基于智能項(xiàng)圈系統(tǒng)荷斯坦牛發(fā)情相關(guān)指標(biāo)的遺傳參數(shù)估計(jì)及全基因組關(guān)聯(lián)分析

楊明路，張海亮，羅漢鵬，黃錫霞，張翰林，章施施，王炎，劉林，郭剛，王雅春

基于智能項(xiàng)圈系統(tǒng)荷斯坦牛發(fā)情相關(guān)指標(biāo)的遺傳參數(shù)估計(jì)及全基因組關(guān)聯(lián)分析

1中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部動(dòng)物遺傳育種與繁殖（家畜）重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/畜禽育種國家工程實(shí)驗(yàn)室，北京 100193；2新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，烏魯木齊 830052；3北京奶牛中心，北京 100192；4北京首農(nóng)畜牧發(fā)展有限公司，北京 100029

【目的】探究基于奶牛智能項(xiàng)圈系統(tǒng)產(chǎn)生的發(fā)情指數(shù)和活動(dòng)峰值指標(biāo)的群體規(guī)律及其影響因素，對其進(jìn)行遺傳參數(shù)估計(jì)，并利用全基因組關(guān)聯(lián)分析（genome-wide association study, GWAS）挖掘與奶牛發(fā)情相關(guān)指標(biāo)的遺傳標(biāo)記，以期為從遺傳育種角度制定選育策略提高奶牛繁殖力提供有用信息。【方法】試驗(yàn)以北京市某規(guī)?；翀鼋】档拿谌槠诤伤固古檠芯繉ο?，收集了該牧場2017年7月至2020年5月2 074 頭泌乳牛的發(fā)情記錄，包括發(fā)情指數(shù)和活動(dòng)峰值，同時(shí)收集了試驗(yàn)牛的產(chǎn)犢記錄；采用 SAS 9.4中MIXED過程，分析了非遺傳因素對發(fā)情指數(shù)和活動(dòng)峰值的影響；基于DMU軟件DMUAI模塊，使用雙性狀動(dòng)物模型估計(jì)了發(fā)情指數(shù)與活動(dòng)峰值的遺傳力及遺傳相關(guān)，并計(jì)算了發(fā)情指數(shù)與常規(guī)繁殖性狀的近似遺傳相關(guān)；以逆回歸育種值為關(guān)聯(lián)分析的表型，利用FarmCPU軟件分別對發(fā)情指數(shù)和活動(dòng)峰值進(jìn)行了GWAS?！窘Y(jié)果】荷斯坦牛發(fā)情指數(shù)為（71.77±19.13）au，活動(dòng)峰值為（105.94±30.73）au/2h。發(fā)情指數(shù)遺傳力為0.04±0.01，活動(dòng)峰值遺傳力為0.19±0.04，均為低遺傳力性狀；發(fā)情指數(shù)與活動(dòng)峰值之間的遺傳相關(guān)為0.45±0.03；發(fā)情指數(shù)與經(jīng)產(chǎn)牛首末次配種間隔、首次產(chǎn)犢日齡和青年牛首末次配種間隔的近似遺傳相關(guān)分別為0.37、-0.41、-0.55。兩個(gè)性狀的GWAS共找到7個(gè)在全基因組水平上顯著的SNP位點(diǎn)，分別位于7條染色體上，顯著位點(diǎn)附近（300 kb內(nèi)）共發(fā)現(xiàn)基因31個(gè)?！窘Y(jié)論】通過項(xiàng)圈系統(tǒng)獲得的發(fā)情指數(shù)和活動(dòng)峰值是可遺傳的，兩者之間存在中等遺傳相關(guān)，活動(dòng)峰值為中低遺傳力，且能夠一定程度上反映奶牛的發(fā)情指數(shù)，活動(dòng)峰值和發(fā)情指數(shù)為研究奶牛的發(fā)情行為以及提高母牛的繁殖力提供了新的方向。GWAS鑒定到的候選基因（Prostaglandin-Endoperoxide Synthase1）和（Ubiquinone Oxidoreductase Subunit A8）的功能與供體胚胎總數(shù)有關(guān)，（Vascular Endothelial Growth Factor A）基因功能與奶牛繁殖有關(guān)，可作為奶牛發(fā)情相關(guān)指標(biāo)的候選基因進(jìn)行深入研究。

