建的遺傳群體為材料進(jìn)行葉片性狀的KASP標(biāo)記開(kāi)發(fā)。其中，紅肉蘋(píng)果（f.）作為新疆野蘋(píng)果（）的紅肉變型，是蘋(píng)果育種的重要資源[28-29]?！t1#’果肉和葉片均為紅色?！旣悺O(píng)果通過(guò)‘藤木一號(hào)’ב皇家嘎啦’雜交育成，其果肉白色，葉片綠色?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】通過(guò)對(duì)‘魯麗’與I型紅肉蘋(píng)果‘紅1#’構(gòu)建的遺傳群體進(jìn)行全基因組重測(cè)序，開(kāi)發(fā)蘋(píng)果全基因組KASP標(biāo)記，篩選出與葉片大小、葉綠素含量、光合參數(shù)和葉綠素?zé)晒鈪?shù)等性狀顯著相關(guān)的KASP標(biāo)記，為開(kāi)展標(biāo)記輔助育種提供理論參考。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2021年在山東省果樹(shù)研究所分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.1 材料

‘魯麗’（）ב紅1#’（f）雜交組合：該群體于2018年進(jìn)行雜交，2019年獲得雜種實(shí)生苗，當(dāng)年8月份芽接至M9T337矮化自根砧，定植于山東省泰安市岱岳區(qū)山東省果樹(shù)研究所天平湖試驗(yàn)站，常規(guī)管理。2020年4月觀察蘋(píng)果葉片顏色，淘汰非紅葉的假雜種植株，選取134株F1實(shí)生后代連同雙親進(jìn)行全基因組重測(cè)序。圖1為親本和3株典型后代葉片形態(tài)照片。

圖1 親本‘魯麗’和‘紅1#’及其3株雜交后代第4—10片葉片形態(tài)

1.2 表型測(cè)量

1.2.1 葉片形態(tài)指標(biāo) 2021年8月采集136株蘋(píng)果葉片樣品，取當(dāng)年生枝條由上向下數(shù)第5—7片葉子，每株不少于20片成熟葉，采用CID公司生產(chǎn)的手持葉面積儀（CID-202，美國(guó)）測(cè)量葉片的葉面積、葉長(zhǎng)、葉寬和葉片周長(zhǎng)。

1.2.2 葉片生理指標(biāo)

①葉片總花青苷含量測(cè)定：取10片上述成熟葉片堆疊在一起，利用打孔器打成10個(gè)小葉盤(pán)（直徑約0.7 cm），稱取0.1 g，用液氮研磨成粉末后，在酸化甲醇中（1% HCl-CH3OH）提取蘋(píng)果葉片總花青素，并通過(guò)pH示差法測(cè)量總花青素含量[30-31]。pH 1.0的樣品稀釋液為氯化鉀緩沖液（0.025 mol?L-1、50 mmol?L-1KCl、150 mmol?L-1HCl），pH 4.5的樣品稀釋液為乙酸鈉緩沖液（0.4 mol?L-1、400 mmol?L-1CH3COONa、240 mmol?L-1HCl），利用紫外分光光度計(jì)OPTIMA SP-3000DB（日本）測(cè)量530 nm和700 nm處樣品稀釋液的吸光度。葉片總花青苷含量計(jì)算公式為：

花青苷含量（mg?g-1）=（A×MW×DF）/ε×W。

式中，A：吸光度，A=(A530-A700) pH 1.0-(A530-A700) pH 4.5；MW：矢車(chē)菊素-3-葡萄糖苷的分子量；DF：稀釋因子；ε：矢車(chē)菊素-3-葡萄糖苷的消光系數(shù)；W：樣品重量。

②葉片葉綠素含量測(cè)定：使用ARNON[32]描述的方法，在80%的丙酮溶液中提取葉綠素。在645 nm和663 nm處測(cè)量提取液的吸光度，葉綠素含量計(jì)算公式如下：

Chla (mg?g-1)=(12.7 A645-2.69 A663)×V/1000W；

Chlb (mg?g-1)=(22.9 A645-4.68 A663)×V/1000W；

Chl (a+b) (mg?g-1)=(20.2 A645+8.02 A663) ×V/1000W。

式中，Chla：葉綠素a；Chlb：葉綠素b；A：吸光度值；V：80%丙酮萃取液的體積；W：樣品重量。

1.2.3 葉綠素?zé)晒馓匦?使用Porket PEA植物效率分析儀（Hansatech，英國(guó)）測(cè)定蘋(píng)果發(fā)育枝頂端由上至下第6片功能葉的58個(gè)熒光參數(shù)。本研究重點(diǎn)選取9個(gè)進(jìn)行KASP標(biāo)記與性狀的關(guān)聯(lián)分析，如PSII最大光能轉(zhuǎn)化效率（v/m），單位反應(yīng)中心吸收的光能（ABS/RC），單位反應(yīng)中心耗散的能量（DIo/RC）以及單位反應(yīng)中心捕獲的能量（TRo/RC）等。測(cè)定前將葉片遮光暗適應(yīng)30 min，以確保PSII反應(yīng)中心完全開(kāi)放[33]。

1.2.4 葉片光合速率 使用美國(guó)PP SYSTEMS公司CIRAS-3便攜式光合測(cè)定系統(tǒng)測(cè)定蘋(píng)果發(fā)育枝頂端由上至下第6片功能葉片的凈光合速率（Pn）、細(xì)胞間CO2濃度（Ci）、氣孔導(dǎo)度（Gs）、蒸騰速率（Tr）、水分利用效率（WUE）和大氣蒸汽壓虧缺（VPD）。

1.2.5 表型數(shù)據(jù)分析 使用SPSS17.0 軟件處理表型數(shù)據(jù)，參照Z(yǔ)heng等[14]對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析、相關(guān)分析和描述統(tǒng)計(jì)。

1.3 DNA提取和全基因組重測(cè)序

取‘魯麗’和‘紅1#’及其134個(gè)雜交后代的幼嫩葉片，采用改良的CTAB法提取基因組DNA[10]。采用Illumina HiSeq 2500測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行DNA雙末端PE150測(cè)序，150 bp讀長(zhǎng)（Illumina，San Diego，CA，USA）。測(cè)序深度：‘魯麗’32×，‘紅1#’30×，雜交后代平均5.13×。采用Burrows-Wheeler Aligner（BWA）軟件將重測(cè)序獲得的測(cè)序reads回貼到蘋(píng)果參考基因組上（https://iris.angers.inra.fr/gddh13/）以進(jìn)行后續(xù)的變異分析[34]。采用GATK軟件工具包用于親本、子代與參考基因組之間SNP和InDel檢測(cè)，SnpEff軟件用于SNP和InDel變異的注釋[35-36]。

1.4 KASP標(biāo)記開(kāi)發(fā)

利用GATK軟件工具包進(jìn)行SNP的鑒定后，經(jīng)過(guò)vcftools軟件對(duì)SNP過(guò)濾分析，首先保留最小基因組覆蓋深度＞5×，標(biāo)記質(zhì)量值＞30，最小完整度＞0.7，最小等位基因頻率0.05，雙等位基因的位點(diǎn)；其次，選擇多態(tài)信息含量（polymorphism information content，PIC）≥0.2，期望雜合度≥0.2的SNP位點(diǎn)；然后，使用RepeatMasker軟件標(biāo)記基因組重復(fù)序列，去除重復(fù)序列上的SNP標(biāo)記；最終，截取SNP標(biāo)記上下游各50 bp序列，然后使用blast軟件把序列比對(duì)參考基因組，去除比對(duì)上2個(gè)（包括原有位置）及2個(gè)以上位置的標(biāo)記。對(duì)每個(gè)SNP標(biāo)記進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，使用引物設(shè)計(jì)軟件primer 3.0，只有引物設(shè)計(jì)成功的SNP位點(diǎn)才認(rèn)為是合格的KASP標(biāo)記，使用合格的KASP標(biāo)記進(jìn)行下游分析。

