顱腦損傷病兒血清血凝素樣氧化低密度脂蛋白受體、Toll樣受體4表達水平及臨床意義研究

王文召, 李娜, 劉一鳴

顱腦損傷是指由于外作用力沖擊導(dǎo)致的頭顱和腦損傷性疾病, 是導(dǎo)致殘疾和死亡的首要原因, 主要臨床表現(xiàn)為意識障礙、運動障礙、頭痛、嘔吐等。顱腦損傷可引起一系列病理生理過程, 因其復(fù)雜多變, 且易出現(xiàn)各種并發(fā)癥, 預(yù)后較差, 嚴(yán)重威脅人類生活質(zhì)量和生命安全, 給社會和家庭帶來了沉重的經(jīng)濟負(fù)擔(dān), 因此, 尋找早期分子生物學(xué)預(yù)警指標(biāo), 對病人顱腦損傷程度和預(yù)后進行早期準(zhǔn)確預(yù)測顯得尤為重要[1-2］。血凝素樣氧化低密度脂蛋白受體-1（lectin-like oxidized low-density lipoprotein receptor-1, LOX-1）由270個氨基酸組成, 是氧化低密度脂蛋白（oxidation low-density lipoprotein, ox-LDL）在內(nèi)皮細(xì)胞的主要受體, 對ox-LDL起到特異性結(jié)合、吞噬和降解的作用, 誘導(dǎo)細(xì)胞增殖和凋亡, 激活細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路, 可加重外傷后繼發(fā)性腦損傷[3-4］。Toll樣受體4（Toll-like receptor4, TLR4）是天然免疫受體家族, 主要表達于巨噬細(xì)胞、樹突細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞等, 在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的外傷性損傷、感染性損傷等發(fā)揮及其重要的作用[5-6］。本研究通過檢測顱腦損傷后血清LOX-1、TLR4表達水平, 探討二者與顱腦損傷嚴(yán)重程度及預(yù)后的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取2020年1—12月在南京市兒童醫(yī)院就診的顱腦損傷病兒82例作為研究對象, 其中男42例, 女40例, 年齡（7.54±4.41）歲, 范圍為4～12歲；另選取同時期保健科體檢的90例健康兒童作為對照組, 其中男47例, 女43例, 年齡（8.13±3.29）歲, 范圍為4～13歲, 并做好臨床資料的登記。兩組研究對象性別（χ2=0.02,P=0.895）、年齡（t=1.00,P=0.319）比較, 差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）, 具有可比性。預(yù)后良好組格拉斯哥昏迷量表（GCS）評分（13.05±1.66）分, 范圍為11～15分, 預(yù)后不良組GCS評分（8.64±1.89）分, 范圍為6～11分, 兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

1.2 納入及排除標(biāo)準(zhǔn)納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)頭部CT確診為顱腦外傷；②病人臨床資料完整, 配合治療；③無其他部位嚴(yán)重合并傷。排除標(biāo)準(zhǔn)：①有腦血管病、癲癇病史者；②有免疫系統(tǒng)疾病者；③術(shù)前使用糖皮質(zhì)激素及非甾體抗炎藥；④有心、肝、腎嚴(yán)重疾病者；⑤術(shù)前、手術(shù)中發(fā)生低血壓、缺氧。入選病兒監(jiān)護人或其近親屬簽署知情同意書, 本項研究所用方法符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會赫爾辛基宣言》相關(guān)要求。

1.3 研究方法

1.3.1 樣本采集 抽取所有受試者治療前外周靜脈血4 mL, 4 ℃ 4 000 r/min, 離心10 min, 分離血清分裝至無菌EP管, 標(biāo)記后-80 ℃冰箱凍存待測。

1.3.2 酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）檢測病兒血清LOX-1、TLR4水平 采用ELISA分別檢測病兒血清LOX-1、TLR4水平, 嚴(yán)格按照試劑盒說明書進行操作, LOX-1試劑盒購自普洛邁德生物公司, TLR4試劑盒購自美國ADL公司。

