固相萃取-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定人尿中苯氧乙酸除草劑和有機(jī)磷、擬除蟲菊酯農(nóng)藥代謝物

張 續(xù), 韓林學(xué), 邱 天, 胡小鍵, 朱 英, 楊艷偉

(中國(guó)疾病預(yù)防控制中心環(huán)境與人群健康重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 中國(guó)疾病預(yù)防控制中心環(huán)境與健康相關(guān)產(chǎn)品安全所, 北京 100021)

農(nóng)藥是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的重要生產(chǎn)要素,在提高農(nóng)作物產(chǎn)量和保障糧食安全中發(fā)揮重要作用。近幾十年,農(nóng)藥在全球范圍內(nèi)的生產(chǎn)和使用呈現(xiàn)增長(zhǎng)趨勢(shì)[1-3]。1995～2020年,我國(guó)各類農(nóng)藥的年總產(chǎn)量從41.65萬(wàn)噸增長(zhǎng)到214.8萬(wàn)噸[4],成為全球最大的農(nóng)藥生產(chǎn)國(guó)和消費(fèi)國(guó)[5]。農(nóng)藥的大規(guī)模使用已對(duì)我國(guó)生態(tài)環(huán)境造成潛在威脅[6]。空氣[7]、地表水[8]、地下水[9]、土壤[10]等環(huán)境介質(zhì)和果蔬[11]等農(nóng)產(chǎn)品中均可檢出農(nóng)藥殘留。其中華東地區(qū)城市空氣中毒死蜱和擬除蟲菊酯總含量為150～3 816 pg/m3[7];華中地區(qū)地表水、地下水中有機(jī)磷農(nóng)藥總含量分別為81.5～225.1 ng/L和17.6～321.8 ng/L[12]。農(nóng)藥暴露可造成神經(jīng)系統(tǒng)[13,14]、呼吸系統(tǒng)[15]和內(nèi)分泌系統(tǒng)[16]損傷,還能誘導(dǎo)腫瘤發(fā)生[17],其暴露也會(huì)對(duì)孕婦及兒童等環(huán)境易感人群產(chǎn)生健康影響[18]。針對(duì)農(nóng)藥開展的暴露評(píng)估已成為環(huán)境健康領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。

除有機(jī)氯等持久性農(nóng)藥外,大部分在售農(nóng)藥在人體內(nèi)無(wú)明顯蓄積,數(shù)小時(shí)或數(shù)日內(nèi)可通過(guò)腎臟隨尿液排出體外[19]。因此,測(cè)定尿中農(nóng)藥或代謝物的濃度水平,可在一定程度上反映其暴露數(shù)據(jù)。美國(guó)、加拿大等國(guó)家已針對(duì)其本國(guó)居民開展了多次農(nóng)藥暴露監(jiān)測(cè)工作,監(jiān)測(cè)指標(biāo)涉及樂果、呋喃酚、2-異丙基-6-甲基-4-吡啶醇、4-氟-3-苯氧基苯甲酸(4F-3PBA,氯氟氰菊酯代謝物)、3-苯氧基苯甲酸(3-PBA,氯菊酯和氯氰菊酯代謝物)、順式二氯乙烯基二甲基環(huán)丙烷羧酸(cis-DCCA,溴氰菊酯代謝物)、反式二氯乙烯基二甲基環(huán)丙烷羧酸(trans-DCCA,氯菊酯和氯氰菊酯代謝物)、2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)、2,4,5-三氯苯氧乙酸(2,4,5-T)等50余種農(nóng)藥類生物標(biāo)志物;采用的分析方法包括高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-MS/MS)、在線固相萃取-液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(Online-SPE-LC-MS/MS)和氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)等。我國(guó)于2017年啟動(dòng)國(guó)家人體生物監(jiān)測(cè)工作,已將農(nóng)藥作為一類重要的監(jiān)測(cè)指標(biāo)[20]。因此,亟需建立準(zhǔn)確、穩(wěn)定和快速的分析方法,以滿足大樣本量的分析測(cè)定工作。Mark等[21]利用全自動(dòng)固相萃取處理尿液樣本,HPLC-MS/MS法測(cè)定尿中對(duì)硝基苯酚(PNP,對(duì)硫磷代謝物)、3,5,6-三氯-2-吡啶酚(TCPY,毒死蜱代謝物)等12種特異性的農(nóng)藥標(biāo)志物。該法前處理通量高,測(cè)定物質(zhì)種類多,但其在前處理過(guò)程中使用的丙酮溶劑在我國(guó)屬于管制品,不易獲得,導(dǎo)致方法使用受限。加拿大生物監(jiān)測(cè)項(xiàng)目采用液液萃取-柱前衍生的方法進(jìn)行尿液前處理,再利用UPLC-MS/MS和GC-MS測(cè)定TCPY及3-PBA等4種擬除蟲菊酯代謝物[22]。該法存在操作繁瑣、處理效率低、有機(jī)溶劑用量大等缺點(diǎn),對(duì)環(huán)境不夠友好且不適用于大樣本的檢測(cè)。

