簡述動物源食品中磺胺類藥物殘留檢測的前處理方法

許 磊,曹 璐,胡平國

(四川省內(nèi)江市動植物疫病防控和農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量檢測中心,四川 內(nèi)江 610200)

隨著社會的不斷發(fā)展,畜牧養(yǎng)殖業(yè)越來越現(xiàn)代化、規(guī)模化和集約化。為了降低動物的發(fā)病率和死亡率,促進動物的生長,改善動物源食品的品質(zhì),獸藥的使用已成為畜牧養(yǎng)殖業(yè)不可缺少的基礎(chǔ)?；前奉愃幬锸侵妇哂袑Π被交酋０方Y(jié)構(gòu)的一類藥物的總稱,由于其抗菌譜較廣、價格低廉、使用簡便、性質(zhì)較穩(wěn)定、方便長期儲存等諸多優(yōu)點,常作為獸藥應(yīng)用于畜牧養(yǎng)殖業(yè)中預(yù)防和治療細菌感染性疾病[1]。但近年來,由于科學(xué)知識的缺乏和經(jīng)濟利益的驅(qū)使,濫用、非法使用和超標(biāo)使用磺胺類藥物的情況普遍存在,許多動物源食品中常常存在該類藥物的殘留問題,導(dǎo)致人類往往成為該類藥物的“被動吸收者”,極大可能引發(fā)過敏反應(yīng)、血液系統(tǒng)反應(yīng)、肝功能損害以及泌尿道損害等,危害人類的身體健康。因此,中國、歐盟、美國、國際食品法典委員會均規(guī)定了動物源性食品中磺胺類藥物的最大殘留限量值[2]。

通常動物源食品的原形樣品種類繁多、成分復(fù)雜、干擾因素多,不適合直接用于分析檢測,因而在進行磺胺類藥物殘留分析檢測前必須對樣品進行前處理操作。樣品前處理是為了去除樣品中的微小顆粒,減少干擾物質(zhì),將樣品中的磺胺類藥物殘留提取出來并進行濃縮凈化,從而提高分析檢測的靈敏度、選擇性、準(zhǔn)確度及精密度,保護色譜柱及儀器,改善和優(yōu)化色譜分析等。由此可見,樣品前處理技術(shù)是分析檢測及其關(guān)鍵的環(huán)節(jié),占用近70%的檢測工作量,樣品前處理的好壞直接影響分析結(jié)果的準(zhǔn)確性[3]。文章重點簡述QuEChERs方法、SPE法和傳統(tǒng)前處理方法三類常用的磺胺類藥物殘留檢測液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法的前處理方法,通過分析比較,尋找出高效、快速的前處理方法,對縮短磺胺類藥物殘留的檢測時間,提高檢測分析結(jié)果的準(zhǔn)確性提供參考。

1 QuEChERs方法

QuEChERs方法是2003年由美國農(nóng)業(yè)部Anastassiades M等人開發(fā)的一種基于固相萃取和基質(zhì)固相分散技術(shù)的前處理方法。該方法具有快速(Quick)、簡單(Easy)、低廉(Cheap)、有效(Effective)、穩(wěn)定(Rugged)和安全(Safe)的特點,將這六個特點的英文字母簡寫組合在一起,由此命名 QuEChERs[4]。近年來,QuEChERs方法發(fā)展迅速,目前已在多個檢測領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。隨著技術(shù)不斷改進,QuEChERs方法在磺胺類藥物的分離中有很好的提取效果。以下介紹一個磺胺類藥物殘留檢測液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法的QuEChERs前處理方法作為參考。

1.1 實驗原理

選擇5%甲酸乙腈溶液作為萃取溶劑,實現(xiàn)高效的蛋白質(zhì)沉淀,將磺胺類藥物殘留萃取到有機相中。再利用增強型脂質(zhì)去除凈化管(dSPE EMR-Lipid)和反萃管(EMR-Polish)凈化鹽析萃取步驟相結(jié)合進行凈化,經(jīng)濃縮后定容裝瓶供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀檢測。

1.2 試劑和材料

乙腈(色譜純)、甲酸(分析純)、dSPE EMR-Lipid增強型脂質(zhì)去除凈化管、EMR-Lipid Polish反萃管、水為GB/T 6682-2008規(guī)定的一級水,0.22μm濾膜。