1.3.3 隨訪 顱腦損傷病人出院后6個月, 觀測顱腦損傷病兒轉(zhuǎn)歸情況, 根據(jù)格拉斯哥預(yù)后量表（GOS）分級評定[7］, 分為預(yù)后不良組（病兒功能受限、活動受限, GOS為1～3級）和預(yù)后良好組（病兒恢復(fù)良好, GOS為4～5級）, 比較兩組間LOX-1、TLR4表達情況。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法統(tǒng)計分析采用SPSS 22.0軟件。以±s描述計量資料, 兩組間比較采用兩獨立樣本t檢驗；采用Pearson相關(guān)性分析檢驗顱腦損傷病兒血清LOX-1、TLR4水平的關(guān)系；受試者操作特征曲線（ROC曲線）分析LOX-1、TLR4水平對顱腦損傷預(yù)后不良的診斷價值；logistic回歸分析與顱腦損傷預(yù)后情況的有關(guān)因素,P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組兒童血清LOX-1、TLR4表達水平比較與對照組比較, 顱腦損傷組病兒血清LOX-1、TLR4水平升高（P＜0.05）, 見表1。

表1 兩組兒童血清LOX-1、TLR4水平比較/（μg/L,±s）

表1 兩組兒童血清LOX-1、TLR4水平比較/（μg/L,±s）

注：LOX-1為血凝素樣氧化低密度脂蛋白受體-1, TLR4為Toll樣受體4。

組別對照組顱腦損傷組t值P值例數(shù)90 82 LOX-1 3.13±0.97 13.24±1.69 48.64＜0.001 TLR4 0.52±0.11 8.83±1.57 50.09＜0.001

2.2 不同轉(zhuǎn)歸病兒血清LOX-1、TLR4表達水平比較隨訪6個月期間82例顱腦損傷病兒中33例病兒預(yù)后不良（功能受限、活動受限）, 恢復(fù)良好49例。預(yù)后良好組相比, 預(yù)后不良組病兒血清LOX-1、TLR4水平升高, LOX-1和TLR4水平隨轉(zhuǎn)歸加重呈升高趨勢（P＜0.05）。見表2。

表2 不同轉(zhuǎn)歸顱腦損傷病兒血清中LOX-1和TLR4表達比較/（μg/L,±s）

表2 不同轉(zhuǎn)歸顱腦損傷病兒血清中LOX-1和TLR4表達比較/（μg/L,±s）

注：LOX-1為血凝素樣氧化低密度脂蛋白受體-1, TLR4為Toll樣受體4。

組別預(yù)后良好組預(yù)后不良組t值P值例數(shù)49 33 LOX-1 11.17±1.28 16.31±2.30 12.97＜0.001 TLR4 7.19±1.25 11.19±2.05 10.98＜0.001

2.3 顱腦損傷病兒血清LOX-1、TLR4水平的相關(guān)性顱腦損傷病兒血清LOX-1、TLR4水平呈正相關(guān)（r=0.82,P＜0.001）。

2.4 血清LOX-1、TLR4水平對顱腦損傷病兒預(yù)后不良的診斷價值ROC曲線結(jié)果顯示, 血清LOX-1診斷顱腦損傷病兒預(yù)后不良的曲線下面積（AUC）為0.76, 其95%置信區(qū)間（CI）為（0.65, 0.88）, 靈敏度為66.7%, 特異度為85.7%, 截斷值為9.600 μg/L；TLR4診斷顱腦損傷病兒預(yù)后不良的AUC為0.75, 95%CI為（0.64, 0.87）, 靈敏度為63.6%, 特異度為87.8%, 截斷值為5.354 μg/L；二者聯(lián)合診斷顱腦損傷病兒預(yù)后不良的AUC為0.91, 95%CI為（0.84, 0.98）, 靈敏度為84.8%, 特異度為89.8%。與LOX-1、TLR4單獨檢測比較, 二者聯(lián)合診斷顱腦損傷AUC更高（Z=2.18、2.35,P=0.029、0.019）, 見圖1。