本工作建立了人尿中2種苯氧乙酸類除草劑(2,4-D、2,4,5-T)、2種有機(jī)磷類農(nóng)藥代謝物(PNP、TCPY)和4種擬除蟲菊酯類農(nóng)藥代謝物(3-PBA、4F-3PBA、cis-DCCA、trans-DCCA)共8種農(nóng)藥及農(nóng)藥代謝物的固相萃取-液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定方法。該法采用96孔離線固相萃取處理尿液樣本,具有操作簡(jiǎn)單、測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確、穩(wěn)定性好、樣品處理通量高的優(yōu)點(diǎn),適用于尿液樣本中這8種農(nóng)藥及農(nóng)藥代謝物的快速批量測(cè)定。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

AB SCIEX 6500+三重四極桿質(zhì)譜儀(美國(guó)AB公司); I-Class超高效液相色譜(美國(guó)沃特世公司); 2K-15高速離心機(jī)(美國(guó)SIGMA公司);恒溫水浴搖床(萊伯泰科儀器股份有限公司); 96孔固相萃取裝置(美國(guó)沃特世公司); MPC-2000離心機(jī)(北京鼎昊科技有限公司); IQ7005超純水機(jī)(美國(guó)Milli-Q公司); NDK200-1A氮吹儀(杭州米歐儀器公司)。

農(nóng)藥及農(nóng)藥代謝物標(biāo)準(zhǔn)溶液:PNP、TCPY、2,4-D、2,4,5-T單標(biāo)溶液購(gòu)自Accu-standard公司,質(zhì)量濃度均為100 μg/mL,純度>97%; 4F-3PBA購(gòu)自Ehrenstorfer公司,質(zhì)量濃度為100 μg/mL,純度>98%; 3-PBA、cis-DCCA、trans-DCCA和8種目標(biāo)分析物的同位素內(nèi)標(biāo)單標(biāo)溶液(13C6-PNP、13C3-TCPY、13C6-3-PBA、13C6-4F-3PBA、13C2-D1-cis-DCCA、13C2-D1-trans-DCCA、13C6-2,4-D、13C6-2,4,5-T)購(gòu)自Cambridge Isotope Laboratories公司,質(zhì)量濃度均為100 μg/mL,純度>97%。

甲醇(色譜級(jí))購(gòu)自德國(guó)Merck公司;乙腈(色譜級(jí))、無(wú)水乙酸鈉(色譜級(jí))和β-葡萄糖醛酸酶(酶活力>85 000 U/mL)購(gòu)自美國(guó)SIGMA公司;乙酸(色譜級(jí))購(gòu)自美國(guó)TIEDA公司;96孔Oasis HLB固相萃取柱(30 mg)購(gòu)自美國(guó)沃特世公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)條件

1.2.1色譜條件

色譜柱:Waters Acquity BEH C18(100 mm×2.1 mm, 1.7 μm);流動(dòng)相A: 0.1%(體積分?jǐn)?shù))乙酸水;流動(dòng)相B: 0.1%(體積分?jǐn)?shù))乙酸乙腈;進(jìn)樣量:10 μL;柱溫:40 ℃。梯度洗脫:0～1.0 min, 95%A; 1.0～2.0 min, 95%A～80%A; 2.0～4.0 min,保持80%A; 4.0～5.0 min, 80%A～60%A; 5.0～7.0 min,保持60%A; 7.0～8.0 min, 60%A～50%A; 8.0～10.0 min,保持50%A; 10.0～10.5 min, 50%A～0A; 10.5～12.5 min,保持0A; 12.5～13.0 min, 0A～95%A; 13.0～16.0 min,保持95%A。