繁殖性狀；發(fā)情指數(shù)；活動(dòng)峰值；遺傳參數(shù)；全基因組關(guān)聯(lián)分析

0 引言

【研究意義】繁殖性狀是奶牛育種中重要的功能性狀[1]，奶牛的繁殖性能既與經(jīng)濟(jì)效益相關(guān)，也涉及動(dòng)物福利等問題[2]。奶牛養(yǎng)殖的經(jīng)濟(jì)效益很大程度上取決于牛群的繁殖效率，提高繁殖效率可以有效地減少授精次數(shù)、縮短產(chǎn)犢間隔、降低被動(dòng)淘汰率[3]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】大量研究發(fā)現(xiàn)，繁殖性狀為低遺傳力性狀，通常在0.01—0.10之間[4-5]，繁殖性狀與產(chǎn)奶性狀的拮抗關(guān)系使得繁殖性狀的選育困難更大[6]，繁殖性狀也會(huì)受到牧場環(huán)境和牧場管理的影響，如熱應(yīng)激和自愿等待期等[7-8]。此外，牧場常規(guī)記錄繁殖事件形成的繁殖性狀表型往往存在記錄不準(zhǔn)確、不完整的缺點(diǎn)，增加了繁殖性狀選育的難度；隨著智能化監(jiān)測傳感器的逐步使用，許多可用于選育繁殖性狀的新表型逐漸出現(xiàn)。有研究發(fā)現(xiàn)，基于傳感器測定活動(dòng)量產(chǎn)生的產(chǎn)犢至首次活動(dòng)峰值間隔和發(fā)情強(qiáng)度等性狀是可以遺傳的，發(fā)情強(qiáng)度與產(chǎn)犢至首次活動(dòng)峰值間隔呈負(fù)遺傳相關(guān)，選育產(chǎn)犢至第一次發(fā)情間隔有利于提高繁殖力[4]。有研究發(fā)現(xiàn)，隨著發(fā)情指數(shù)的提高，受胎率也隨之增高[9]。最新研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)情強(qiáng)度的提高可以改善胚胎移植受體母牛的受胎率[10]。【本研究切入點(diǎn)】研究奶牛的發(fā)情相關(guān)指標(biāo)可以了解奶牛的發(fā)情表現(xiàn)規(guī)律，可以為利用個(gè)體發(fā)情指數(shù)記錄更好地開展繁殖管理工作提供理論依據(jù)。目前，在我國荷斯坦牛群中，發(fā)情指數(shù)和活動(dòng)峰值與繁殖性狀的關(guān)系尚不明確，且尚無針對發(fā)情指數(shù)和活動(dòng)峰值進(jìn)行遺傳參數(shù)估計(jì)和候選基因挖掘的報(bào)道。此外，通過挖掘奶牛重要經(jīng)濟(jì)性狀的分子標(biāo)記和候選基因，可以深入理解復(fù)雜性狀的遺傳基礎(chǔ)和提高基因組選擇的準(zhǔn)確性。目前，針對我國奶牛產(chǎn)奶和乳房健康等性狀，已有較多研究開展了分子標(biāo)記挖掘和候選基因鑒定，而針對繁殖性狀開展的研究較少[11-14]?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究基于北京地區(qū)某規(guī)模化牧場泌乳荷斯坦牛的發(fā)情指數(shù)相關(guān)數(shù)據(jù)，深入分析奶牛發(fā)情指數(shù)和活動(dòng)峰值的變化規(guī)律和影響因素，估計(jì)這些指標(biāo)的遺傳參數(shù)。以發(fā)情指數(shù)和活動(dòng)峰值的逆回歸育種值（de-regressed proof，DRP）為表型值[15]，結(jié)合該奶牛個(gè)體的SNP芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行了全基因組關(guān)聯(lián)分析（genome-wide association study, GWAS），以期篩選到與奶牛發(fā)情指數(shù)和活動(dòng)峰值顯著關(guān)聯(lián)的SNP，挖掘影響奶牛發(fā)情指數(shù)和活動(dòng)峰值的關(guān)鍵基因，為牧場利用發(fā)情指數(shù)和活動(dòng)峰值管理牛群提供理論依據(jù)，同時(shí)也可為揭示奶牛發(fā)情指數(shù)和活動(dòng)峰值的遺傳機(jī)制和利用分子遺傳標(biāo)記輔助選擇改善奶牛的發(fā)情水平奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)群體

研究于2017年7月至2020年5月收集北京地區(qū)某規(guī)模化牧場2 074頭泌乳期荷斯坦牛的發(fā)情指數(shù)和活動(dòng)峰值。試驗(yàn)?zāi)翀霾捎蒙谑斤曫B(yǎng)，舍外設(shè)運(yùn)動(dòng)場，自由飲水，全天全混合日糧（total mixed ration, TMR）自由采食，整個(gè)試驗(yàn)期間日糧營養(yǎng)成分保持一致，其營養(yǎng)水平符合奶牛飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)（NY/T 34-2004）。飼料主要營養(yǎng)成分如下：干物質(zhì) 23 kg，粗料比例 40%，粗蛋白 16%—17%。夏季時(shí)采食道與待擠區(qū)使用噴淋和風(fēng)扇進(jìn)行降溫。試驗(yàn)牛群每日使用利拉伐并列式擠奶設(shè)備擠奶3次，分別于07：00—10：00、14：00—17：00和21：00—24：00之間完成。不同泌乳牛舍的飼養(yǎng)管理方式基本相同，均為擠奶前30 min投料，自由采食和飲水。