圖1 血清血凝素樣氧化低密度脂蛋白受體-1（LOX-1）、Toll樣受體4（TLR4）水平診斷顱腦損傷病兒82例預(yù)后不良的ROC曲線

2.5 二元logistic回歸分析顱腦損傷病兒預(yù)后不良的影響因素將是否發(fā)生顱腦損傷不良預(yù)后作為因變量（預(yù)后良好=0, 預(yù)后不良=1）, 以顱腦損傷病兒血清LOX-1、TLR4表達水平作為自變量, 進行二元logistic回歸分析, 結(jié)果顯示LOX-1、TLR4水平與顱腦損傷預(yù)后不良有關(guān)（P＜0.05）, 見表3。

表3 顱腦損傷病兒82例預(yù)后的影響因素分析

3 討論

有研究表明, 我國每年大約幾十萬人是死于創(chuàng)傷, 其中死于顱腦損傷占50%以上[8］, 顱腦損傷具有極高的致殘率和病死率, 其主要的病理變化有反應(yīng)性神經(jīng)膠質(zhì)增生、星形膠質(zhì)細(xì)胞增生形成神經(jīng)膠質(zhì)疤痕、神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞大量變性死亡, 這些都不利于顱腦損傷恢復(fù), 可導(dǎo)致病人產(chǎn)生長期病理生理后遺癥, 引起運動認(rèn)知障礙, 嚴(yán)重影響病人生活質(zhì)量[9］。顱腦損傷病情復(fù)雜多變, 預(yù)后較差, 因此顱腦損傷是神經(jīng)外科的診治難題之一, 臨床上評估顱腦損傷病情、指導(dǎo)治療、判斷預(yù)后的常用指標(biāo)有GCS、CT結(jié)果、瞳孔反應(yīng)等, 但有時不能準(zhǔn)確地反應(yīng)顱腦損傷程度, 故尋找更有效的血清生化標(biāo)志物非常重要[10］。

LOX-1是一種Ⅱ型跨膜蛋白, 屬于C型選擇素家族, 在血管內(nèi)皮細(xì)胞表面豐富表達, 與ox-LDL特異性結(jié)合, 影響內(nèi)皮功能, 損傷血管, 并促進腦外傷中的炎性反應(yīng)[11-12］。徐建等[13］研究結(jié)果表明, 與健康對照組比較, 急性冠狀動脈綜合征病人血清LOX-1水平顯著升高, 可能由于血漿中ox-LDL升高誘導(dǎo)LOX-1水平顯著升高, ox-LDL與LOX-1特異性結(jié)合后增強巨噬細(xì)胞吞噬ox-LDL的能力, 從而破壞血管內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能。有研究結(jié)果表明, 冠心病病人血清LOX-1表達水平明顯升高, 而且LOX-1水平隨冠狀動脈病變程度的加重而升高, LOX-1表達水平上調(diào), 促進單核細(xì)胞的黏附、聚集, 致使血管內(nèi)皮損傷[14］。本研究結(jié)果表明, 與對照組比較, 顱腦損傷病兒血清LOX-1表達水平升高, 且其水平隨著顱腦損傷病情的加重而升高, 提示LOX-1在顱腦損傷的發(fā)生中發(fā)揮一定作用, LOX-1與顱腦損傷嚴(yán)重程度密切相關(guān)；預(yù)后不良病兒（死亡及植物狀態(tài)、殘廢組）血清LOX-1水平較預(yù)后良好病兒明顯增高, 提示LOX-1高表達預(yù)后不良, LOX-1高表達促進動脈粥樣硬化的發(fā)生從而影響顱腦損傷病兒恢復(fù), 是導(dǎo)致顱腦損傷病兒預(yù)后不良的原因之一；ROC分析結(jié)果顯示, LOX-1診斷顱腦損傷預(yù)后的AUC為0.76, 靈敏度為66.7%, 特異度為85.7%, 截斷值為9.600 μg/L, 提示當(dāng)血清LOX-1水平高于9.600 μg/L時, 顱腦損傷病兒預(yù)后不良；多因素logistic回歸分析結(jié)果表明血清LOX-1是顱腦損傷預(yù)后不良的危險因素, 提示LOX-1可作為顱腦損傷預(yù)后評估的一個新的潛在標(biāo)志物。