1.2.2質(zhì)譜條件

離子源:電噴霧電離源(ESI);電離方式:負(fù)電離;掃描模式:多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式;碰撞氣(CAD): High;氣簾氣(CUR): 207 kPa;霧化氣(GS1): 345 kPa;加熱氣(GS2): 414 kPa;噴霧電壓(IS): -4 500 V;離子源溫度(TEM): 350 ℃;入口電壓(EP): -10 V;掃描時(shí)間:30 ms。8種目標(biāo)分析物及內(nèi)標(biāo)的其他質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 8種目標(biāo)物及其同位素內(nèi)標(biāo)的質(zhì)譜參數(shù)

1.3 溶液配制

混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(4 mg/L):用移液管準(zhǔn)確移取8種目標(biāo)分析物單標(biāo)溶液各1.0 mL至25 mL容量瓶中,用乙腈定容;將定容好的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液放置在4 ℃下溶解12 h,再將混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液分裝至2 mL安瓿瓶中,封口后于4 ℃保存。

混合同位素內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液(4 mg/L):按混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液配制方法配制混合同位素內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液。使用時(shí),將混合同位素內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液用純水稀釋成100 μg/L的混合內(nèi)標(biāo)工作液使用。

系列標(biāo)準(zhǔn)溶液配制:用乙腈將混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液稀釋至質(zhì)量濃度為1 000、100和10 μg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液;吸取適量混合標(biāo)準(zhǔn)工作液,配制成0.1、0.5、1、2.5、5、10、25、50、100 μg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液,內(nèi)標(biāo)添加量為20 μg/L。

1.4 樣品前處理

將尿液樣本平衡至室溫,渦旋混勻后取1 mL尿液到5 mL聚丙烯離心管中。向離心管中加入500 μL乙酸鈉溶液(0.2 mol/L)、100 μL混合內(nèi)標(biāo)工作液和15 μLβ-葡萄糖醛酸酶,混勻后于37 ℃酶解過(guò)夜。酶解后取出樣品降至室溫,加入20 μL乙酸,振蕩,4 500 r/min離心10 min,取上清液進(jìn)行固相萃取。

依次用1 mL甲醇和1 mL水活化及平衡每個(gè)固相萃取孔;在一定壓力條件下進(jìn)行樣品上樣(1滴/s)。上樣完成后,每孔用1 mL 25%(體積分?jǐn)?shù))甲醇水溶液快速淋洗,空氣抽干5 min,用1 mL甲醇分兩次洗脫(每次0.5 mL)。洗脫液收集于96孔收集板中,氮吹濃縮至約200 μL,加入50 μL純水作為保護(hù)劑。繼續(xù)氮吹至50 μL,加入450 μL 10%乙腈水(體積分?jǐn)?shù))進(jìn)行復(fù)溶,4 500 r/min離心10 min后上機(jī)測(cè)定。

1.5 質(zhì)量保證與控制

為降低空白干擾,實(shí)驗(yàn)使用的玻璃器皿、槍頭和離心管等實(shí)驗(yàn)耗材均為一次性使用。實(shí)驗(yàn)試劑為HPLC級(jí)或MS級(jí)試劑;塑料離心管采用聚丙烯材質(zhì),且在每次使用前均用純水和甲醇分別潤(rùn)洗2遍;玻璃試管清洗干凈后在450 ℃下烘烤4 h以上。

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件優(yōu)化

將50 μg/L單標(biāo)溶液注入質(zhì)譜儀進(jìn)行目標(biāo)分析物的質(zhì)譜參數(shù)優(yōu)化。由于8種目標(biāo)化合物的結(jié)構(gòu)中均含有羥基,在ESI源下易失去H而形成[M-H]-的母離子。因此,本實(shí)驗(yàn)在負(fù)電離模式下確定化合物及其同位素內(nèi)標(biāo)的母離子信息。確定母離子后,再依次進(jìn)行子離子掃描,選擇豐度較高的2個(gè)特征碎片離子作為子離子,同時(shí)優(yōu)化各特征離子對(duì)的碰撞能量和去簇電壓。最后在MRM模式下對(duì)CAD、CUR、GS1、TEM等質(zhì)譜參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化,使各目標(biāo)化合物的離子化效果均處于最佳狀態(tài)。