1.2 數(shù)據(jù)收集與測定

1.2.1 表型數(shù)據(jù) 本試驗(yàn)利用HR-LD（利用加速計(jì)識(shí)別）和HR-LDn（利用三軸MEMS（微機(jī)電系技術(shù)）加速度計(jì)識(shí)別）2種類型的項(xiàng)圈（SCR，以色列）對2 074頭進(jìn)行連續(xù)監(jiān)測[16]，通過DataFlow? II系統(tǒng)（https://www.allflex.global/cn/）獲得試驗(yàn)牛在發(fā)情時(shí)的發(fā)情指數(shù)和活動(dòng)峰值。每頭試驗(yàn)牛在產(chǎn)犢后開始佩戴項(xiàng)圈，在每個(gè)泌乳期內(nèi)僅使用1種項(xiàng)圈進(jìn)行監(jiān)測。試驗(yàn)期間定期對試驗(yàn)牛的發(fā)情指數(shù)記錄進(jìn)行備份和收集。

發(fā)情指數(shù)是根據(jù)DataFlow? II系統(tǒng)通過試驗(yàn)牛的活動(dòng)量、反芻時(shí)間、繁育事件和乏情記錄計(jì)算獲得（0—100 au），活動(dòng)峰值是指試驗(yàn)牛一個(gè)發(fā)情周期內(nèi)，原始活動(dòng)量的最高值（記錄頻率為2 h一次）。

1.2.2 系譜數(shù)據(jù) 本研究所使用的原始系譜來自于北京奶牛中心，基于原始系譜，對有表型記錄的個(gè)體進(jìn)行追溯，直到不再增加相關(guān)個(gè)體而獲得用于本研究分析的系譜，包括1 057頭公牛和4 115頭母牛，這些個(gè)體出生于1939—2018年。此外，本研究收集了同一牛群常規(guī)繁殖性狀的估計(jì)育種值（estimated breeding value, EBV）。根據(jù)數(shù)據(jù)資料情況并綜合文獻(xiàn)[6,17-18]，本研究主要計(jì)算了5個(gè)繁殖性狀與發(fā)情相關(guān)指標(biāo)之間的近似遺傳相關(guān)，包括首次產(chǎn)犢日齡（首次產(chǎn)犢日期與其出生日期的間隔天數(shù)）、首次配種日齡（首次配種日期與其出生日期之間的間隔天數(shù)）、產(chǎn)犢至首次配種間隔（產(chǎn)犢日期與其本泌乳期首次配種日期的間隔天數(shù)）、經(jīng)產(chǎn)牛首末次配種間隔（經(jīng)產(chǎn)牛同泌乳期首次配種日期與末次配種日期的間隔天數(shù)）、青年牛首末次配種間隔（青年牛首次配種日期與末次配種日期的間隔天數(shù)）。

1.2.3 基因型數(shù)據(jù) 本研究中，使用Illumina公司的牛150 K 芯片對2 626頭荷斯坦牛進(jìn)行基因組測定，每頭牛獲得了121 188個(gè)SNP位點(diǎn)用于關(guān)聯(lián)分析。

1.3 數(shù)據(jù)整理與質(zhì)控

1.3.1 表型數(shù)據(jù) 由于3胎以上的試驗(yàn)牛較少，本研究將胎次劃分為3個(gè)水平，分別為1胎、2胎、3胎及以上；將泌乳階段劃分為4個(gè)水平，圍產(chǎn)后期（0—21 d）、泌乳前期（22—100 d）、泌乳中期（101— 200 d）和泌乳后期（201—305 d）；由于發(fā)情4次以上的牛只數(shù)較少，將測定發(fā)情周期劃分為4個(gè)水平，分別為第1次、第2次、第3次、第4次及以上；將測定季節(jié)劃分為4個(gè)水平，分別為春季（3—5月）、夏季（6—8月）、秋季（9—11月）和冬季（12月至次年2月）[19]；根據(jù)一日內(nèi)發(fā)情開始時(shí)間劃分晝夜效應(yīng)，“白天”為8：00—20：00，“夜間”為20：00至次日08：00。

1.3.2 基因型數(shù)據(jù) 使用Beagle 5.1[20]進(jìn)行填充，對填充后的芯片進(jìn)行質(zhì)控，剔除不符合條件的SNP。剔除條件包括（1）嚴(yán)重偏離（＜10E-6）哈代-溫伯格平衡；（2）最小等位基因頻率小于0.05[21]。質(zhì)控后，發(fā)情指數(shù)和活動(dòng)峰值各有1 174頭和2 488頭牛用于GWAS，兩個(gè)性狀每頭牛分別保留了114 566個(gè)和114 770個(gè)SNP用于關(guān)聯(lián)分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