1.3 儀器設(shè)備

電子天平(感量:0.01g)、移液器、渦旋震蕩器、離心機、氮吹儀。

1.4 實驗操作

稱取2g均質(zhì)后的組織樣品,精確至0.01g,置于50mL離心管中,加入10mL 5%甲酸乙腈提取溶液,渦旋振蕩5min,5000r/min離心5min,上清液備用。dSPE EMR-Lipid 凈化管先用3mL水充分活化,再加入上述備用液,渦旋振蕩5min,5000r/min離心5min,上層溶液轉(zhuǎn)入EMR-Polish反萃管中,渦旋震蕩5min,5000r/min離心5min,上清液全部轉(zhuǎn)移至干凈離心管中,于40～50℃水浴氮吹至干。最后用0.5mL水和0.5mL 5%甲酸乙腈溶液定容,過0.22μm濾膜,裝入上機小瓶,供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀分析。

1.5 分析結(jié)論

從前處理過程可以看出此方法操作步驟簡單,使用儀器設(shè)備較少,裝置簡單,花費時間較短,利于大批量操作。使用的試劑毒性較小,消耗量少,價格低廉,并且大部分操作都在封閉的離心管內(nèi)進行,對人體危害較小,對環(huán)境友好。從液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測分析結(jié)果可以得出:此方法的精密度和準(zhǔn)確度都較高。但是,針對脂肪含量高的樣品,此方法的凈化效果不理想,提取效率較低以及凈化過程損失較大。

2 SPE法

SPE法是從80年代中期開始發(fā)展起來的一種樣品前處理方法,通過選擇不同類型的固相萃取柱將液體樣品中的目標(biāo)化合物進行吸附后,再經(jīng)過洗脫從而分離和富集目標(biāo)化合物[5]。以下介紹一個磺胺類藥物殘留檢測液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法的SPE前處理方法作為參考。

2.1 實驗原理

選擇乙酸乙酯作為提取溶液,將組織樣品中的磺胺類藥物殘留提取出來,氮吹濃縮后用0.1mol/L鹽酸溶液溶解殘渣,再經(jīng)過固相萃取凈化后,裝瓶供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀檢測。

2.2 試劑和材料

乙酸乙酯(色譜純)、正已烷(色譜純)、甲醇(色譜純)、乙腈(色譜純)、鹽酸(分析純)、氨水(分析純)、水為GB/T 6682-2008規(guī)定的一級水,MCX固相萃取柱(150mg,6mL)、0.22μm濾膜。

2.3 儀器設(shè)備

電子天平(感量:0.01g)、移液器、渦旋震蕩器、離心機、氮吹儀、固相萃取裝置。

2.4 實驗操作

稱取5g均質(zhì)后的組織樣品,精確至0.01g,置于50mL離心管中,加入15mL乙酸乙酯溶液,渦旋振蕩5min,5000r/min離心5min,上清液轉(zhuǎn)移至另一干凈離心管,殘渣中再加入15mL乙酸乙酯溶液,重復(fù)上述操作,合并兩次提取液,于45℃水浴中氮吹至干。加入5mL 0.1mol/L的鹽酸溶液溶解殘渣,再加入5mL正己烷溶液,渦旋振蕩2min,5000r/min離心5min,棄去上層正己烷溶液。鹽酸溶液中再加入5mL正己烷溶液,重復(fù)上述操作,下層溶液備用。MCX固相萃取柱先用3mL甲醇溶液和3mL 0.1mol/L鹽酸溶液活化和平衡,將上述備用液以自然滴液速度過柱,然后分別用2mL 0.1mol/L鹽酸溶液和2mL(水∶甲醇∶乙腈=55∶25∶20)溶液淋洗小柱,真空抽干。最后用2mL(水∶甲醇∶乙腈∶氨水=75∶10∶10:5)溶液洗脫,真空抽干,收集洗脫液,于45℃水浴中氮吹至干。準(zhǔn)確加入1mL水定容,過0.22μm有機濾膜后,裝入上機小瓶,供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀檢測分析。

2.5 分析結(jié)論

從前處理過程可以看出此方法使用的溶劑毒性較小,有機溶劑消耗量較少,對操作人員健康危害較小,對環(huán)境友好。但操作復(fù)雜,勞動強度較大,手工操作居多,容易損失樣品,周期時間較長,不利于大批量操作,成本較高,完成一個樣品處理需要較高的價格。從液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測分析結(jié)果可以得出:此方法精密度和準(zhǔn)確度都較低。