2.2 液相色譜條件優(yōu)化

2.2.1色譜柱

采用Waters Acquity UPLC BEH C18(100 mm×2.1 mm, 1.7 μm)、Waters Xbridge C18(100 mm×2.1 mm, 2.5 μm)、Waters CSH C18(100 mm×2.1 mm, 1.7 μm)、Waters HSS T3(100 mm×2.1 mm, 1.7 μm)和Waters BEH Phenyl(100 mm×2.1 mm, 1.7 μm)柱對(duì)8種目標(biāo)分析物進(jìn)行色譜分離。結(jié)果顯示,以乙腈-水為流動(dòng)相時(shí),8種目標(biāo)分析物在CSH C18、HSS T3和BEH Phenyl柱上的保留效果不理想。目標(biāo)分析物經(jīng)3種色譜柱分離后的質(zhì)譜響應(yīng)顯著低于BEH C18和Xbridge C18柱。除此之外,使用HSS T3和BEH Phenyl柱進(jìn)行分析時(shí),其色譜圖的基線明顯偏高。對(duì)比BEH C18和Xbridge C18色譜柱的分離效果,發(fā)現(xiàn)BEH C18柱在兼顧靈敏度的條件下實(shí)現(xiàn)了cis-DCCA和trans-DCCA兩種同分異構(gòu)體的完全分離。因此,實(shí)驗(yàn)選擇BEH C18柱作為分析柱。

2.2.2流動(dòng)相

以BEH C18作為分析柱,在甲醇-水和乙腈-水兩種流動(dòng)相體系下優(yōu)化洗脫梯度。結(jié)果顯示,無(wú)論如何調(diào)節(jié)洗脫梯度,甲醇-水進(jìn)行洗脫時(shí)均無(wú)法實(shí)現(xiàn)cis-DCCA和trans-DCCA的有效分離,兩種目標(biāo)物表現(xiàn)為重疊峰或駝峰。當(dāng)以乙腈-水作為流動(dòng)相時(shí),可通過(guò)調(diào)整洗脫梯度實(shí)現(xiàn)兩種物質(zhì)的完全分離。

在流動(dòng)相中加入有機(jī)酸能改善帶負(fù)電荷的目標(biāo)分析物在色譜柱上的保留效果[19]。因此,向流動(dòng)相中加入不同體積分?jǐn)?shù)的乙酸(0.05%、0.1%和0.2%)以確定最優(yōu)流動(dòng)相。結(jié)果顯示,隨著乙酸濃度增加,目標(biāo)分析物的色譜峰變窄,色譜分離度提高。然而,在改善分離效率的同時(shí),乙酸對(duì)多種目標(biāo)分析物的電離產(chǎn)生了抑制,導(dǎo)致靈敏度降低。因此,綜合考慮同分異構(gòu)體的分離效果和方法的靈敏度,實(shí)驗(yàn)最終選擇0.1%(體積分?jǐn)?shù))乙酸乙腈和0.1%(體積分?jǐn)?shù))乙酸水作為流動(dòng)相。在此流動(dòng)相條件下,8種目標(biāo)分析物的提取離子色譜圖見圖1。

