基于NF-κB 信號(hào)通路探討參麥注射液聯(lián)合大黃治療尿毒癥心肌病的研究

段學(xué)峰，蔣鉆紅，秦利強(qiáng)，徐光標(biāo)，崔可

1.浙江省臺(tái)州醫(yī)院腎內(nèi)科，浙江臨海 317000；2.浙江省臺(tái)州醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，浙江臨海 317000

據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國(guó)每天新增約13 萬例尿毒癥患者[1]。尿毒癥心肌病是導(dǎo)致心血管疾病并發(fā)癥死亡的最主要原因[2]。迄今為止，尿毒癥引起心肌損害的發(fā)病機(jī)制尚未明確。在眾多尿毒癥毒素中，腸源性毒素對(duì)尿毒癥患者心血管系統(tǒng)的危害逐漸被研究者證實(shí)并重視，其中硫酸對(duì)甲酚和硫酸吲哚酚作為腸源性尿毒癥毒素的代表引起廣泛關(guān)注[3-4]。研究顯示，硫酸對(duì)甲酚和硫酸吲哚酚在尿毒癥患者體內(nèi)蓄積不僅會(huì)加速腎臟纖維化，還可使內(nèi)皮細(xì)胞活性氧增多，激活絲裂原激活蛋白激酶/核因子кB（nuclear factorкB，NF-кB）通路，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)進(jìn)而損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞，并通過多種機(jī)制對(duì)患者的心血管系統(tǒng)造成損傷[5-6]。因此，基于NF-кB 通路研究尿毒癥心肌細(xì)胞的保護(hù)機(jī)制，可作為尿毒癥心肌病治療的突破點(diǎn)。本研究基于NF-кB 信號(hào)通路探討益氣降濁法治療尿毒癥心肌病的機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選用溫州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供的健康成年SPF 大鼠72 只，體質(zhì)量（250±20）g，雌雄各半。本研究經(jīng)浙江省臺(tái)州醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)討論審議通過（倫理審批號(hào)：TZY-2022042）。

1.2 主要試劑

NF-кB p65 抗體購自美國(guó)Santacruz 公司，腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）試劑盒購自美國(guó)Sigma 公司。

1.3 藥物

參麥注射液（批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字Z33020020，生產(chǎn)單位：正大青春寶藥業(yè)有限公司，規(guī)格：每支裝20ml），生大黃煎液：生大黃100g 配制成100ml 煎液。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組

SPF 大鼠72 只，雌雄各半，隨機(jī)分成6 組，即正常組、假手術(shù)組、模型組、益氣組、降濁組和益氣降濁組，每組12 只。

1.5 動(dòng)物模型制備及分組

大鼠在手術(shù)前禁水8h、禁食12h。10%水合氯醛腹腔麻醉，取俯臥位并固定。消毒、備皮，在脊柱旁0.5cm 與右肋下1cm 交接位置做一切口，暴露右腎，結(jié)扎右腎門腎蒂，切除右腎，之后右腎稱重。手術(shù)7d 后，按前述手術(shù)方式暴露左側(cè)腎臟，分離左腎周圍脂肪囊切除腎包膜，分別于腎臟上端和下端楔形切除1/3 左腎組織，重量為右腎重量的2/3。手術(shù)切口使用海綿明膠按壓止血后縫合，送回單獨(dú)飼養(yǎng)。假手術(shù)組只需完成雙側(cè)腎臟周圍脂肪囊分離及切除雙腎包膜。所有大鼠在手術(shù)后連續(xù)注射青霉素3d。術(shù)后禁食24h，不禁水。使用無創(chuàng)尾動(dòng)脈血壓測(cè)量?jī)x測(cè)量大鼠尾動(dòng)脈收縮壓。每天均于9:00-16:30測(cè)量，共計(jì)測(cè)量5 次，最后取平均值。

隨機(jī)選擇兩組大鼠，分別于手術(shù)后2、8、16、24、30、36 周時(shí)，收集其24h 尿液。之后使用乙醚麻醉，采集其眼眶血檢測(cè)血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）和血肌酐（serum creatinine，Scr），確定大鼠尿毒癥模型是否創(chuàng)建成功。造模成功后，降濁組大鼠給予生大黃煎液1ml/100g 灌胃，每天1次，持續(xù)1 周；益氣降濁組大鼠給予生大黃煎液1ml/100g 灌胃，每天1 次，皮下注射參麥注射液1ml/200g，每天1 次，持續(xù)1 周；益氣組大鼠皮下注射參麥注射液1ml/200g，每天1 次，持續(xù)1 周；模型組大鼠和假手術(shù)組大鼠給予1ml/100g 生理鹽水灌胃，每天1 次，持續(xù)1 周。正常組大鼠不作任何處理。

1.6 標(biāo)本采集與檢測(cè)

1.6.1 大鼠心臟重量指數(shù) 完成最后一次治療后，禁食，不禁水，處死大鼠，稱取大鼠心臟重量和左心室重量，計(jì)算左心室重量指數(shù)（左心室重量/體質(zhì)量）和心臟重量指數(shù)（心臟重量/體質(zhì)量）。