1.5 群體遺傳結(jié)構(gòu)分析

基于開(kāi)發(fā)的全基因組KASP標(biāo)記，通過(guò)軟件包pca3d（版本：0.10）進(jìn)行主成分分析（principal components analysis，PCA）分析，得到樣品的主成分聚類情況[37]。使用軟件FastTree（版本：2.1.3）中的極大似然法（maximum likelihood，ML）構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)[38]。使用STRUCTURE（版本：2.3.1）軟件進(jìn)行群體遺傳結(jié)構(gòu)分析。使用TASSEL軟件（版本：5.2.59）計(jì)算親緣關(guān)系。使用plink軟件（版本：v1.90b6.24）計(jì)算HWE。

1.6 KASP標(biāo)記及其所在的基因注釋

采用ANNOVAR軟件對(duì)KASP標(biāo)記及其所在基因進(jìn)行注釋。SNP起始位點(diǎn)上游2 kb內(nèi)為upstream，終止位點(diǎn)下游2 kb內(nèi)為downstream。利用GO（http:// www.geneontology.org/）和KEGG（http://www.genome. jp/kegg）數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)KASP標(biāo)記所在的差異基因進(jìn)行功能聚類。利用薔薇科基因組數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www. rosaceae.org/）和Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.uniprot. org/）中的功能注釋信息查看相應(yīng)蛋白質(zhì)的功能。

2 結(jié)果

2.1 蘋(píng)果全基因組重測(cè)序和SNP標(biāo)記的開(kāi)發(fā)

通過(guò)Illumina HiSeq 2500測(cè)序平臺(tái)對(duì)‘魯麗’和‘紅1#’及其134個(gè)雜交F1代進(jìn)行全基因組重測(cè)序，共得到635 Gb有效數(shù)據(jù)（clean data）。其中，‘魯麗’得到的有效數(shù)據(jù)為24.68 Gb，‘紅1#’得到的有效數(shù)據(jù)為22.39 Gb，134個(gè)雜交后代總數(shù)據(jù)量為588.15 Gb。Q30均達(dá)到90%以上，GC平均含量為38.61%（表1）。使用短序列比對(duì)將有效數(shù)據(jù)與GDDH13蘋(píng)果參考基因組序列進(jìn)行比對(duì)[34]，計(jì)算出兩個(gè)親本和雜交后代的測(cè)序數(shù)據(jù)比對(duì)率，比對(duì)率分別為98.77%、98.89%和97.79%，這也證實(shí)了測(cè)序數(shù)據(jù)的質(zhì)量良好，可以繼續(xù)對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行SNP數(shù)據(jù)分析。

表1 重測(cè)序數(shù)據(jù)匯總表

使用GATK軟件[35]檢測(cè)親本和134個(gè)雜交后代與參考基因組之間的SNP位點(diǎn)，共檢測(cè)到SNP位點(diǎn)6 445 766個(gè)，平均每條染色體含有9 820個(gè)，不同染色體的SNP數(shù)量在278 600—525 072個(gè)，相對(duì)應(yīng)的SNP密度在7 858—11 097個(gè)/Mb；總體上，SNP標(biāo)記的數(shù)量與染色體長(zhǎng)度呈正相關(guān)，例如15號(hào)染色體長(zhǎng)度最長(zhǎng)（54.945 Mb），檢測(cè)到的SNP數(shù)量較多，為525 072個(gè)，其SNP密度為9 556個(gè)/Mb；在較短的1號(hào)染色體上檢測(cè)到的SNP數(shù)量最少，為278 600個(gè)，其SNP密度為8 539個(gè)/Mb（表2）。

表2 過(guò)濾前后染色體上的SNP統(tǒng)計(jì)

2.2 蘋(píng)果SNP標(biāo)記的篩選和KASP引物設(shè)計(jì)

為獲得特異性強(qiáng)和準(zhǔn)確性高的高質(zhì)量SNP位點(diǎn)，使用Vcftools、RepeatMasker以及blast等軟件對(duì)全基因組SNP篩選，去除缺失率＞30%，PIC＜0.2，以及截取SNP上、下游各50 bp序列內(nèi)還有其他變異的位點(diǎn)后獲得94 208個(gè)SNP位點(diǎn)。過(guò)濾后，SNP個(gè)數(shù)在3 216—7 431，相對(duì)應(yīng)的SNP密度在89—189個(gè)/Mb（表2）。對(duì)每個(gè)SNP標(biāo)記進(jìn)行KASP引物設(shè)計(jì)，有5 802個(gè)SNP位點(diǎn)設(shè)計(jì)成功，轉(zhuǎn)化成KASP標(biāo)記，轉(zhuǎn)化后的KASP標(biāo)記在蘋(píng)果各條染色體上的分布如圖2所示，開(kāi)發(fā)的KASP標(biāo)記覆蓋全部染色體，在各染色體上基本均勻分布，使用這些KASP標(biāo)記進(jìn)行后續(xù)群體進(jìn)化及KASP標(biāo)記注釋等分析。

橫坐標(biāo)代表染色體的物理位置，窗口大小為0.1 Mb；縱坐標(biāo)代表染色體；綠色到紅色代表KASP標(biāo)記密度由低到高的區(qū)域

對(duì)開(kāi)發(fā)5 802個(gè)KASP標(biāo)記的SNP位點(diǎn)的缺失率、PIC、遺傳多樣性指數(shù)和觀測(cè)雜合度進(jìn)行分析（圖3）?？梢钥闯?，這些SNP位點(diǎn)的缺失率在0—0.29，平均值為0.15；PIC在0.2—0.375，平均值為0.31，PIC＞0.35的SNP位點(diǎn)有1 748個(gè)，比例為30.13%，其中，Hardy-Weinberg檢驗(yàn)≥0.01的SNP位點(diǎn)有717個(gè)，表明這些標(biāo)記具有較高的多態(tài)性；Simpson遺傳多樣性指數(shù)在0.01—0.67，平均每個(gè)位點(diǎn)遺傳多樣性指數(shù)為0.53；觀測(cè)雜合度在0.05—1.00，平均值為0.32（圖3）。

2.3 雜交群體進(jìn)化分析

基于開(kāi)發(fā)的5 802個(gè)KASP標(biāo)記對(duì)雜交群體分層分析，通過(guò)主成分分析，發(fā)現(xiàn)最大主成分為2.92，沒(méi)有主成分能明顯區(qū)分群體中的雜交后代（圖4-A）。隨后利用structure軟件分析群體的結(jié)構(gòu)，通過(guò)最大似然值進(jìn)行群體劃分，結(jié)果顯示預(yù)設(shè)的不同祖先個(gè)數(shù)（K），沒(méi)有清晰的群體結(jié)構(gòu)存在，劃分的亞群間來(lái)源共同祖先的關(guān)系區(qū)分不明顯。由于此群體屬于雜交群體，有共同的親本，遺傳背景相似，因此，此群體未劃分出明顯的群體結(jié)構(gòu)。利用系統(tǒng)發(fā)育分析描述雜交后代之間的關(guān)系，結(jié)果顯示雙親及其134個(gè)雜交后代主要被分成9個(gè)主要分支，其中有5個(gè)后代與父本‘紅1#’組成一個(gè)分支，有28個(gè)后代與母本‘魯麗’組成一個(gè)分支，關(guān)系較密切，而其余后代分為7個(gè)分支，表明后代之間存在較強(qiáng)的遺傳變異（圖4-B）。