圖1 尿液中8種目標(biāo)分析物的提取離子色譜圖

2.3 前處理?xiàng)l件優(yōu)化

2.3.1酶解條件優(yōu)化

尿液中的目標(biāo)分析物主要以葡萄糖醛酸酯和/或硫酸酯等結(jié)合物形式存在。因此,應(yīng)先對(duì)樣品進(jìn)行酶解。Mark等[21]和Paramjit等[23]采用固體酶酶解過(guò)夜的方式處理尿液樣本,酶活力分別>500 U/mL和>1 000 U/mL。本課題組前期研究表明,來(lái)源相同(如全部來(lái)自羅曼蝸牛)的固體酶和液體酶,其酶解效率可能存在差異[24]。因此,方法比較了不同液體酶添加量(10、15和20 μL)的酶解效果。結(jié)果表明,添加10 μL液體酶時(shí)(酶活力>850 U/mL),尿中各目標(biāo)分析物的測(cè)定值最低;添加量15 μL液體酶時(shí)(酶活力>1 275 U/mL),尿中各物質(zhì)的測(cè)定值進(jìn)入平臺(tái)期,與添加20 μL液體酶(酶活力>1 700 U/mL)的測(cè)定結(jié)果一致。因此,本方法確定液體酶添加量為15 μL。在相同酶活力條件下,比較兩個(gè)不同來(lái)源(來(lái)源于羅曼蝸牛和大腸桿菌)液體酶的酶解效果。結(jié)果表明,羅曼蝸牛液體酶對(duì)PNP和2,4-D兩類物質(zhì)的酶解效率更高,兩類物質(zhì)的測(cè)定值比大腸桿菌液體酶酶解后的測(cè)定值高1倍。因此,方法選擇羅曼蝸牛β-葡萄糖醛酸酶進(jìn)行酶解,添加量為15 μL(酶活力>1 275 U/mL)。

2.3.2上樣條件

對(duì)樣品進(jìn)行適度酸化能增加目標(biāo)分析物在HLB柱上的富集和保留。向酶解完成的尿液中加入不同體積的乙酸(0、10、20、30 μL),比較目標(biāo)分析物在不同乙酸添加條件下的質(zhì)譜響應(yīng)。峰面積越高,表明在該條件下有更多的目標(biāo)物被富集在固相萃取柱上。結(jié)果顯示,隨著乙酸添加量增加,8種目標(biāo)分析物的定量離子峰面積均呈現(xiàn)不同程度的增加,其中以2,4-D的增加最為顯著。當(dāng)乙酸添加量為20 μL時(shí),目標(biāo)分析物峰面積達(dá)到最高值。因此,本方法向酶解完成的樣品中添加20 μL乙酸以提高目標(biāo)分析物的靈敏度。

2.3.3淋洗條件

用不同體積分?jǐn)?shù)(5%、10%、15%、20%、25%、30%)的甲醇水溶液淋洗固相萃取柱,以不同淋洗條件下各目標(biāo)分析物的色譜峰面積大小來(lái)評(píng)估淋洗效果。結(jié)果顯示,隨著甲醇比例的增加,8種目標(biāo)分析物的色譜峰面積均呈現(xiàn)增加趨勢(shì)(增加幅度為10%～15%)。當(dāng)甲醇體積分?jǐn)?shù)為25%時(shí),峰面積增加幅度最大。其原因是淋洗液中的甲醇比例升高導(dǎo)致淋洗液極性降低,低極性溶液在反相固相萃取柱上具有更大的淋洗強(qiáng)度。因此有更多的干擾物被淋洗,進(jìn)而降低了基質(zhì)對(duì)樣品測(cè)定的干擾。而當(dāng)淋洗液中甲醇比例升高至30%時(shí),此時(shí)由于淋洗強(qiáng)度變強(qiáng),部分目標(biāo)化合物可能隨干擾物一同被淋洗,從而導(dǎo)致目標(biāo)物丟失。此外,實(shí)驗(yàn)向25%甲醇水溶液中分別添加0.5%、1%和2%(體積分?jǐn)?shù))的乙酸,以考察酸性條件對(duì)淋洗效果的影響。結(jié)果表明,8種目標(biāo)分析物的峰面積在不同酸性環(huán)境淋洗條件下無(wú)明顯差異。因此,實(shí)驗(yàn)選擇25%甲醇水溶液作為淋洗溶劑。