1.4.1 影響因素分析 使用SAS 9.4軟件Mixed過程分析泌乳階段、胎次、測定年份、測定季節(jié)、項(xiàng)圈類型、情期數(shù)、晝夜效應(yīng)和個(gè)體隨機(jī)效應(yīng)對發(fā)情指數(shù)和發(fā)情峰值的影響，采用Bonferroni檢驗(yàn)進(jìn)行多重比較，以＜0.01為差異極顯著，模型如下：

ijklmnopqijklmnoijklmnopijklmnopq

式中，ijklmnopq為發(fā)情指數(shù)和發(fā)情峰值，為總體均值，i為泌乳階段，j為胎次，k為測定年份，l為測定季節(jié)，m為情期數(shù)，n為項(xiàng)圈類型，o為晝夜效應(yīng)，ijklmnop為個(gè)體隨機(jī)效應(yīng)，ijklmnopq為隨機(jī)殘差。

1.4.2 遺傳參數(shù)估計(jì) 采用雙性狀動(dòng)物模型，利用平均信息約束估計(jì)最大似然法求解混合線性方程組，獲得各性狀的方差組分和協(xié)方差組分的估計(jì)值，使用的分析軟件為DMU[22]。發(fā)情指數(shù)和活動(dòng)峰值的混合線性方程組矩陣形式如下：

式中，y為發(fā)情指數(shù)和活動(dòng)峰值的觀察值矩陣；b為第i個(gè)母牛發(fā)情指數(shù)和活動(dòng)峰值的固定效應(yīng)矩陣（包括總體均值、測定年、測定季節(jié)、胎次、泌乳階段、情期數(shù)、項(xiàng)圈類型和晝夜效應(yīng)）；a為第i個(gè)母牛的個(gè)體加性隨機(jī)效應(yīng)矩陣；e為第i個(gè)母牛的隨機(jī)殘差矩陣；X、Z為對應(yīng)的關(guān)系矩陣。

遺傳力與遺傳相關(guān)及其標(biāo)準(zhǔn)誤依據(jù)泰勒（Taylor）展開式進(jìn)行計(jì)算[23]。

1.4.3 近似遺傳相關(guān) 基于Calo等提出的計(jì)算方法[24]，計(jì)算發(fā)情指數(shù)、活動(dòng)峰值與繁殖性狀之間的近似遺傳相關(guān)，包括首次產(chǎn)犢日齡、首次配種日齡、產(chǎn)犢至首次配種間隔、經(jīng)產(chǎn)牛首末次配種間隔、青年牛首末次配種間隔，根據(jù)兩個(gè)性狀的可靠性大于0.22的個(gè)體的EBV計(jì)算近似遺傳相關(guān)性，公式如下：

近似遺傳相關(guān)系數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)誤計(jì)算公式如下：

1.4.4 全基因組關(guān)聯(lián)分析 通過發(fā)情指數(shù)和活動(dòng)峰值EBV及其可靠性計(jì)算發(fā)情指數(shù)和活動(dòng)峰值的逆回歸育種值（de-regressed proof，DRP），作為關(guān)聯(lián)分析的偽表型[15]。結(jié)合SNP芯片數(shù)據(jù)，利用FarmCPU軟件進(jìn)行GWAS[26]，本研究使用Bonferroni檢驗(yàn)進(jìn)行多重檢驗(yàn)校正，顯著性閾值定義為0.05/N，其中N為SNP的數(shù)量。利用R（3.5.1）語言（https://www.r- project.org/）繪制Q-Q plot圖，即SNP與分析性狀間的卡方統(tǒng)計(jì)量檢驗(yàn)，以判斷試驗(yàn)群體是否存在群體分層現(xiàn)象[27]。

2 結(jié)果

2.1 性狀的描述統(tǒng)計(jì)

荷斯坦牛發(fā)情指數(shù)和活動(dòng)峰值發(fā)情相關(guān)性狀的描述性統(tǒng)計(jì)結(jié)果如表1所示，試驗(yàn)牛群發(fā)情指數(shù)均值為71.77 au，活動(dòng)峰值均值為105.94 au/2h，兩個(gè)指標(biāo)的變異系數(shù)相近。

表1 中國荷斯坦牛發(fā)情相關(guān)性狀描述性統(tǒng)計(jì)

2.2 各因素對發(fā)情指數(shù)的影響

利用線性混合模型分析各因素對奶牛發(fā)情指數(shù)和活動(dòng)峰值的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，胎次、測定季節(jié)、泌乳階段、情期數(shù)、晝夜、測定年份和項(xiàng)圈類型對發(fā)情指數(shù)和活動(dòng)峰值均有顯著影響（＜0.05）。各因素不同水平的最小二乘均值如表2所示。