2.4 KASP標(biāo)記注釋

利用ANNOVAR軟件對(duì)開(kāi)發(fā)的全基因組KASP標(biāo)記進(jìn)行注釋。對(duì)KASP-SNP位點(diǎn)的變異類型進(jìn)行分析，結(jié)果表明，SNP變異位點(diǎn)以轉(zhuǎn)換（transition，Ts）為主，約占65.3%，其中A/G和C/T SNP位點(diǎn)分別為30 595和30 523個(gè)，顛換（transversion，Tv）約占34.7%，A/T、C/G、A/C、G/T型SNP分別為9 073、5 082 、9 160和9 143個(gè)，堿基轉(zhuǎn)換發(fā)生頻率是顛換發(fā)生頻率的1.88倍（圖5-A）。

對(duì)KASP注釋位點(diǎn)的基因結(jié)構(gòu)分布區(qū)域分析，結(jié)果顯示，40 264個(gè)SNP位點(diǎn)分布在基因間區(qū)，約占43.03%，53 312個(gè)SNP（占56.97%）分布在基因區(qū)。對(duì)基因區(qū)的SNP位點(diǎn)分析，有15 839個(gè)位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游2 kb區(qū)域內(nèi)，有12 439個(gè)SNP位點(diǎn)位于轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)下游2 kb區(qū)域內(nèi)。有13 615個(gè)SNP位點(diǎn)分布在內(nèi)含子區(qū)，3 596個(gè)SNP位點(diǎn)分布在外顯子區(qū)，3 401個(gè)SNP位點(diǎn)分布在非翻譯區(qū)。對(duì)分布于外顯子區(qū)的SNP位點(diǎn)進(jìn)一步分析，有1 462個(gè)導(dǎo)致同義突變，2 078個(gè)導(dǎo)致非同義變異，44個(gè)SNP位點(diǎn)導(dǎo)致翻譯提前終止和12個(gè)SNP位點(diǎn)導(dǎo)致終止密碼子缺失（圖5-B）。

圖3 5802個(gè)SNP位點(diǎn)的缺失率（A）、多態(tài)信息含量（B）、遺傳多樣性指數(shù)（C）和觀測(cè)雜合度（D）變化分布圖

A：利用SNP標(biāo)記對(duì)‘魯麗’ב紅1#’及其134個(gè)雜交后代進(jìn)行主成分分析；B：系統(tǒng)發(fā)育分析

A：SNP位點(diǎn)變異類型及數(shù)目統(tǒng)計(jì)；B：SNP位點(diǎn)基因組分布區(qū)域注釋分析

2.5 KASP標(biāo)記所在基因注釋和富集分析

基于蘋(píng)果紅葉品種‘紅1#’和綠葉品種‘魯麗’及其134個(gè)雜交后代全基因組重測(cè)序數(shù)據(jù)，獲得了含有KASP-SNP變異位點(diǎn)所在的25 761條基因信息。為全面理解基因功能信息，在GO數(shù)據(jù)庫(kù)中注釋到19 173個(gè)基因（圖6），在KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)注釋到5 589個(gè)基因，這些基因被聚類到注釋到133條代謝途徑，參與碳水化合物代謝的基因數(shù)最多，為911個(gè)（圖7）。圖8顯示的是KEGG聚類中差異基因最顯著的前20個(gè)途徑，其中富集最顯著的通路為葉酸介導(dǎo)的一碳代謝途徑，富集因子為1.45。其次為泛醌和其他萜類-醌生物合成、卟啉和葉綠素代謝和甘油脂代謝。植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑富集到的差異基因個(gè)數(shù)最多為287個(gè)。這些代謝物質(zhì)和代謝通路可為紅葉和綠葉光合速率、葉綠素?zé)晒饧叭~綠素含量差異相關(guān)性狀的機(jī)理研究提供參考。

2.6 與葉片性狀相關(guān)的KASP標(biāo)記驗(yàn)證

為了解‘魯麗’ב紅1#’雜交群體的表型多樣性，利用SPASS 17.0軟件對(duì)親本及雜交后代葉片相關(guān)24個(gè)性狀進(jìn)行表型描述性統(tǒng)計(jì)分析（表3）。結(jié)果顯示，親本‘魯麗’和‘紅1#’在葉片凈光合速率（Pn）、氣孔導(dǎo)度（Gs）、葉綠素含量、花青素含量及單位面積電子傳遞的量子產(chǎn)額（ETo/CSo）等性狀均存在顯著差異。雜交后代表型變異幅度較大，各性狀分離明顯。如表3所示，雜交后代各性狀的表型值變異系數(shù)（coefficient of variation，CV）變化范圍為6.12%— 84.19%，單位反應(yīng)中心耗散掉的能量（DIo/RC）的CV最高，進(jìn)一步選擇的潛力較大，其次是花青苷，單位面積捕獲的光能（TRo/CSo）的CV最低。通過(guò)Shapiro-Wilk檢驗(yàn)：胞間CO2濃度、Gs、蒸騰速率、葉綠素含量、葉面積等12個(gè)性狀表型呈正態(tài)分布（＞0.05），這些性狀為等效多基因控制的數(shù)量性狀。Pn、VPD、水分利用效率、花青素含量等其他12個(gè)性狀表型分布為偏態(tài)分布，表明這些性狀可能存在主效基因或非等效基因。

圖6 KASP標(biāo)記所在基因的GO分類注釋圖

圖7 KASP標(biāo)記所在基因的KEGG富集分析

表3 ‘魯麗’ב紅1#’雜交群體葉片性狀表型分析

Ci：胞間CO2濃度；Pn：凈光合速率；Gs：氣孔導(dǎo)度；Tr：蒸騰速率；VPD：葉面飽和蒸汽壓虧缺；WUE：水分利用效率；Vc：羧化效率；Chla：葉綠素a；Chlb：葉綠素b；Chl(a+b)：總?cè)~綠素；Anthocyanin：花青苷；Area：葉面積；Length：葉片長(zhǎng)度；Width：葉片寬度；Perimeter：葉片周長(zhǎng)；v/m：PSII最大光能轉(zhuǎn)化效率；ABS/RC：?jiǎn)挝环磻?yīng)中心吸收的光能；DIo/RC：?jiǎn)挝环磻?yīng)中心耗散掉的能量；TRo/RC：?jiǎn)挝环磻?yīng)中心捕獲的能量；ETo/RC；單位反應(yīng)中心用于電子傳遞的能量；ABS/CSo：?jiǎn)挝幻娣e吸收的光能；DIo/CSo：?jiǎn)挝幻娣e熱耗散；TRo/CSo：?jiǎn)挝幻娣e捕獲的光能；ETo/CSo：?jiǎn)挝幻娣e電子傳遞的量子產(chǎn)額。Non與Normal表示蘋(píng)果葉片不同性狀表型值正態(tài)性檢驗(yàn)結(jié)果，前者為非正態(tài)分布，后者為正態(tài)分布（＞0.05）。不同小寫(xiě)字母表示雙親葉片性狀表型值之間的差異顯著性（=0.05）。下同