2.3.4洗脫條件

向尿液中加入5 μg/L目標(biāo)分析物,以甲醇、乙腈、甲醇-乙腈(1∶1, v/v)、甲醇-乙酸乙酯(1∶1, v/v)、乙腈-乙酸乙酯(1∶1, v/v)和丙酮作為洗脫溶劑,通過(guò)回收率比較6種洗脫溶劑洗脫效果。如圖2所示,以甲醇和甲醇-乙腈(1∶1, v/v)作為洗脫溶劑時(shí),8種目標(biāo)分析物的回收率結(jié)果差異不明顯,但優(yōu)于其他4種洗脫溶劑。為獲得較優(yōu)洗脫溶劑,分別對(duì)6種洗脫條件下各目標(biāo)分析物的基質(zhì)效應(yīng)(matrix effects)進(jìn)行了初步評(píng)估。參考Li等[25]采用的單點(diǎn)濃度評(píng)估方法,分別向不同洗脫溶劑處理后的樣品基質(zhì)和純?nèi)軇┗|(zhì)中加入5 μg/L的目標(biāo)分析物,以目標(biāo)分析物在樣品基質(zhì)中的峰面積與相同目標(biāo)分析物在純?nèi)軇┲械姆迕娣e的比值評(píng)估基質(zhì)效應(yīng)。當(dāng)基質(zhì)效應(yīng)在80%～120%時(shí)為低基質(zhì)效應(yīng);基質(zhì)效應(yīng)在50%～80%或120%～150%時(shí)為中基質(zhì)效應(yīng);基質(zhì)效應(yīng)<50%或>150%時(shí)為高基質(zhì)效應(yīng)。結(jié)果如圖3,以甲醇為洗脫溶劑時(shí),所有目標(biāo)分析物均表現(xiàn)為低基質(zhì)效應(yīng)或中基質(zhì)效應(yīng);而以甲醇-乙腈(1∶1, v/v)作為洗脫劑時(shí),PNP表現(xiàn)為高基質(zhì)效應(yīng)。因此,實(shí)驗(yàn)最終選擇甲醇作為洗脫溶劑。

圖2 不同洗脫溶劑對(duì)8種目標(biāo)分析物回收率的影響(n=3)

圖3 不同洗脫溶劑對(duì)8種目標(biāo)分析物的基質(zhì)效應(yīng)(n=3)

使用2 mL甲醇分4次洗脫固相萃取柱(每次0.5 mL)。收集4次洗脫液并上機(jī)測(cè)定,以每次洗脫后目標(biāo)分析物的峰面積占4次洗脫的總面積的百分比計(jì)算洗脫效率。結(jié)果如表2所示,完成第1次洗脫時(shí),目標(biāo)分析物的洗脫效率為90.3%～98.4%;繼續(xù)進(jìn)行第2次洗脫,仍有部分目標(biāo)化合物被持續(xù)洗脫下來(lái);在完成2次洗脫后,各目標(biāo)分析物的洗脫效率已達(dá)到99%以上;此時(shí)再增加洗脫次數(shù),對(duì)洗脫效率影響并不顯著。因此,實(shí)驗(yàn)最終選擇2次洗脫(每次0.5 mL)的方式洗脫目標(biāo)化合物。

表2 不同洗脫次數(shù)下8種目標(biāo)分析物的洗脫效率

2.4 基質(zhì)效應(yīng)

樣本中存在的復(fù)雜基質(zhì)可能對(duì)目標(biāo)物的分析過(guò)程產(chǎn)生干擾,從而影響方法的準(zhǔn)確度和精密度。因此需要對(duì)方法的基質(zhì)效應(yīng)進(jìn)行評(píng)估,以確定是否需要進(jìn)行基質(zhì)補(bǔ)償或校正。采用文獻(xiàn)報(bào)道的方法[25,26],選用6個(gè)不同來(lái)源的尿液,按前處理方法進(jìn)行樣本處理后,以6個(gè)處理尿液為基質(zhì)配制6個(gè)系列的質(zhì)量濃度為0、1、2.5、5、10、25、50、100 μg/L的尿液基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液,同時(shí)配制相同濃度的系列甲醇基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液。以尿液基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率與甲醇基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率的比值來(lái)評(píng)估方法的基質(zhì)效應(yīng)?；|(zhì)效應(yīng)評(píng)估結(jié)果如圖4所示,對(duì)于PNP和cis-DCCA,有4個(gè)尿液基質(zhì)表現(xiàn)為中基質(zhì)效應(yīng),2個(gè)尿液基質(zhì)表現(xiàn)為低基質(zhì)效應(yīng);在3-PBA和2,4-D中,有3個(gè)尿液基質(zhì)表現(xiàn)為中基質(zhì)效應(yīng)和3個(gè)尿液基質(zhì)表現(xiàn)為低基質(zhì)效應(yīng)。上述結(jié)果表明在分析過(guò)程中,需要采取措施對(duì)上述目標(biāo)分析物進(jìn)行基質(zhì)校正。同位素內(nèi)標(biāo)對(duì)8種物質(zhì)的基質(zhì)校正結(jié)果見表3。當(dāng)加入同位素內(nèi)標(biāo)后,8種目標(biāo)分析物的基質(zhì)效應(yīng)為94.1%～100%,均表現(xiàn)為低基質(zhì)效應(yīng)。因此,本方法采取同位素內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量分析。