由表2可知，不同胎次的奶牛間，2胎奶牛發(fā)情指數(shù)最高，1胎最低，二者相差1.26 au。不同泌乳階段間，奶牛在泌乳初期發(fā)情指數(shù)最高，在圍產(chǎn)后期最低，兩者相差7.02 au。不同情期間，奶牛在第4個(gè)及以上情期的發(fā)情指數(shù)最高，在第一個(gè)情期最低，二者相差2.34 au；在不同季節(jié)之間，奶牛在冬季時(shí)發(fā)情指數(shù)最高，在夏季時(shí)最低，二者相差8.01 au。白天開始發(fā)情的奶牛，其發(fā)情指數(shù)低于夜間開始發(fā)情牛的發(fā)情指數(shù)，兩者相差2.8 au。不同項(xiàng)圈類型之間，HR-LD項(xiàng)圈和HR-LDn項(xiàng)圈所監(jiān)測的奶牛發(fā)情指數(shù)相差5.01 au。

不同胎次的奶牛之間，1胎奶牛的活動(dòng)峰值最高，3胎最低，二者相差3.59 au/2h。不同泌乳階段之間，奶牛在泌乳早期活動(dòng)峰值最高，在泌乳后期最低，兩者相差8.30 au/2h。不同情期數(shù)之間，奶牛在第2次及以上活動(dòng)峰值最高，第3次最低，二者相差3.50 au/2h；在各季節(jié)中，奶牛在冬季時(shí)活動(dòng)峰值最高，在夏季時(shí)最低，二者相差10.38 au/2h。在白天開始發(fā)情的奶牛，其活動(dòng)峰值極顯著（＜0.01）低于夜間開始發(fā)情的牛，兩者相差5.28 au/2h。不同項(xiàng)圈類型之間，HR-LD項(xiàng)圈和HR-LDn項(xiàng)圈所監(jiān)測的奶牛活動(dòng)峰值相差17.76 au/2h。

2.3 遺傳參數(shù)

本研究基于雙性狀動(dòng)物模型對發(fā)情指數(shù)和活動(dòng)峰值進(jìn)行了遺傳分析，其方差組分和遺傳參數(shù)如表3所示。發(fā)情指數(shù)的遺傳力為0.04±0.01，屬于低遺傳力性狀；活動(dòng)峰值遺傳力為0.19，標(biāo)準(zhǔn)誤為 0.04，屬于中低遺傳力。發(fā)情指數(shù)與活動(dòng)峰值之間的遺傳相關(guān)為0.45±0.03，為中等遺傳相關(guān)，活動(dòng)峰值越高的牛發(fā)情指數(shù)越高。

表2 各因素對中國荷斯坦牛發(fā)情指數(shù)和活動(dòng)峰值的影響

同一因子同列數(shù)據(jù)標(biāo)不同字母表示差異顯著（＜0.05），標(biāo)相同字母表示差異不顯著（＞0.05）

Different letters under the same factor within the same column mean significant difference (＜0.05), and the same letter means no significant difference (＞0.05)

表3 中國荷斯坦牛發(fā)情指數(shù)與活動(dòng)峰值的遺傳參數(shù)

2.4 發(fā)情指數(shù)相關(guān)指標(biāo)近似遺傳相關(guān)

發(fā)情指數(shù)與各繁殖性狀之間的近似遺傳相關(guān)見表4。發(fā)情指數(shù)與首次配種日齡、產(chǎn)犢至首次配種間隔、經(jīng)產(chǎn)牛首末次配種間隔之間的近似遺傳相關(guān)均為正相關(guān)，與首次產(chǎn)犢日齡和青年牛首末次配種間隔均為負(fù)相關(guān)。經(jīng)產(chǎn)牛首末次配種間隔與發(fā)情指數(shù)近似遺傳相關(guān)為0.37，首次產(chǎn)犢日齡與發(fā)情指數(shù)近似遺傳相關(guān)為-0.41，青年牛首末次配種間隔與發(fā)情指數(shù)近似遺傳相關(guān)為-0.55。

2.5 全基因組關(guān)聯(lián)分析

2.5.1 群體分層檢驗(yàn) 對試驗(yàn)群體進(jìn)行群體分層檢驗(yàn)，結(jié)果如圖1所示。從圖中可以看出，兩個(gè)性狀的關(guān)聯(lián)分析結(jié)果可靠，本研究有效地抑制了試驗(yàn)群體的遺傳背景差異。

表4 中國荷斯坦牛發(fā)情指數(shù)與繁殖相關(guān)性狀近似遺傳相關(guān)

圖1 發(fā)情指數(shù)（左）和活動(dòng)峰值（右）全基因組關(guān)聯(lián)分析Q-Q plot圖

2.5.2 全基因組關(guān)聯(lián)分析結(jié)果 經(jīng)過對發(fā)情指數(shù)和活動(dòng)峰值進(jìn)行GWAS，分別得到了全基因組水平顯著的SNP位點(diǎn)，兩個(gè)性狀的曼哈頓圖如圖2所示。發(fā)情指數(shù)的GWAS共鑒定到4個(gè)全基因組水平顯著的SNP，活動(dòng)峰值共獲得3個(gè)全基因組水平顯著的SNP。