Ci: Intercellular CO2concentration; Pn: Net photosynthetic rate; Gs: Stomatal conductance; Tr: Transpiration rate; VPD: Vapor pressure deficit; WUE: Water use efficiency; Vc: Ccarboxylation efficiency; Chla: Chlorophyll a; Chlb: Chlorophyll b; Chl(a+b): Total chlorophyll contents;v/m: Maximum quantum yield of PSII; ABS/RC: Aabsorption flux per reaction center; DIo/RC: Heat dissipation per reaction center; TRo/RC: Maximal trapping flux per reaction center; ETo/RC: Quantum yield of electron transport per reaction center; ABS/CSo: Absorption flux per cross-section; DIo/CSo: Heat dissipation per cross-section; TRo/CSo: Maximal trapping flux per cross-section; ETo/CSo: Quantum yield of electron transport per cross-section. Non and Normal represent non normally distributed and normally distributed for phenotypes of different traits, respectively (＞0.05). Different lowercase letters indicate significance between phenotype values of the leaf traits in both parents (=0.05). The same as below

Y軸代表各個(gè)KEGG通路的名稱；X軸代表富集因子。點(diǎn)的顏色代表q值的大小，點(diǎn)的大小代表注釋在該通路中基因的數(shù)目。q值的大小由點(diǎn)的顏色表示，q值越小，顏色越接近紅色，并且每個(gè)途徑涉及的基因的數(shù)量由點(diǎn)的大小表示

結(jié)合136個(gè)蘋(píng)果全基因組重測(cè)序數(shù)據(jù)，全基因組KASP標(biāo)記以及基因功能注釋，對(duì)所有的KASP-SNP位點(diǎn)進(jìn)行篩選。首先去除雙親基因型缺失，雙親間無(wú)差異及雜交后代不分離的SNP位點(diǎn)，隨后根據(jù)20個(gè)性狀表型數(shù)據(jù)，分別選出20株表型極端高的單株和20株極端低的單株，將SNP標(biāo)記在極端表型中驗(yàn)證，并對(duì)基因型進(jìn)行卡方檢測(cè)，將卡方檢驗(yàn)顯著的標(biāo)記在38份種質(zhì)資源中驗(yàn)證，最終開(kāi)發(fā)了葉片性狀相關(guān)的KASP-SNP標(biāo)記21個(gè)。其中與葉片長(zhǎng)度相關(guān)的KASP標(biāo)記4個(gè)，定位于9和15號(hào)染色體上；與葉片寬度相關(guān)的KASP標(biāo)記4個(gè)，定位于5、11和14號(hào)染色體上。與葉面積相關(guān)的KASP標(biāo)記有1個(gè)，位于15號(hào)染色體。與氣孔導(dǎo)度相關(guān)的KASP標(biāo)記有2個(gè)，位于10號(hào)染色體上。與葉綠素a和葉綠素b相關(guān)的KASP標(biāo)記有3個(gè)，位于11和16號(hào)染色體上，與花青素相關(guān)的KASP標(biāo)記有1個(gè)，位于11號(hào)染色體上。與單位面積電子傳遞的量子產(chǎn)額相關(guān)的KASP標(biāo)記有7個(gè)，位于5和14號(hào)染色體上（表4）。

利用這些KASP標(biāo)記所在的基因及其功能注釋，篩選出與葉片葉綠素含量、氣孔導(dǎo)度性狀相關(guān)的候選基因。葉綠素b稱為光合作用的天線色素吸收光能。本研究中篩選到與葉片葉綠素b含量相關(guān)的KASP標(biāo)記。該標(biāo)記的A/C突變?cè)谀副尽旣悺O(píng)果中的基因型為A:C，在父本‘紅1#’中的基因型為A:A。在其雜交后代葉綠素b含量極端高和極端低的各20個(gè)單株中A:A與A:C基因型分離比分別為8﹕6和15﹕1，2值為5.593，卡方檢驗(yàn)達(dá)到顯著水平（20.05,1=3.84）。通過(guò)KASP標(biāo)記所在的基因功能注釋，發(fā)現(xiàn)該標(biāo)記位于乙烯響應(yīng)因子ERF轉(zhuǎn)錄因子家族的啟動(dòng)子上。

氣孔導(dǎo)度是衡量植物與氣體間平衡的重要指標(biāo)。本研究中，篩選到與氣孔導(dǎo)度性狀相關(guān)的KASP標(biāo)記定位在蘋(píng)果8和10號(hào)染色體上，分別位于和啟動(dòng)子上。在啟動(dòng)子上T/C突變的KASP標(biāo)記，在父本‘紅1#’中基因型為T(mén):C，在母本‘魯麗’中的基因型為T(mén):T，在各20株極端后代中T:T與T:C的分離比分別為8﹕9和14﹕3，2值為4.636，卡方檢驗(yàn)達(dá)到顯著水平（20.05,1=3.84）。在啟動(dòng)子上的A/G突變KASP標(biāo)記，在父本‘紅1#’中基因型為G:G，在母本‘魯麗’中的基因型為A:G，在各20株極端后代中A:G與G:G的分離比分別為0:15和6:7，2值為8.811，卡方檢驗(yàn)達(dá)到極顯著水平（20.01,1=6.63）。

表4 葉片性狀相關(guān)的21個(gè)KASP標(biāo)記

*:＜0.05; **:＜0.01.20.05,1=3.84,20.01,1=6.63,20.05,2=5.99,20.01,2=9.21

3 討論

3.1 葉片相關(guān)性狀的候選基因預(yù)測(cè)

基于‘魯麗’和‘紅1#’及其134個(gè)雜交后代全基因組測(cè)序數(shù)據(jù)開(kāi)發(fā)了全基因組KASP標(biāo)記，KEGG聚類分析發(fā)現(xiàn)共有5 589個(gè)基因被聚類到133個(gè)途徑，其中差異基因富集最顯著的通路為葉酸介導(dǎo)的一碳代謝途徑。植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑富集到的差異基因個(gè)數(shù)最多。葉酸作為一碳單位的主要供體，在酶反應(yīng)中起到轉(zhuǎn)運(yùn)一碳單位的作用，在植物中還參與了木質(zhì)素的形成以及光呼吸作用[39-40]。光呼吸與葉片光合作用密切相關(guān)，葉綠素b稱為光合作用的天線色素吸收光能。本研究中篩選到與葉片葉綠素b含量相關(guān)的KASP標(biāo)記位于乙烯響應(yīng)因子ERF轉(zhuǎn)錄因子家族的啟動(dòng)子上。ERF轉(zhuǎn)錄因子已經(jīng)被報(bào)道參與葉綠素合成與降解過(guò)程，如甜橙和，蘋(píng)果都能結(jié)合葉綠素降解相關(guān)結(jié)構(gòu)基因和啟動(dòng)子，使和上調(diào)表達(dá)，從而促進(jìn)果實(shí)或果皮葉綠素的降解[41-43]。