圖4 8種目標(biāo)分析物在6個(gè)不同尿液基質(zhì)中的基質(zhì)效應(yīng)

2.5 方法學(xué)評(píng)價(jià)

2.5.1線性范圍、檢出限與定量限

配制質(zhì)量濃度為0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、20、50、100 μg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液并進(jìn)樣分析,以目標(biāo)物與相應(yīng)內(nèi)標(biāo)的定量離子峰面積之比為縱坐標(biāo),樣品中目標(biāo)物的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。8種目標(biāo)物在各自的線性范圍內(nèi)相關(guān)系數(shù)(r2)均≥0.999 3。檢出限和定量限根據(jù)美國(guó)環(huán)保署(United States Environmental Protection Agency, USEPA)檢出限測(cè)定程序第2版(EPA 821-R-16-006規(guī)范文件)計(jì)算[27]。2,4-D、TCPY、PNP存在過(guò)程空白干擾,以7次過(guò)程空白的均值加3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差為檢出限,7次過(guò)程空白均值加10倍標(biāo)準(zhǔn)偏差為定量限。其余5種目標(biāo)分析物,選擇測(cè)定值較低的尿液樣本,用純水稀釋5倍制成空白尿液。向此空白尿液基質(zhì)進(jìn)行0.1 μg/L加標(biāo)(n=7),以測(cè)定值的3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差計(jì)算方法檢出限(MDL)、10倍標(biāo)準(zhǔn)偏差計(jì)算方法定量限(MQL)。8種目標(biāo)分析物的線性范圍、相關(guān)系數(shù)、MDL、MQL等數(shù)據(jù)見表3。

表3 8種目標(biāo)分析物的線性范圍、相關(guān)系數(shù)、方法檢出限、方法定量限和基質(zhì)效應(yīng)

2.5.2回收率與精密度

以6個(gè)實(shí)際尿液樣本進(jìn)行低(0.5 μg/L)、中(5 μg/L)、高(40 μg/L)3個(gè)水平的加標(biāo)回收試驗(yàn)。在同一自然日對(duì)高、低兩個(gè)濃度的混合尿液進(jìn)行6次平行測(cè)定,考察方法的日內(nèi)精密度;在不同自然日分6次對(duì)相同的混合尿液樣品進(jìn)行測(cè)定,考察方法的日間精密度。結(jié)果如表4所示,8種目標(biāo)分析物的加標(biāo)回收率為91.1%～110.5%, RSD為1.2%～9.0%,日內(nèi)精密度為2.9%～7.8%,日間精密度為6.2%～10%。

表4 8種目標(biāo)物的加標(biāo)回收率、日內(nèi)精密度和日間精密度(n=6)

2.6 實(shí)際樣品測(cè)定

利用本方法測(cè)定了214份人群尿液樣本,結(jié)果見表5。其中,除2,4,5-T未檢出外,其余7種目標(biāo)分析物均有檢出,檢出率為2.8%～99.1%。尿液中TCPY和PNP的檢出濃度較高,中位值分別為2.0 μg/L和1.8 μg/L。3-PBA、trans-DCCA處于同一污染水平,中位值分別為0.81 μg/L和0.99 μg/L。上述結(jié)果提示農(nóng)藥對(duì)人群的暴露不容忽視。

表5 人尿樣品中8種目標(biāo)物的含量

3 結(jié)論

本文利用96孔固相萃取,建立了尿中8種農(nóng)藥及農(nóng)藥代謝物的UPLC-MS/MS分析方法,系統(tǒng)評(píng)估了前處理方法、基質(zhì)效應(yīng)及方法學(xué)指標(biāo)。方法采用96孔固相萃取高通量處理樣品,處理效率高,同時(shí)兼具操作簡(jiǎn)單、定量準(zhǔn)確、檢出限低、重復(fù)性好的特點(diǎn),適用于開展人尿中多種農(nóng)藥及農(nóng)藥代謝物的快速分析測(cè)定。