TLR屬于I型跨膜蛋白, 約由200個氨基酸保護域組成, 參與對多種疾病的防御過程, 通過激活小膠質(zhì)細(xì)胞釋放炎性因子, 與炎性反應(yīng)、細(xì)胞信號傳導(dǎo)等過程密切相關(guān)[15-16］。TLR4作為TLRs家族中的重要成員, 在小膠質(zhì)細(xì)胞, 星形膠質(zhì)細(xì)胞、腦血管內(nèi)皮細(xì)胞廣泛表達, 通過結(jié)合相應(yīng)的配體, 使小膠質(zhì)細(xì)胞等釋放炎性因子和炎性趨化因子, 在顱腦損傷繼發(fā)性損傷中發(fā)揮關(guān)鍵作用[17-18］。堯小龍等[19］研究結(jié)果表明, 顱腦損傷病人血清TLR4表達上調(diào), 提示TLR4促進腦外傷中的炎性反應(yīng), 加重外傷后的腦水腫、繼發(fā)性損傷, TLR4在顱腦損傷發(fā)生中起非常重要的作用。有研究結(jié)果表明, 與正常對照組比較, 顱腦損傷病人血清TLR4表達水平升高, 且TLR4表達水平隨著顱腦外傷分級的增加而升高, 與顱腦外傷的嚴(yán)重程度呈正相關(guān), 提示TLR4參與了繼發(fā)性腦損傷, TLR4是導(dǎo)致顱腦損傷病人病情加重影響預(yù)后不良的重要原因之一[20］。本研究結(jié)果表明, 與對照組比較, 顱腦損傷病兒血清TLR4表達水平升高, 且其水平隨著顱腦損傷病情的加重而升高, 提示TLR4在顱腦損傷的發(fā)生中發(fā)揮一定作用, 與顱腦損傷嚴(yán)重程度密切相關(guān)；預(yù)后不良病兒（死亡及植物狀態(tài)、殘廢組）血清TLR4水平較預(yù)后良好病兒明顯增高, 提示TLR4高表達可能可預(yù)測病人預(yù)后不良, 需進行監(jiān)控并及時治療；經(jīng)Pearson法分析顱腦損傷病人血清LOX-1、TLR4水平呈正相關(guān), 提示LOX-1、TLR4可共同評估顱腦損傷預(yù)后情況；ROC分析結(jié)果顯示, TLR4診斷顱腦損傷預(yù)后的AUC為0.75, 靈敏度為63.6%, 特異度為87.8%, 截斷值為5.354 μg/L, LOX-1、TLR4二者聯(lián)合診斷顱腦損傷病兒預(yù)后不良的AUC為0.91, 靈敏度為84.8%, 特異度為89.8%, 與LOX-1、TLR4單獨相比, 二者聯(lián)合診斷顱腦損傷病兒預(yù)后不良的AUC更高；提示當(dāng)血清TLR4水平高于5.354 μg/L時, 顱腦損傷病兒預(yù)后不良可能性較高, 二者聯(lián)合檢測可提高對顱腦損傷病兒預(yù)后不良診斷的靈敏度；多因素logistic回歸分析結(jié)果表明血清TLR4是顱腦損傷預(yù)后不良的危險因素, 提示TLR4可作為顱腦損傷預(yù)后評估的一個新的潛在標(biāo)志物。

綜上所述, LOX-1、TLR4水平與顱腦損傷的病情程度以及預(yù)后有關(guān), 可作為了解病情與轉(zhuǎn)歸的參考指標(biāo)。