1.6.2 血標(biāo)本檢測(cè) 水合氯醛麻醉大鼠，股靜脈采血，酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法檢測(cè)血清樣本中TNF-α、IL-6 水平。具體操作根據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行。

1.6.3 心肌組織病理學(xué)檢測(cè) 分離心臟，沿大鼠心尖部縱向?qū)Π肭虚_，取一半心肌組織迅速放入10%甲醛溶液中固定，送病理室，剩余心肌組織液氮中保存。將制備好的心肌組織脫蠟水化，分別進(jìn)行Masson 染色、蘇木精-伊紅染色（hematoxylin and eosin staining，HE 染色）。

1.6.4 心肌NF-κB p65 蛋白表達(dá)檢測(cè) 采用蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)心肌NF-κB p65 蛋白相對(duì)表達(dá)量，具體操作包括制膠、樣品處理、加樣與電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗孵育、二抗孵育、蛋白檢測(cè)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 24.0 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料以例數(shù)（百分率）[n（%）]表示，比較采用χ2檢驗(yàn)。P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠的左心室重量指數(shù)與心臟重量指數(shù)比較

模型組大鼠的左心室重量指數(shù)和心臟重量指數(shù)均顯著高于正常組（P<0.05）。益氣降濁組大鼠的左心室重量指數(shù)和心臟重量指數(shù)均顯著低于模型組、益氣組、降濁組、假手術(shù)組（P<0.05），見表1。

表1 各組大鼠的左心室重量指數(shù)與心臟重量指數(shù)比較（±s）

表1 各組大鼠的左心室重量指數(shù)與心臟重量指數(shù)比較（±s）

注：與益氣降濁組比較，*P<0.05；與正常組比較，#P<0.05

2.2 各組大鼠的心肌組織HE 染色

正常組大鼠心肌組織分布均勻，細(xì)胞排列整齊，肌纖維走行相同，可見少量成纖維細(xì)胞；模型組大鼠心肌排列欠規(guī)則，呈波浪、松散狀，細(xì)胞形態(tài)模糊，成纖維細(xì)胞明顯增加，合并炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；假手術(shù)組與模型組較為相似；益氣組、降濁組、益氣降濁組心肌組織均有顯著變化，益氣降濁組大鼠心肌纖維走行相同，且心肌組織分布均勻性、細(xì)胞排列整齊度均優(yōu)于益氣組和降濁組，見圖1。

圖1 各組大鼠心肌組織（HE 染色，×200）

2.3 各組大鼠的心肌組織Masson 染色

大鼠膠原纖維為藍(lán)色、肌纖維為紅色。正常組大鼠心肌纖維整齊，少量膠原纖維均勻分布于心肌間質(zhì)；模型組大鼠心肌膠原纖維明顯增多，排列紊亂，有心肌纖維化表現(xiàn)；假手術(shù)組大鼠心肌膠原纖維稍有變化，心肌膠原沉積輕微減少，排列不均勻；益氣組、降濁組、益氣降濁組大鼠心肌膠原沉積均明顯減少，心肌纖維整齊，益氣降濁組變化最為明顯，見圖2。

圖2 各組大鼠心肌組織（Masson 染色，×200）

2.4 各組大鼠的TNF-α、IL-6 及NF-κB p65 蛋白表達(dá)水平比較

模型組大鼠的TNF-α、IL-6 及NF-κB p65 蛋白表達(dá)水平均顯著高于正常組（P<0.05）；益氣降濁組大鼠的TNF-α、IL-6 及NF-κB p65 蛋白表達(dá)水平低于模型組、益氣組、降濁組、假手術(shù)組（P<0.05），見表2。