本研究共獲得7個(gè)全基因組水平顯著的SNP，這些顯著SNP的最小等位基因頻率處于0.12—0.43，具有良好的多態(tài)性，查找顯著SNP上下游300 kb范圍內(nèi)的基因，有6個(gè)SNP周圍找到了31個(gè)候選基因，顯著SNP及候選基因信息如表5所示。

30號(hào)染色體為性染色體Chromosome 30 is sex chromosome

表5 中國荷斯坦牛發(fā)情指數(shù)和活動(dòng)峰值全基因組關(guān)聯(lián)分析顯著SNP和相關(guān)基因

3 討論

3.1 發(fā)情指數(shù)相關(guān)數(shù)據(jù)概況

本研究中，北京地區(qū)荷斯坦牛泌乳母牛的發(fā)情指數(shù)為71.77 au。Macmillan等[9]在荷斯坦牛中發(fā)現(xiàn)，奶牛的發(fā)情指數(shù)為79.2 au，高于本研究的結(jié)果（相差7.43 au），這可能是不同研究中胎次、群體規(guī)模和牛群飼養(yǎng)管理的不同造成。例如，本研究監(jiān)測了各胎次奶牛，試驗(yàn)牛群每天飼喂和擠奶3次；而在Macmillan等[9]的研究中，僅監(jiān)測了初產(chǎn)牛，每天只飼喂一次。在荷斯坦牛群體中，346頭測定母牛的1 163次發(fā)情指數(shù)平均為72.8 au，與本試驗(yàn)結(jié)果相近[28]。

3.2 各因素對泌乳母牛發(fā)情相關(guān)指標(biāo)的影響

本研究中，胎次對奶牛發(fā)情指數(shù)有顯著影響，這與Madureira和L?vendahl等[28-29]的研究結(jié)果相似。不同胎次之間，1胎最低，2胎最高，這與L?vendahl等[29]在荷斯坦牛、娟姍牛和丹麥紅牛中發(fā)現(xiàn)的趨勢相同，該研究發(fā)現(xiàn)1胎牛發(fā)情強(qiáng)度最低（1.058±0.015），2胎最高（1.096±0.015），3胎中等（1.080±0.019）。1胎母牛具有最低的發(fā)情指數(shù)，這可能與其產(chǎn)后的恢復(fù)、體成熟和抗應(yīng)激能力有關(guān)。在各泌乳階段，泌乳初期發(fā)情指數(shù)最低；有研究表明，奶牛的發(fā)情指數(shù)受泌乳階段影響較大。當(dāng)泌乳天數(shù)在45 d以內(nèi)時(shí)，發(fā)情指數(shù)最低為67.9 au，在泌乳天數(shù)處于45 — 120 d時(shí)發(fā)情指數(shù)最高為71.6 au[28]，這與本研究結(jié)果相似。據(jù)報(bào)道北京地區(qū)的季節(jié)變化對奶牛的發(fā)情有明顯影響，夏季奶牛發(fā)情率最低（38.57%）且低于其他季節(jié)[30]。本研究中，季節(jié)極顯著影響母牛的發(fā)情指數(shù)，夏季發(fā)情指數(shù)最低，這可能與夏季奶牛遭受熱應(yīng)激，體內(nèi)皮質(zhì)類固醇激素分泌增多，使體內(nèi)LH分泌下降，當(dāng)優(yōu)勢卵泡處于低LH水平時(shí)分泌雌激素減少，從而發(fā)情強(qiáng)度降低[31]。研究表明，50%以上的母牛在傍晚或夜間發(fā)情[32]；本研究中，夜間發(fā)情母牛只占52.82%，日間發(fā)情母牛占47.18%，夜間發(fā)情母牛的發(fā)情指數(shù)極顯著高于日間發(fā)情指數(shù)。綜上，奶牛的發(fā)情指數(shù)對包括胎次和泌乳階段等在內(nèi)的生理因素表現(xiàn)敏感。

本研究中，活動(dòng)峰值隨胎次增加而減少，這與胡仁超等[33]的研究結(jié)果相似。奶牛在泌乳前期的日活動(dòng)量最高，隨著泌乳天數(shù)的延長，活動(dòng)量逐漸減少[28]；本研究中，奶牛在泌乳前期的活動(dòng)峰值較泌乳后期高出8.5 au/2h，與上述研究基本一致。這可能與奶牛雌二醇水平有關(guān)，隨泌乳天數(shù)的增加發(fā)情強(qiáng)度在不斷降低[28]。本研究發(fā)現(xiàn)測定季節(jié)對活動(dòng)峰值有顯著影響，夏季活動(dòng)峰值最低，這與潘予琮等[34]的研究結(jié)果相似。奶牛在日間的活動(dòng)量平均高出夜間20%以上[35-36]，奶牛在夜間的活動(dòng)量相對較低[37]，本研究群體中日間活動(dòng)峰值顯著高于夜間活動(dòng)峰值?？傮w上，活動(dòng)峰值與活動(dòng)量變化規(guī)律基本一致，受牧場生產(chǎn)管理活動(dòng)的影響，奶牛在白天的活動(dòng)峰值高于夜間，在夜間的活動(dòng)峰值更能反映奶牛自身生理狀態(tài)的變化。