氣孔是光合作用吸收空氣中CO2的主要入口，氣孔導(dǎo)度（Gs）是衡量氣體通過(guò)氣孔的難易程度的重要指標(biāo)，Gs越大，氣孔阻力越小，CO2和水汽等越易通過(guò)氣孔進(jìn)行交換。目前普遍認(rèn)為脫落酸含量與氣孔運(yùn)動(dòng)有關(guān)[44]，赤霉素[45]、油菜素內(nèi)酯[46]等植物激素在調(diào)節(jié)氣孔運(yùn)動(dòng)中也發(fā)揮重要作用，且大部分與ABA產(chǎn)生互作，共同調(diào)節(jié)Gs的變化。本研究中，通過(guò)KASP標(biāo)記與性狀的相關(guān)性分析，結(jié)合基因功能注釋，重點(diǎn)篩選得到2個(gè)影響Gs的候選基因和。GID1（Gibberellin insensitive dwarf 1）為GA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的受體。BSK1（BR-signaling kinase 1）為BR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中的重要成員。根據(jù)雙親‘魯麗’（32×）和‘紅1#’（30×）的重測(cè)序數(shù)據(jù)，筆者實(shí)驗(yàn)室建立了‘魯麗’ב紅1#’的高密度遺傳連鎖圖譜，利用該連鎖圖譜對(duì)蘋(píng)果葉片相關(guān)性狀進(jìn)行了QTL定位，共定位了57個(gè)QTLs（數(shù)據(jù)未列出）。本研究中開(kāi)發(fā)的KASP標(biāo)記所在的基因、和均位于與葉片葉綠素b含量或氣孔導(dǎo)度相關(guān)的QTL區(qū)間，但是這些候選基因啟動(dòng)子發(fā)生的突變是否影響其轉(zhuǎn)錄活性及影響葉片葉綠素含量或氣孔導(dǎo)度還需要進(jìn)一步驗(yàn)證。

3.2 蘋(píng)果葉片花青素對(duì)光合作用的影響

新疆野蘋(píng)果（Roem）是現(xiàn)代栽培蘋(píng)果（Borkh）的祖先種，遺傳多樣性豐富[47]。本研究所用的I型紅肉蘋(píng)果‘紅1#’屬于新疆紅肉蘋(píng)果（），是新疆野蘋(píng)果的變型，其枝葉都是紅色[28]。啟動(dòng)子上的小衛(wèi)星重復(fù)序列調(diào)控紅肉蘋(píng)果果實(shí)著色的分子機(jī)制已有廣泛研究[48-50]，但是蘋(píng)果葉片色澤發(fā)育過(guò)程的分子機(jī)制至今尚不清楚。通過(guò)對(duì)紅葉桃的葉片著色性狀進(jìn)行遺傳規(guī)律分析，發(fā)現(xiàn)桃葉片著色是一個(gè)質(zhì)量性狀，紅葉對(duì)綠葉為顯性，且該位點(diǎn)定位在桃基因組第6染色體上[51]。對(duì)該區(qū)間內(nèi)的進(jìn)行表達(dá)量檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)在紅葉桃中表達(dá)量顯著高于綠葉，過(guò)量表達(dá)能使桃葉片變紅，表明該基因控制桃葉片著色性狀，但是使在紅葉桃中表達(dá)量升高的變異位點(diǎn)還需探索[52]。

本研究中，‘紅1#’葉片為紅葉，‘魯麗’為綠葉，雜交后代的葉片全部表現(xiàn)為紅葉，表明蘋(píng)果葉片的著色性狀是顯性基因控制的質(zhì)量性狀。與蘋(píng)果中的轉(zhuǎn)錄因子（MDP0000573302）具有較高的相似性，與控制果肉著色的為同源基因，但是在這些基因上未找到與蘋(píng)果葉片花青苷含量顯著相關(guān)的遺傳變異位點(diǎn)。通過(guò)全基因組重測(cè)序，在11號(hào)染色體上獲得與蘋(píng)果葉片花青苷含量相關(guān)的KASP3343標(biāo)記。該標(biāo)記在20株花青苷含量極高的株系和20株極端低的株系中，3種基因型CC:CA:AA的比值分別為12﹕2﹕4和3﹕2﹕13，2檢驗(yàn)達(dá)到極顯著水平。因此推測(cè)11號(hào)染色體上可能存在調(diào)控蘋(píng)果葉片色澤發(fā)育的位點(diǎn)，結(jié)合11號(hào)染色體上存在與互作的基因以提高蘋(píng)果果皮著色度的研究結(jié)果[14]，為進(jìn)一步探討蘋(píng)果葉片色澤發(fā)育提供了參考。

已有研究表明，葉片變紅主要是由于葉片中產(chǎn)生了花青素類的紅色色素，新合成花青素需要消耗能量，可能使葉片光合效率降低[53-54]。然而本研究中，與綠葉相比，‘紅1#’葉片的PSⅡ的最大捕光效率（v/m）較高，單位反應(yīng)中心吸收的光能（ABS/RC）和單位反應(yīng)中心捕獲的能量（TRo/RC）顯著增加，而用于電子傳遞的能量（ETo/RC）顯著降低。v/m與非光化學(xué)猝滅有關(guān)，秋季葉片處于高光強(qiáng)下時(shí)，葉片捕獲的光能大于光能利用率，使葉片受到光損傷脅迫，而花青苷對(duì)葉片光合組織起到了光保護(hù)作用[55-56]。同時(shí)，紅葉通過(guò)減少用于電子傳遞的能量（ETo/RC）以緩解高光強(qiáng)對(duì)葉片的傷害。另外，紅葉中含有較高的黃酮類抗氧化化合物，這些物質(zhì)對(duì)葉片起到了光保護(hù)作用[54,57]。

4 結(jié)論

利用‘魯麗’‘紅1#’及其134個(gè)雜交后代全基因組重測(cè)序數(shù)據(jù)與參考基因組比對(duì)，共檢測(cè)到6 445 766個(gè)SNP位點(diǎn)。經(jīng)過(guò)濾后，將5 802個(gè)SNP位點(diǎn)成功轉(zhuǎn)化成KASP標(biāo)記。通過(guò)對(duì)雜交群體葉片性狀表型值與KASP標(biāo)記基因型進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)合KASP標(biāo)記注釋，獲得了21個(gè)與葉片大小、氣孔導(dǎo)度和色素含量性狀顯著相關(guān)的KASP標(biāo)記。

[1] 王金政, 毛志泉, 叢佩華, 呂德國(guó), 馬鋒旺, 任小林, 束懷瑞, 李保華, 郭玉蓉, 郝玉金, 姜遠(yuǎn)茂, 張新忠, 楊欣, 曹克強(qiáng), 趙政陽(yáng), 韓振海, 霍學(xué)喜, 魏欽平. 新中國(guó)果樹(shù)科學(xué)研究70年: 蘋(píng)果. 果樹(shù)學(xué)報(bào), 2019, 36(10): 1255-1263.

WANG J Z, MAO Z Q, CONG P H, Lü D G, MA F W, REN X L, SHU H R, LI B H, GUO Y R, HAO Y J, JIANG Y M, ZHANG X Z, YANG X, CAO K Q, ZHAO Z Y, HAN Z H, HUO X X, WEI Q P. Fruit scientific research in New China in the past 70 years: Apple. Journal of Fruit Science, 2019, 36(10): 1255-1263. (in Chinese)

[2] 李民吉, 張強(qiáng), 李興亮, 周貝貝, 楊雨璋, 張軍科, 周佳, 魏欽平. 4種矮化砧木對(duì)再植蘋(píng)果幼樹(shù)生長(zhǎng)、產(chǎn)量和品質(zhì)的影響. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué), 2020, 53(11): 2264-2271. doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2020.11.012.