表2 各組大鼠的TNF-α、IL-6 及NF-κB p65 蛋白表達(dá)水平比較（±s）

表2 各組大鼠的TNF-α、IL-6 及NF-κB p65 蛋白表達(dá)水平比較（±s）

注：與益氣降濁組比較，*P<0.05；與正常組比較，#P<0.05

3 討論

尿毒癥是各種腎臟疾病發(fā)展的終末階段，可増加心血管疾病的發(fā)生率和病死率[7]。尿毒癥患者臨床表現(xiàn)為胸悶、胸痛、心悸、呼吸困難等，多伴有心肌肥厚、心臟擴(kuò)大、心輸出量減少，重者出現(xiàn)充血性心力衰竭、猝死[8-9]。心肌病在中醫(yī)屬真心痛、心悸、胸痹等范疇；尿毒癥在中醫(yī)屬腎風(fēng)、虛勞、水腫、癃閉、關(guān)格范疇，是毒、熱、瘀、濕、飲共同作用的結(jié)果。參麥注射液聯(lián)合大黃是治療尿毒癥心肌病的有效手段之一。參麥注射液主要成分為麥冬、紅參，具有養(yǎng)陰生津、益氣固脫之功效，可用于治療氣陰兩虛的疾病，如肺心病、病毒性心肌炎、冠心病等。紅參可增強(qiáng)心肌對(duì)缺氧的耐受力，對(duì)心肌細(xì)胞DNA 合成有促進(jìn)作用。同時(shí)還可調(diào)節(jié)心肌組織血流量，有效保護(hù)受損的心肌超微結(jié)構(gòu)。人參皂苷是紅參的有效成分之一，可抑制血栓烷A2，進(jìn)而擴(kuò)張血管，減少心臟負(fù)荷，緩解心肌缺血。麥冬具有穩(wěn)定心肌細(xì)胞膜、正性肌力作用。參麥注射液可抑制平滑肌細(xì)胞膜Na+-K+-ATP 酶活性，對(duì)Na+-Ca2+與Na+-K+轉(zhuǎn)換產(chǎn)生影響，增加內(nèi)流的Ca2+，以提升心肌收縮功能，降低周圍血管阻力、減少心肌耗氧，調(diào)節(jié)心肌能量代謝，增加缺血心肌能源儲(chǔ)備，清除氧自由基，有效保護(hù)心肌。臨床研究顯示，參麥注射液治療嚴(yán)重心功能不全患者能夠改善心功能，提高心肌收縮力，有直接正性肌力作用[10]。參麥注射液可下調(diào)Bax 蛋白表達(dá)，減少心肌細(xì)胞凋亡，對(duì)心肌細(xì)胞起保護(hù)作用[11]。除注重心肌細(xì)胞的保護(hù)外，也要重視患者毒素的排泄，其中生大黃具有清熱解毒、通里攻下、活血化瘀的作用?？捎行宄改c內(nèi)細(xì)菌、毒素，活血化瘀，調(diào)節(jié)微循環(huán)，加速新陳代謝[12]。大黃性寒、味苦，具有清熱解毒、涼血瀉火、逐瘀通經(jīng)的功效。現(xiàn)代藥理學(xué)研究顯示，大黃可在一定程度上改善與保護(hù)血液流變學(xué)、凝血功能，具有抗心律失常、強(qiáng)心、抗心肌缺血、抗血管痙攣、保護(hù)心肌、抗動(dòng)脈粥樣硬化、降血壓、清除氧自由基等多重功效。大黃酸是大黃的成分之一，研究顯示大黃酸可改善過氧化氫誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷。多項(xiàng)臨床研究顯示大黃提取物大黃素用于急性心肌梗死患者，可保護(hù)心功能，減少梗死面積，還可在一定程度上抑制炎癥反應(yīng)[13-14]。研究發(fā)現(xiàn)，參麥注射液聯(lián)合大黃可顯著降低左心室重量指數(shù)與心臟重量指數(shù)，對(duì)心臟結(jié)構(gòu)變化有改善作用[15]。

研究發(fā)現(xiàn)TNF-α、IL-6 能激活絲裂原激活蛋白激酶信號(hào)通路并誘導(dǎo)其下游轉(zhuǎn)錄因子蛋白家族活化，進(jìn)而誘發(fā)心肌肥厚、促進(jìn)膠原合成，最終損傷心肌[16]。近年來研究證實(shí)，在感染、創(chuàng)傷、毒素等因素的剌激下，活化的細(xì)胞因子扮演信使的作用，激活心肌細(xì)胞的抑制物質(zhì)，最終導(dǎo)致心臟功能受損[17]。本研究結(jié)果提示尿毒癥心肌病模型大鼠炎癥反應(yīng)明顯，TNF-α、IL-6 水平升高，而益氣降濁法能明顯緩解炎癥反應(yīng)，進(jìn)而避免過度激活TNF-α、IL-6。研究證實(shí)，炎癥細(xì)胞因子與NF-кB 調(diào)控作用密切相關(guān)。調(diào)控NF-кB 的重要蛋白之一為IκB-α。藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，尿毒癥心肌病能夠擾亂細(xì)胞調(diào)節(jié)能力，并影響信號(hào)通路系統(tǒng)，器官細(xì)胞的NF-кB 下調(diào)與機(jī)體的炎癥反應(yīng)強(qiáng)度減弱有關(guān)[18]。應(yīng)用參麥注射液后，IκB-α 表達(dá)上調(diào)，減少TNF-α 的生成與釋放，說明對(duì)NF-кB 信號(hào)傳導(dǎo)路徑進(jìn)行調(diào)節(jié)能抑制炎癥反應(yīng)，進(jìn)而保護(hù)機(jī)體細(xì)胞。本研究HE 染色、Masson 染色結(jié)果提示，模型大鼠心肌組織炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、間質(zhì)纖維化、細(xì)胞壞死，益氣降濁法可減輕心肌損傷、改善心肌纖維化。

綜上所述，尿毒癥可通過NF-кB 信號(hào)通路過度激活而誘發(fā)心肌損傷，參麥注射液聯(lián)合大黃能抑制該信號(hào)通路過度激活，緩解炎癥反應(yīng)，保護(hù)心肌細(xì)胞，預(yù)防尿毒癥心肌病。