3.3 發(fā)情相關(guān)指標(biāo)的遺傳參數(shù)

作為牧場中廣泛應(yīng)用的智能傳感器產(chǎn)生的新型繁殖表型，發(fā)情指數(shù)和活動(dòng)峰值可以反映母牛的發(fā)情表現(xiàn)，而進(jìn)一步反映奶牛的繁殖性能。本研究中，發(fā)情指數(shù)的遺傳力估計(jì)值為0.037±0.013，為低遺傳力性狀。國外研究中，發(fā)情指數(shù)用于描述母牛的發(fā)情強(qiáng)度，Ismael等[4,38]的研究中發(fā)情強(qiáng)度遺傳力估計(jì)值在0.02—0.08之間，本研究結(jié)果處于上述研究報(bào)道的范圍之內(nèi)。發(fā)情指數(shù)的遺傳力估計(jì)值為0.04±0.01，屬于低遺傳力性狀?；顒?dòng)峰值與發(fā)情指數(shù)為中等遺傳相關(guān)，能夠反映牛只的發(fā)情特征及繁殖性能，具有遺傳選育的潛力。

本研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)情指數(shù)與首次產(chǎn)犢日齡和青年牛首末次配種間隔成負(fù)遺傳相關(guān)，分別為-0.41和-0.55；有研究指出，具有較高發(fā)情表現(xiàn)的牛只，其授精次數(shù)較少，首末次輸精間隔較短，從產(chǎn)犢到最后授精的時(shí)間間隔也較短（遺傳相關(guān)系數(shù)分別為-0.14、-0.27和-0.38）[4]，這與本研究結(jié)果一致。發(fā)情指數(shù)與首次配種日齡和產(chǎn)犢至首次配種間隔為正相關(guān)，且與發(fā)情指數(shù)的遺傳相關(guān)較低，這一結(jié)果表明發(fā)情指數(shù)并不會(huì)影響首次配種日齡和產(chǎn)犢至首次配種間隔。

3.4 發(fā)情相關(guān)指標(biāo)的全基因組關(guān)聯(lián)分析

本研究共鑒定了4個(gè)與奶牛發(fā)情指數(shù)顯著相關(guān)的SNP，及3個(gè)與奶牛活動(dòng)峰值顯著相關(guān)SNP。在發(fā)情指數(shù)鑒定的19個(gè)潛在候選基因中，有研究發(fā)現(xiàn)（Prostaglandin-Endoperoxide Synthase1）（Mitochondrial Ribosome Recycling Factor）、（RNA Binding Motif Protein 18）（LIM Homeobox 6）（MORN Repeat Containing 5）和（Ubiquinone Oxidoreductase Subunit A8）與加拿大荷斯坦牛群中供體母牛胚胎總數(shù)性狀有關(guān)（來自加拿大奶業(yè)網(wǎng)，https://www.cdn.ca/），（Member RAS Oncogene Family）、（DENN Domain Containing 4A）和（Solute Carrier Family 24 Member 1）與肉牛背膘厚度有關(guān)[39]。其中，和認(rèn)為是與供體產(chǎn)生胚胎數(shù)相關(guān)的潛在候選基因[40]。有研究發(fā)現(xiàn)，編碼的蛋白能將花生四烯酸轉(zhuǎn)化為PGH2，PGH2是PGE2和PGF2α的前體物質(zhì)[41]。本研究發(fā)現(xiàn)和與發(fā)情水平有關(guān)，可能是由于調(diào)控前列腺素從而間接影響發(fā)情水平的表現(xiàn)，NDUFA8蛋白是NADH脫氫酶的一個(gè)亞基[42]，NADH調(diào)節(jié)能量代謝[43]，并與卵母細(xì)胞發(fā)育有關(guān)[44]，卵母細(xì)胞發(fā)育可能間接影響發(fā)情水平的表現(xiàn)。

