基于超高效液相色譜-四極桿-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜的刺五加注射液化學(xué)成分分析

余文怡, 伍慧敏, 郭秀潔, 閆淑梅, 劉湘杰, 王竹君, 王超然1,*, 沈愛金*, 梁鑫淼

(1. 中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所, 中國科學(xué)院分離分析化學(xué)重點實驗室, 遼寧 大連 116023; 2. 中科院大化所中國醫(yī)藥城生物醫(yī)藥創(chuàng)新研究院, 江蘇 泰州 225300; 3. 江西省中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)重點實驗室, 贛江中藥創(chuàng)新中心, 江西 南昌 330000; 4. 黑龍江烏蘇里江制藥有限公司, 黑龍江 虎林 158417)

腦血管病是目前我國患病率、致殘率、病死率最高的疾病之一,嚴(yán)重威脅著人們的生命健康安全[1,2],根據(jù)《中國卒中報告2019》, 2018年中國居民腦血管病死亡率為149.49/10萬,死亡人數(shù)約157萬,占當(dāng)年總死亡人數(shù)的22.33%[3]。刺五加注射液是五加科植物刺五加Acanthopanaxsenticosus(Rupr. et Maxim.) Harms的干燥根和根莖或莖經(jīng)過提取、過濾和滅菌等工藝制得的注射液。研究表明刺五加注射液能明顯改善急性腦梗死患者的血脂水平及內(nèi)皮細胞功能,促進缺血腦組織神經(jīng)干細胞的增殖,對高血壓、腦梗死等腦血管疾病具有良好的療效[4,5]。除此之外,刺五加注射液對中樞神經(jīng)系統(tǒng)有良好的鎮(zhèn)靜作用[5],可以改善焦慮、煩躁、失眠等癥狀,臨床上常用于治療情志異常類疾病[6]和神經(jīng)系統(tǒng)疾病[7]。

中藥物質(zhì)基礎(chǔ)研究是藥效及作用機理研究的前提,目前針對刺五加藥材化學(xué)成分的研究已有較多報道[8-11],而針對刺五加注射液化學(xué)成分的研究卻十分有限,僅有Xie等[12]采用高效液相色譜-四極桿飛行時間質(zhì)譜技術(shù)(HPLC-Q-TOF-MS)從刺五加注射液中鑒定出22個化合物,黃婧等[13]采用HPLC-Q-TOF-MS從刺五加注射液中鑒定出54個苯丙素類成分。作為刺五加臨床用藥的主要形式,刺五加注射液化學(xué)成分研究對明確刺五加藥材及多種刺五加制劑的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)非常重要。

靜電場軌道阱是近年來發(fā)展起來的一種新型質(zhì)譜質(zhì)量分析器,相比于飛行時間質(zhì)譜具有掃描速度更快、分辨率更高等優(yōu)勢,尤其是與超高效液相色譜(UHPLC)結(jié)合后可大大縮短樣品分析時間,提高化學(xué)成分的鑒定效率,近年來已成為復(fù)雜樣品分析的有力工具,廣泛用于各種中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究[14]。采用超高效液相色譜-四極桿-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜聯(lián)用(UHPLC-Q/Orbitrap HRMS)技術(shù),建立刺五加注射液的快速分析方法,深入研究其化學(xué)成分,進一步明確其物質(zhì)基礎(chǔ),對于深入闡明刺五加及其相關(guān)制劑的藥效作用機理具有重要的意義。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

Vanquish UHPLC超高效液相色譜儀(Thermo Scientific,美國),配有自動進樣器、二元梯度泵、柱溫箱和二極管陣列檢測器;Q Exactive Plus超高分辨率四極桿-靜電場軌道阱質(zhì)譜儀(Thermo Scientific,美國),配有加熱電噴霧離子(HESI)源、Xcalibur化學(xué)工作站和Compound Discoverer 3.2數(shù)據(jù)處理軟件;Milli-Q超純水制備儀(Milli-pore,美國); XSR105 DualRange十萬分之一電子天平(METTLER TOLEDO,瑞士); SORVALL ST8臺式離心機(Thermo Scientific,美國); KQ5200DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

刺五加提取液(批號21080201-01)和注射液(批號202008012)由黑龍江烏蘇里江制藥有限公司提供,提取液為藥材經(jīng)過純水提取、減壓濃縮、醇沉等步驟制得,提取液再經(jīng)過濾、稀釋后制得注射液,制備過程中未添加其他輔料。標(biāo)準(zhǔn)品信息見表1。

1.2 溶液制備

對照品溶液:稱定各對照品適量,分別用70%(v/v)甲醇水溶液溶解,得到對照品儲備液,置于4 ℃防爆冰箱中保存,質(zhì)量濃度為0.2～0.7 mg/mL。取對照品儲備液適量,配制成混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,混合標(biāo)準(zhǔn)溶液中各化合物濃度見表1。

表1 對照品信息及在混合標(biāo)準(zhǔn)溶液中的質(zhì)量濃度

供試品溶液:取刺五加注射液100 μL,加入900 μL純水稀釋10倍后離心(8 000 r/min, 10 min),取上清液,即得供試品溶液。

1.3 儀器條件

色譜條件:Waters ACQUITY UPLC BEH Shield RP18色譜柱(100 mm×2.1 mm, 1.7 μm);流動相A為0.1%甲酸水溶液,流動相B為乙腈;梯度洗脫程序:0～2 min, 0%B; 2～4 min, 0%B～5%B; 4～15 min, 5%B～20%B; 15～15.1 min, 20%B～90%B; 15.1～17 min, 90%B。流速:0.4 mL/min;柱溫:30 ℃;進樣量:2 μL;檢測波長:280 nm。