3 傳統(tǒng)前處理方法

傳統(tǒng)前處理方法包括液液萃取法或溶劑萃取法,是利用2種互不相溶的溶劑中分配系數(shù)的不同而達到分離目的的方法?；前奉愃幬餁埩魴z測的傳統(tǒng)前處理方法比較多,以下主要介紹3個磺胺類藥物殘留檢測液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法的傳統(tǒng)前處理方法,為提高檢測分析效率和檢測分析結(jié)果的準(zhǔn)確性提供參考性意義。

3.1 方法一

3.1.1 實驗原理 將C18填料加入到組織樣品中,研磨均勻,選擇乙腈水(乙腈∶水=1000∶30)溶液作為提取溶液,在微波輻射輔助下將組織樣品中的磺胺類藥物提取出來,再加入乙腈飽和的正己烷溶液分離凈化后,裝瓶供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀檢測。

3.1.2 試劑和材料 C18填料(40μm)、乙腈(色譜純)、正已烷(色譜純)、乙腈飽和的正己烷溶液(將200mL正己烷溶液裝入250mL分液漏斗中,加入少量乙腈溶液,劇烈振搖幾分鐘后,靜置分層,棄去下層乙腈溶液)、水為GB/T 6682-2008規(guī)定的一級水、0.22μm濾膜。

3.1.3 儀器設(shè)備 電子天平(感量:0.01g)、玻璃研缽、移液器、渦旋震蕩器、家用微波爐、離心機、氮吹儀。

3.1.4 實驗操作 稱取2g均質(zhì)后的組織樣品,精確至0.01g,裝入玻璃研缽,再稱取6g C18填料同樣裝入玻璃研缽,用玻璃杵輕輕研磨將組織樣品與C18填料混合均勻?；旌暇鶆蚝蟮臉悠忿D(zhuǎn)移至干凈的50mL離心管,加入25mL乙腈水(乙腈∶水=1000∶30)溶液,渦旋振蕩5min,放入家用微波爐,用光波模式微波輻照30s,5000r/min離心5min,乙腈層轉(zhuǎn)入100mL分液漏斗。殘渣中再加入25mL乙腈溶液,渦旋振蕩5min,微波爐光波模式微波輻照30s,5000r/min離心5min,合并乙腈提取液,待凈化。往裝有乙腈提取液的分液漏斗中加入25mL乙腈飽和正己烷溶液,振搖5min,靜置2min,將下層乙腈溶液轉(zhuǎn)入干凈的50mL玻璃試管,于45℃水浴氮吹至干。準(zhǔn)確加入1mL乙腈水(乙腈∶水=1∶1)溶液溶解殘渣后,轉(zhuǎn)移至10mL離心管中,再加入1mL乙腈飽和正己烷溶液,渦旋振蕩2min,5000r/min離心5min,棄去上層正己烷溶液,下層乙腈水溶液過0.22μm濾膜后,裝入上機小瓶,供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀分析。

3.1.5 結(jié)果分析 從前處理過程可以看出此方法無需特殊裝置,成本也較低,但是操作繁瑣,費時費力,不利于大批量操作。使用的溶劑毒性較小,但有機溶劑消耗量大,不但對操作人員的健康有一定影響,還會造成環(huán)境污染。從液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀檢測分析結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)此方法的精密度和準(zhǔn)確度都較低。

3.2 方法二

3.2.1 實驗原理 選擇乙酸乙酯溶液作為提取溶液,將組織樣品中的磺胺類藥物殘留提取出來,分取適量提取液氮吹至干,再用定溶液(甲醇∶5mmol/L甲酸溶液=20∶80)定容,經(jīng)正己烷溶液去脂后,裝瓶供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測定。

3.2.2 試劑和材料 乙酸乙酯(色譜純)、甲醇(色譜純)、甲酸(分析純)、正己烷(色譜純)、定溶液(甲醇∶5mmol/L甲酸溶液=20∶80)、水為GB/T 6682-2008規(guī)定的一級水、0.22μm濾膜。