在活動(dòng)高峰鑒定的12個(gè)潛在候選基因中，有研究發(fā)現(xiàn)（Heat Shock Protein 90 Alpha Family Class B Member 1）與奶牛熱應(yīng)激相關(guān)[45]，與奶牛十二指腸營養(yǎng)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白有關(guān)[46]，（Vascular Endothelial Growth Factor A）與牛卵泡發(fā)育和黃體形成有關(guān)[47]。本研究發(fā)現(xiàn)，與荷斯坦牛發(fā)情峰值有關(guān)，通過促進(jìn)毛細(xì)血管的增殖和形成來促進(jìn)牛優(yōu)勢卵泡生長，毛細(xì)血管對生長中的卵泡輸送氧氣、營養(yǎng)物質(zhì)、類固醇前體和生長因子至關(guān)重要[47]。卵泡血管化的增加與表達(dá)的增加相關(guān)，從而影響活動(dòng)高峰的表達(dá)。

4 結(jié)論

北京地區(qū)荷斯坦牛的發(fā)情指數(shù)為（71.77±19.13）au，活動(dòng)峰值為（105.94±30.73）au/2h；發(fā)情指數(shù)（0.04）和活動(dòng)峰值（0.19）為中低遺傳力性狀，發(fā)情指數(shù)與活動(dòng)峰值之間存在中等遺傳相關(guān)（0.45）；活動(dòng)峰值能夠一定程度反映奶牛發(fā)情指數(shù)，發(fā)情指數(shù)與青年牛首末次配種間隔和首次產(chǎn)犢日齡存在較高的近似遺傳相關(guān)。通過對發(fā)情相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)了影響中國荷斯坦牛發(fā)情指數(shù)和活動(dòng)峰值的重要候選基因；其中，和與供體產(chǎn)生的胚胎數(shù)量相關(guān)，與牛卵泡發(fā)育和黃體形成有關(guān)。本研究為揭示奶牛繁殖性狀的分子遺傳基礎(chǔ)積累了素材，為利用傳感器智能測定的新型表型研究和選育奶牛繁殖性能提供了參考。

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Estimation of Genetic Parameters and Genome-Wide Association Study of Heat Indicators in Holstein Cattle Based on Collar-Mounted Device

1College of Animal Science and Technology, China Agricultural University/Key Laboratory of Animal Genetics/Breeding and Reproduction of Ministry of Agriculture and Rural Affairs/National Engineering Laboratory for Animal Breeding, Beijing 100193;2College of Animal Science, Xinjiang Agricultural University, Urumqi 830052;3Beijing Dairy Center, Beijing 100192;4Beijing Sunlon Livestock Development Co., Ltd, Beijing 100029

【Objective】The study was to explore population characteristics and influencing factors of heat index and activity peak based on cattle collar data and system and to estimate its genetic parameters, and to identify the genetic markers related to the estrus indicators of cow, the genetic analysis and GWAS were performed for heat index and activity peak, so as to provide useful information for improving dairy cow fertility by formulating breeding strategies from the perspective of genetic breeding.【Method】The heat index and activity peak recordsof 2 074 milking cows from a large-scale dairy farm in Beijing area were collected from July 2017 to May 2020. The MIXED model in SAS 9.4 was used to analyze the impacts of various factors on heat index and activity peak in Holstein cattle, and the DMUAI module of DMU software was used to estimate the heritability and genetic correlations of heat index and activity peak. The GWAS for heat index and activity peak was performed based on De-regressed Proof (DRP) using FarmCPU software. 【Result】In Chinese Holstein cattle, the average heat index was (71.77±19.13) au, and the activity peak was (105.94±30.73) au/2 h. The heritability of heat index and activity peak was 0.04±0.01 and 0.19±0.04, respectively. The genetic correlation between heat index and activity peak was 0.45±0.03. The approximate heat index between the age at first calving in heifer, interval from first to last insemination, and interval from first to last insemination was 0.37, -0.41, and -0.55, respectively. The GWAS for heat index and activity peak identified seven significant single nucleotide polymorphism loci (SNP) at the genome level, and 31 genes nearby the significant SNP (within 300 kb) were found. 【Conclusion】The heat index and activity peak obtained by collar system were heritable, and there was a moderate genetic correlation between them. The activity peak was of low heritability and could reflect the heat index of cows to some extent. The activity peak and heat index provided a new direction for studying and breeding the estrus behavior of cows and improving the fecundity of cows. The function of(Prostaglandin-Endoperoxide Synthase1) and(Ubiquinone Oxidoreductase Subunit A8)genes identified by GWAS was related to the total number of donor embryos, and the function of(Vascular Endothelial Growth Factor A) gene was related to the reproduction of cows.

female fertility; heat index; activity peak; genetic parameter; genome-wide association study

10.3864/j.issn.0578-1752.2023.05.014

2021-10-08；

2022-12-28

國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（CARS-36）、長江學(xué)者和創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)發(fā)展計(jì)劃（IRT_15R62）、北京三元種業(yè)科技股份有限公司自立科研課題（SYZYZ20190005）

楊明路，E-mail：2510660222@qq.com。通信作者郭剛，E-mail：guogang2180@126.com。通信作者王雅春，E-mail：wangyachun@cau.edu.cn

（責(zé)任編輯 林鑒非）