LI M J, ZHANG Q, LI X L, ZHOU B B, YANG Y Z, ZHANG J K, ZHOU J, WEI Q P. Effects of 4 dwarfing rootstocks on growth, yield and fruit quality of ‘fuji’ sapling in apple replant orchard. Scientia Agricultura Sinica, 2020, 53(11): 2264-2271. doi: 10.3864/j.issn. 0578-1752.2020.11.012. (in Chinese)

[3] 陳學(xué)森, 韓明玉, 蘇桂林, 劉鳳之, 過(guò)國(guó)南, 姜遠(yuǎn)茂, 毛志泉, 彭福田, 束懷瑞. 當(dāng)今世界蘋(píng)果產(chǎn)業(yè)發(fā)展趨勢(shì)及我國(guó)蘋(píng)果產(chǎn)業(yè)優(yōu)質(zhì)高效發(fā)展意見(jiàn). 果樹(shù)學(xué)報(bào), 2010, 27(4): 598-604.

CHEN X S, HAN M Y, SU G L, LIU F Z, GUO G N, JIANG Y M, MAO Z Q, PENG F T, SHU H R. Discussion on today’s world apple industry trends and the suggestions on sustainable and efficient development of apple industry in China. Journal of Fruit Science, 2010, 27(4): 598-604. (in Chinese)

[4] 趙德英, 程存剛, 仇貴生, 董雅鳳, 張彩霞, 李壯, 張懷江, 胡國(guó)君, 厲恩茂. 蘋(píng)果高質(zhì)量發(fā)展技術(shù)創(chuàng)新途徑. 中國(guó)果樹(shù), 2021(8): 1-5.

ZHAO D Y, CHENG C G, QIU G S, DONG Y F, ZHANG C X, LI Z, ZHANG H J, HU G J, LI E M. Technological innovation approach of high quality development in apple industry. China Fruits, 2021(8): 1-5. (in Chinese)

[5] GANAL M W, POLLEY A, GRANER E M, PLIESKE J, WIESEKE R, LUERSSEN H, DURSTEWITZ G. Large SNP arrays for genotyping in crop plants. Journal of Biosciences, 2012, 37(5): 821-828.

[6] THOMSON M J. High-throughput SNP genotyping to accelerate crop improvement. Plant Breeding and Biotechnology, 2014, 2(3): 195-212.

[7] SEMAGN K, BABU R, HEARNE S, OLSEN M. Single nucleotide polymorphism genotyping using kompetitive allele specific PCR (KASP): Overview of the technology and its application in crop improvement. Molecular Breeding, 2014, 33(1): 1-14.

[8] MACKAY I J, BANSEPT-BASLER P, BARBER T, BENTLEY A R, COCKRAM J, GOSMAN N, GREENLAND A J, HORSNELL R, HOWELLS R, O’SULLIVAN D M, ROSE G A, HOWELL P J. An eight-parent multiparent advanced generation inter-cross population for winter-sown wheat: Creation, properties, and validation. G3: Genes|Genomes|Genetics, 2014, 4(9): 1603-1610.

[9] PHAM A T, HARRIS D K, BUCK J, HOSKINS A, SERRANO J, ABDEL-HALEEM H, CREGAN P, SONG Q J, BOERMA H R, LI Z L. Fine mapping and characterization of candidate genes that control resistance toK. Hara in two soybean germplasm accessions. PLoS ONE, 2015, 10(5): e0126753.

[10] BAUMGARTNER I O, KELLERHALS M, COSTA F, DONDINI L, PAGLIARANI G, GREGORI R, TARTARINI S, LEUMANN L, LAURENS F, PATOCCHI A. Development of SNP-based assays for disease resistance and fruit quality traits in apple (×Borkh.) and validation in breeding pilot studies. Tree Genetics & Genomes, 2016, 12(35): 1-21.

[11] JIA D J, SHEN F, WANG Y, WU T, XU X F, ZHANG X Z, HAN Z H. Apple fruit acidity is genetically diversified by natural variations in three hierarchical epistatic genes:,and. The Plant Journal: for Cell and Molecular Biology, 2018, 95(3): 427-443.

[12] WANG H B, ZHAO S, MAO K, DONG Q L, LIANG B W, LI C, WEI Z W, LI M J, MA F W. Mapping QTLs for water-use efficiency reveals the potential candidate genes involved in regulating the trait in apple under drought stress. BMC Plant Biology, 2018, 18(1): 136.

[13] SHEN F, HUANG Z Y, ZHANG B G, WANG Y, ZHANG X, WU T, XU X F, ZHANG X Z, HAN Z H. Mapping gene markers for apple fruit ring rot disease resistance using a multi-omics approach. G3: Genes|Genomes|Genetics, 2019, 9(5): 1663-1678.

[14] ZHENG W Y, SHEN F, WANG W Q, WU B, WANG X, XIAO C, TIAN Z D, YANG X L, YANG J, WANG Y, WU T, XU X F, HAN Z H, ZHANG X Z. Quantitative trait loci-based genomics-assisted prediction for the degree of apple fruit cover color. The Plant Genome, 2020, 13(3): e20047.

[15] WU B, SHEN F, WANG X, ZHENG W Y, XIAO C, DENG Y, WANG T, HUANG Z Y, ZHOU Q, WANG Y, WU T, XUE F X, HAN Z H, ZHANG X Z. Role ofandnatural variations in apple flesh firmness/crispness retainability and development of QTL-based genomics-assisted prediction. Plant Biotechnology Journal, 2021, 19(5): 1022-1037.

[16] LIU J, SHEN F, XIAO Y, FANG H C, QIU C P, LI W, WU T, XU X F, WANG Y, ZHANG X Z, HAN Z H. Genomics-assisted prediction of salt and alkali tolerances and functional marker development in apple rootstocks. BMC Genomics, 2020, 21(1): 550.

[17] MILLER B A, TILLMAN J R, HOWARD N P, KOSTICK S A, EVANS K M, LUBY J J. A DNA test for high incidence of soft scald and soggy breakdown postharvest disorders inBorkh. Molecular Breeding, 2021, 41: 57.

[18] WINFIELD M, BURRIDGE A, ORDIDGE M, HARPER H, WILKINSON P, THOROGOOD D, COPAS L, EDWARDS K, BARKER G. Development of a minimal KASP marker panel for distinguishing genotypes in apple collections. PLoS One, 2020, 15(11): e0242940.

[19] SIMKIN A J, LóPEZ-CALCAGNO P E, RAINES C A. Feeding the world: improving photosynthetic efficiency for sustainable crop production. Journal of Experimental Botany, 2019, 70(4): 1119-1140.

[20] JIN F L, ZHANG F W, YUE X, LI M, AO X X. Correlation between leaf size and fruit quality of Kiwi. Agricultural Basic Science and Technology, 2016, 17 (11): 2472-2488.

[21] MAEDA H, AKAGI T, TAO R. Quantitative characterization of fruit shape and its differentiation pattern in diverse persimmon () cultivars. Scientia Horticulturae, 2018, 228: 41-48.

[22] 江錫兵, 章平生, 楊龍, 吳強(qiáng), 吳聰連, 吳小云, 龔榜初, 賴俊聲. 板栗和錐栗種間雜交F1代葉片表型及其遺傳變異研究. 園藝學(xué)報(bào), 2019, 46(11): 2129-2142.

JIANG X B, ZHANG P S, YANG L, WU Q, WU C L, WU X Y, GONG B C, LAI J S. Genetic variation of leaf phenotypic traits in F1 progeny of interspecific cross betweenandActa Horticulturae Sinica, 2019, 46(11): 2129-2142. (in Chinese)

[23] 張小猜, 趙政陽(yáng), 樊紅科, 黨志國(guó), 張志敏. 蘋(píng)果雜種F1代葉片性狀分離及早期選擇研究. 西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 2009, 18(5): 228-231.