3.2.3 儀器設(shè)備 分析天平(量感:0.01g)、移液器、均質(zhì)機、渦旋震蕩器、離心機、氮吹儀。

3.2.4 實驗操作 稱取5g均質(zhì)后的組織樣品,精確至0.01g,置于50mL離心管中,加入15mL乙酸乙酯溶液,超聲10min,14000r/min均質(zhì)30s,5000r/min離心5min,上清液轉(zhuǎn)入25mL比色管。殘渣中再加入10mL乙酸乙酯溶液,超聲10min,渦旋振蕩2min,5000r/min離心5min,合并上清液至比色管中,用乙酸乙酯定容至25mL,搖勻后,分取5mL于15mL離心管中,40℃水浴氮吹至干。用2mL定溶液(甲醇∶5mmol/L甲酸溶液=20∶80)溶解殘渣,渦旋振蕩1min,超聲5min,加入5mL正己烷溶液,渦旋振蕩30s,5000r/min離心5min,棄去上層正己烷溶液,再加入5mL正己烷溶液,渦旋振蕩30s,10000r/min離心5min,棄去上層正己烷溶液,下層清液過0.22μm濾膜后,裝瓶供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀檢測。

3.2.5 分析結(jié)論 從前處理過程可以看出此方法操作簡單,無需特殊的儀器設(shè)備便能完成整個處理過程,花費時間較短,適合大批量操作,使用的溶劑較少,毒性較小,對人體健康危害較小,對環(huán)境友好,成本較低,用較低的價格就能完成樣品處理。從液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測分析結(jié)果可以得出:此方法的精密度和準(zhǔn)確度均中等。

3.3 方法三

3.3.1 實驗原理 選擇乙腈溶液作為提取溶液,將組織樣品中磺胺類藥物殘留提取出來,氮吹濃縮后,再用流動相(乙腈∶0.01mol/L乙酸銨溶液=12∶88)定容,正己烷溶液去脂后,裝瓶供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測定。

3.3.2 試劑與材料 乙腈(色譜純)、正已烷(色譜純)、乙酸銨(分析純)、無水硫酸鈉(分析純)、流動相(乙腈∶0.01mol/L乙酸銨溶液=12∶88)、水為GB/T 6682-2008規(guī)定的一級水、0.22μm濾膜。

3.3.3 儀器設(shè)備 分析天平(量感:0.01g)、移液器、均質(zhì)機、渦旋震蕩器、離心機、氮吹儀。

3.3.4 實驗操作 稱取5g均質(zhì)后的組織樣品,精確至0.01g,置于50mL離心管,加入15mL乙腈溶液,再加入10g無水硫酸鈉,均質(zhì)2min,5000r/min離心5min,上清液轉(zhuǎn)入干凈離心管中。殘渣中再加入10mL乙腈溶液,渦旋振蕩5min,5000r/min離心5min,合并上清液。50℃水浴氮吹至干,準(zhǔn)確加入1mL流動相(乙腈∶0.01mol/L乙酸銨溶液=12∶88)和1mL正己烷溶溶液解殘渣,轉(zhuǎn)移至10mL離心管,渦旋振蕩2min,5000r/min離心5min,棄去上層正己烷溶液。再加入1mL正己烷溶液,渦旋振蕩2min,5000r/min離心5min,棄去上層正己烷溶液,下層清液過0.22μm濾膜后,裝入上機小瓶,供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀分析。

3.3.5 結(jié)果分析 從前處理過程可以看出此方法操作簡單,使用儀器設(shè)備較少,無需良好訓(xùn)練和較高技能便能很好地完成,花費時間較少,效率高,有利于大批量操作,使用的試劑毒性較小,有機溶劑使用量較少,對操作人員危害較小,以及對環(huán)境友好,成本較低,用較低的價格就能完成一個樣品的處理。從液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀檢測分析結(jié)果可以得出:此方法的精密度和準(zhǔn)確度都較高。

隨著經(jīng)濟的快速發(fā)展,人們對動物源食品的質(zhì)量和安全提出了更高的要求,獸藥殘留檢測已成為和民生息息相關(guān)的工作。磺胺類藥物作為最普遍使用的獸藥種類之一,其殘留檢測也一直是獸藥殘留檢測工作的重點之一。為了保證磺胺類獸藥殘留檢測工作的效率和質(zhì)量,科學(xué)建立高效、準(zhǔn)確的樣品前處理方法是及其重要和關(guān)鍵的環(huán)節(jié)。