ZHANG X C, ZHAO Z Y, FAN H K, DANG Z G, ZHANG Z M. Study on the leaf trait segregation of apple hybrid seedlings and application in pre-selection. Acta Agriculturae Boreali-Occidentalis Sinica, 2009, 18(5): 228-231. (in Chinese)

[24] 劉遵春, 苗衛(wèi)東, 劉大亮, 陳學(xué)森. 蘋(píng)果葉片相關(guān)性狀的QTL定位及其遺傳效應(yīng)分析. 西北植物學(xué)報(bào), 2014, 34(3): 481-487.

LIU Z C, MIAO W D, LIU D L, CHEN X S. Identification of quantitative trait loci associated with leaf traits in apple and analysis of their genetic effects. Acta Botanica Boreali-Occidentalia Sinica, 2014, 34(3): 481-487. (in Chinese)

[25] 張興平, 錢(qián)前, 張嘉楠, 鄧興旺, 萬(wàn)建民, 徐云碧. 分子植物育種助推南繁種業(yè)轉(zhuǎn)型升級(jí). 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué), 2021, 54(18): 3789-3804. doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2021.18.001.

ZHANG X P, QIAN Q, ZHANG J N, DENG X W, WAN J M, XU Y B. Transforming and upgrading off-season breeding in Hainan through molecular plant breeding. Scientia Agricultura Sinica, 2021, 54(18): 3789-3804. doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2021.18.001. (in Chinese)

[26] 呂天星, 伊凱, 劉志, 王冬梅, 閆忠業(yè), 姜孝軍, 王銘. 蘋(píng)果實(shí)生苗葉片葉綠素含量遺傳趨勢(shì). 西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 2013, 22(12): 91-95.

Lü T X, YI K, LIU Z, WANG D M, YAN Z Y, JIANG X J, WANG M. Genetic trend of leaf chlorophyll content in apple seedling plant. Acta Agriculturae Boreali-Occidentalis Sinica, 2013, 22(12): 91-95. (in Chinese)

[27] 姜衛(wèi)兵, 莊猛, 沈志軍, 宋宏峰, 曹晶, 李剛. 不同季節(jié)紅葉桃、紫葉李的光合特性研究. 園藝學(xué)報(bào), 2006, 33(3): 577-582.

JIANG W B, ZHUANG M, SHEN Z J, SONG H F, CAO J, LI G. Study on the photosynthetic characteristics of red-leaf peach and purpleleaf plum in different seasons. Acta Horticulturae Sinica, 2006, 33(3): 577-582. (in Chinese)

[28] CHEN X S, FENG T, ZHANG Y M, HE T M, FENG J R, ZHANG C Y. Genetic diversity of volatile components in Xinjiang Wild Apple (). Journal of Genetics and Genomics, 2007, 34(2): 171-179.

[29] VAN NOCKER S, BERRY G, NAJDOWSKI J, MICHELUTTI R, LUFFMAN M, FORSLINE P, ALSMAIRAT N, BEAUDRY R, NAIR M F, ORDIDGE M. Genetic diversity of red-fleshed apples (). Euphytica, 2012, 185: 281-293.

[30] GIUSTI M M, WROLSTAD R E. Characterization and measurement of anthocyanins by UV-visible spectroscopy. Current Protocols in Food Analytical Chemistry, 2001, (1): F1.2.1-1.2.13.

[31] HOSSEINIAN F S, LI W D, BETA T. Measurement of anthocyanins and other phytochemicals in purple wheat. Food Chemistry, 2008, 109(4): 916-924.

[32] ARNON D I. Copper enzymes in isolated chloroplasts. polyphenoloxidase in beta. Plant Physiology, 1949, 24(1): 1-15.

[33] DOBRáNSZKI J, MENDLER-DRIENYOVSZKI N. Cytokinin- induced changes in the chlorophyll content and fluorescence ofapple leaves. Journal of Plant Physiology, 2014, 171(16): 1472-1478.

[34] LI H, DURBIN R. Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler transform. Bioinformatics, 2009, 25(14): 1754-1760.

[35] MCKENNA A, HANNA M, BANKS E, SIVACHENKO A, CIBULSKIS K, KERNYTSKY A, GARIMELLA K, ALTSHULER D, GABRIEL S, DALY M, DEPRISTO M A. The Genome Analysis Toolkit: A MapReduce framework for analyzing next-generation DNA sequencing data. Genome Research, 2010, 20(9): 1297-1303.

[36] CINGOLANI P, PLATTS A, WANG L L, COON M, NGUYEN T, WANG L, LAND S J, LU X Y, RUDEN D M. A program for annotating and predicting the effects of single nucleotide polymorphisms, SnpEff: SNPs in the genome ofstrain w1118; iso-2; iso-3. Fly, 2012, 6(2): 80-92.

[37] WEINER J, PARIDA S K, MAERTZDORF J, BLACK G F, REPSILBER D, TELAAR A, MOHNEY R P, ARNDT-SULLIVAN C, GANOZA C A, FAé K C, WALZL G, KAUFMANN S H E. Biomarkers of inflammation, immunosuppression and stress with active disease are revealed by metabolomic profiling of tuberculosis patients. PLoS ONE, 2012, 7(7): e40221.

[38] PRICE M N, DEHAL P S, ARKIN A P. FastTree 2: Approximately maximum-likelihood trees for large alignments. PLoS ONE, 2010, 5(3): e9490.

[39] HANSON A D, ROJE S. One-carbon metabolism in higher plants. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology, 2001, 52: 119-137.

[40] CHRISTENSEN K E, MACKENZIE R E. Mitochondrial one-carbon metabolism is adapted to the specific needs of yeast, plants and mammals. BioEssays: News and Reviews in Molecular, Cellular and Developmental Biology, 2006, 28(6): 595-605.

[41] YIN X R, XIE X L, XIA X J, YU J Q, FERGUSON I B, GIOVANNONI J J, CHEN K S. Involvement of an ethylene response factor in chlorophyll degradation during citrus fruit degreening. The Plant Journal: for Cell and Molecular Biology, 2016, 86(5): 403-412.

[42] LI S J, XIE X L, LIU S C, CHEN K S, YIN X R. Auto- and mutual-regulation between two CitERFs contribute to ethylene- induced citrus fruit degreening. Food Chemistry, 2019, 299: 125163.

[43] HAN Z Y, HU Y N, LV Y D, ROSE J K C, SUN Y Q, SHEN F, WANG Y, ZHANG X Z, XU X F, WU T, HAN Z H. Natural variation underlies differences in ETHYLENE RESPONSE FACTOR17 activity in fruit peel degreening. Plant Physiology, 2018, 176(3): 2292-2304.

[44] SHI Y, LIU X N, ZHAO S S, GUO Y. The PYR-PP2C-CKL2 module regulates ABA-mediated actin reorganization during stomatal closure. The New Phytologist, 2022, 233(5): 2168-2184.

[45] 曹柳青. 赤霉素對(duì)冬棗光合作用和內(nèi)源激素的影響[D]. 保定: 河北農(nóng)業(yè)大學(xué), 2006.

CAO L Q. Effects of gibberellin on photosynthesis and endogenous hormones of Dongzao jujube [D]. Baoding: Hebei Agricultural University, 2006. (in Chinese)

[46] AHAMMED G J, GAO C J, OGWENO J O, ZHOU Y H, XIA X J, MAO W H, SHI K, YU J Q. Brassinosteroids induce plant tolerance against phenanthrene by enhancing degradation and detoxification inL. Ecotoxicology and Environmental Safety, 2012, 80: 28-36.

[47] 王延玲. 新疆紅肉蘋(píng)果紅色發(fā)育機(jī)理的初步研究[D]. 泰安: 山東農(nóng)業(yè)大學(xué), 2011.

WANG Y L. Preliminary study on the red development mechanism of Xinjiang red meat apple [D]. Tai’an: Shandong Agricultural University, 2011. (in Chinese)

[48] CHAGNé D, CARLISLE C M, BLOND C, VOLZ R K, WHITWORTH C J, ORAGUZIE N C, CROWHURST R N, ALLAN A C, ESPLEY R V, HELLENS R P, GARDINER S E. Mapping a candidate gene () for red flesh and foliage colour in apple. BMC Genomics, 2007, 8: 212.

[49] ESPLEY R V, BRENDOLISE C, CHAGNE? D, KUTTY-AMMA S, GREEN S, VOLZ R, PUTTERILL J, SCHOUTEN H J, GARDINER S E, HELLENS R P, ALLAN A C. Multiple repeats of a promoter segment causes transcription factor autoregulation in red apples. The Plant Cell, 2009, 21(1): 168-183.

[50] UMEMURA H, OTAGAKI S, WADA M, KONDO S, MATSUMOTO S. Expression and functional analysis of a novelgene, MdMYB110a_JP, responsible for red flesh, not skin color in apple fruit. Planta, 2013, 238(1): 65-76.

[51] LAMBERT P, PASCAL T. Mapping Rm2 gene conferring resistance to the green peach aphid (Sulzer) in the peach cultivar ‘Rubira?’. Tree Genetics and Genomes, 2011, 7(5): 1057-1068.

[52] 周暉. 桃花青苷著色及原花青素合成的調(diào)控機(jī)制研究[D]. 武漢: 中國(guó)科學(xué)院研究生院(武漢植物園), 2015.

ZHOU H. Mechanisms underlying the regulation of anthocyanin coloration and proanthocyanidin synthesis in peach [D]. Wuhan: Wuhan Botanical Garden, Chinese Academy of Sciences, 2015. (in Chinese)

[53] GOULD K S, VOGELMANN T C, HAN T, CLEARWATER M J. Profiles of photosynthesis within red and green leaves of. Physiologia Plantarum, 2002, 116(1): 127-133.

[54] HATIER J H B, CLEARWATER M J, GOULD K S. The functional significance of black-pigmented leaves: Photosynthesis, photoprotection and productivity in‘Nigrescens’. PLoS ONE, 2013, 8(6): e67850.

[55] HUGHES N M, MORLEY C B, SMITH W K. Coordination of anthocyanin decline and photosynthetic maturation in juvenile leaves of three deciduous tree species. The New Phytologist, 2007, 175(4): 675-685.

[56] 周振翔, 李志康, 陳穎, 王志琴, 楊建昌, 顧駿飛. 葉綠素含量降低對(duì)水稻葉片光抑制與光合電子傳遞的影響. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué), 2016, 49(19): 3709-3720. doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2016.19.004

ZHOU Z X, LI Z K, CHEN Y, WANG Z Q, YANG J C, GU J F. Effects of reduced chlorophyll content on photoinhibition and photosynthetic electron transport in rice leaves. Scientia Agricultura Sinica, 2016, 49(19): 3709-3720. doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2016. 19.004. (in Chinese)

[57] 李衛(wèi)星, 楊舜博, 何智沖, 金飚. 植物葉色變化機(jī)制研究進(jìn)展. 園藝學(xué)報(bào), 2017, 44(9): 1811-1824.

LI W X, YANG S B, HE Z C, JIN B. Research advances in the regulatory mechanisms of leaf coloration. Acta Horticulturae Sinica, 2017, 44(9): 1811-1824. (in Chinese)

Development and Validation of KASP Markers Based on a Whole- Genome Resequencing Approach in a Hybrid Population of Luli × Red No. 1

ZHENG WenYan1, CHANG YuanSheng1, HE Ping1, HE XiaoWen1, WANG Sen1, GAO WenSheng2, LI LinGuang1, WANG HaiBo1

1Shandong Institute of Pomology, Tai’an 271000, Shandong;2Shandong Agricultural Technology Extension Center, Ji’nan 250100

【Objective】A series of kompetitive allele-specific PCR (KASP) markers for traits related to apple leaves were developed to provide a reference to effectively utilize light in apple breeding using a Luli ×Red No. 1 hybrid population as materials. 【Method】This study investigated the leaf trait phenotypic data (including leaf length, width, contents of chlorophyll and anthocyanin, photosynthetic rate and chlorophyll fluorescence parameters) of Luli, a type I red-fleshed apple, Red No. 1, and 134 hybrids. Whole-genome resequencing was conducted on an Illumina HiSeq 2500 platform. The clean sequencing reads were mapped to the apple reference genome using BWA software. GATK software was used to identify single nucleotide polymorphisms (SNPs). 【Result】A total of 164 776 660, 149 482 876, and 3 927 370 200 clean reads were obtained by whole-genome resequencing from Luli, Red No. 1 and 134 hybrid individuals, respectively. The data were aligned to the reference genome sequences with mapping rates of 98.77%, 98.89%, and 97.79%, respectively. A total of 6 445 766 SNPs were identified. The SNPs were then filtered, and 94 208 accurate and high-quality SNPs were selected for subsequent KASP primer design. Finally, 5 802 KASP markers were developed based on a high-throughput whole-genome resequencing approach. The average polymorphism information content (PIC) of these KASP markers was 0.31, and there were 30.13% PICs＞0.35. The Simpson genetic diversity index ranged from 0.01 to 0.67, with an average value of 0.53. The mean observed heterozygosity was 0.32. A Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes enrichment analysis of the genes for KASP marker revealed that “one carbon pool by folate” was the most significant pathway. An analysis of the phenotypic data of leaf-related traits in both the parents and individuals from the Luli ×Red No. 1 cross showed that there were significant differences in the phenotypic values of leaf net photosynthetic rate, stomatal conductance (Gs) and other traits between the parents Luli and Red No. 1. The F1 generation exhibited a wide phenotypic variation, and the most traits segregated extensively. Α detailed study of the phenotypic data of leaf traits of the hybrid population with the genotype and annotations of the KASP markers finally resulted in the development of 21 KASP markers, which was correlated with leaf-related traits, including chlorophyll content, Gs and leaf length and width.【Conclusion】Use of the whole-genome resequencing data of Luli, Red No. 1 and 134 hybrid individuals resulted in the development of 5 802 KASP. A total of 21 of these KASP markers significantly correlated with leaf traits, which provided a theoretical reference for the high utilization of light energy in apple breeding.

apple; whole-genome resequencing; leaf-related traits; KASP marker

10.3864/j.issn.0578-1752.2023.05.010

2022-04-26；

2022-07-14

山東省自然科學(xué)基金（ZR2021MC045）、山東省農(nóng)業(yè)良種工程項(xiàng)目（2021LZGC024）、國(guó)家自然科學(xué)基金（31901976）、泰山產(chǎn)業(yè)領(lǐng)軍人才工程項(xiàng)目（LJNY202026）、國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)資金（CARS-27）

鄭文燕，E-mail：1587493148@qq.com。通信作者王海波，E-mail：wanghaibo992@126.com。通信作者李林光，E-mail：llg6536@163.com

（責(zé)任編輯 趙伶俐）