質(zhì)譜條件:HESI源,正、負離子模式下分別進行檢測;屏蔽氣流速:45 arb;輔助氣流速:10 arb;正離子模式噴霧電壓:3.5 kV,負離子模式噴霧電壓:3.0 kV;離子傳輸管溫度:380 ℃; S-lens RF水平: 50;干燥氣溫度:400 ℃;數(shù)據(jù)采集模式:一級質(zhì)譜全掃描加數(shù)據(jù)依賴的二級質(zhì)譜掃描(Full MS/dd-MS2);質(zhì)量掃描范圍:100～1 300;分辨率:70 000(Full MS), 17 500(MS2);碰撞能(stepped NCE): 10、30和50; TopN: 3;動態(tài)排除:2 s。

發(fā)揮水電、水務(wù)的引領(lǐng)帶動作用，以項目實施為載體，重點幫扶陜西、河南、湖南、云南等地加快水利投融資平臺建設(shè)，吸引社會資本廣泛參與水電、城市供水、污水處理、水生態(tài)城市開發(fā)建設(shè)等，輻射帶動社會投資超過200億元。此外，不斷優(yōu)化投融資結(jié)構(gòu)，開展水利融資租賃試點工作，獲得融資租賃5年期資金3億元，綜合成本比基準(zhǔn)利率下浮13%。落實中央關(guān)于援疆工作部署，新疆在建水電工程新增投資12.6億元，新增裝機27.9萬kW。重點援疆項目阿爾塔什水利樞紐等重點工程進展順利。準(zhǔn)東供水工程發(fā)揮效益，五一水庫樞紐工程完成投資4.09億元，拉依蘇石化工業(yè)區(qū)供水管網(wǎng)工程建設(shè)全部完工。

1.4 數(shù)據(jù)處理

原始數(shù)據(jù)采用Xcalibur軟件和Compound Discoverer 3.2(CD)軟件進行處理,扣除背景空白和提取色譜峰后,結(jié)合文獻報道的刺五加藥材及刺五加注射液的化學(xué)成分[9,13,15-17],首先進行一級精確相對分子質(zhì)量的匹配,然后采用CD軟件在mzCloud和mzVault數(shù)據(jù)庫中進行二級質(zhì)譜圖匹配,對于匹配分?jǐn)?shù)≥75的成分,人工確認其二級譜圖的匹配情況,對于沒有匹配分?jǐn)?shù)的成分,結(jié)合文獻報道的碎片和裂解規(guī)律進行鑒定,最后采用標(biāo)準(zhǔn)品對部分化合物進行確認。

2 結(jié)果與討論

采用UHPLC-Q/Orbitrap HRMS分析刺五加提取液和注射液,刺五加注射液的紫外色譜圖和正、負離子模式總離子流圖見圖1,根據(jù)1.4節(jié)的數(shù)據(jù)處理方法從中鑒定出102個化學(xué)成分,包括62個苯丙素類、23個有機酸類、7個核苷類、1個環(huán)烯醚萜類和9個其他類成分,其中有65個成分為從刺五加注射液中首次鑒定得到,包括27個苯丙素類、22個有機酸類、7個核苷類、1個環(huán)烯醚萜類和8個其他類,并系統(tǒng)歸納總結(jié)了各類型化合物的裂解規(guī)律。

圖1 刺五加注射液的紫外色譜圖和總離子流色譜圖

2.1 刺五加注射液中苯丙素類成分的鑒定

苯丙素類化合物是指一類以C6-C3為基本單元的化合物。在植物體內(nèi),這種單元可獨立形成化合物,如苯丙醇類化合物、苯丙醛類化合物和苯丙酸類化合物,也可以2個、3個甚至多個單元聚合形成某一類化合物,如木脂素類化合物,還可以形成多種氧化程度不同的衍生物,如香豆素類化合物。刺五加注射液中包含眾多不同結(jié)構(gòu)類型的苯丙素類化合物。

2.1.1苯丙酸類成分的鑒定

苯丙酸類成分在植物中常與不同的醇、氨基酸、糖、有機酸結(jié)合形成糖苷類或酯類化合物,且易發(fā)生糖苷鍵和酯鍵的斷裂,丟失葡萄糖(-162 Da)、咖啡?；?-162 Da)、阿魏?；?-176 Da)、香豆?；?-146 Da)等中性基團,或者丟失其他基團產(chǎn)生咖啡酸(m/z179)、阿魏酸(m/z193)、香豆酸(m/z163)等碎片離子。刺五加注射液中有很多奎寧酸與咖啡?；?、阿魏?；捅奖；Y(jié)合而成的異構(gòu)體,本實驗通過標(biāo)準(zhǔn)品研究了這類異構(gòu)體的裂解規(guī)律:隱綠原酸(cryptochlorogenic acid,化合物70)相比于新綠原酸(neochlorogenic acid,化合物37)和綠原酸(chlorogenic acid,化合物73)具有更高豐度的m/z173碎片,而新綠原酸相比于綠原酸具有更高豐度的m/z179碎片,這一現(xiàn)象與文獻[18,19]報道一致,圖2以綠原酸為例描述了這類化合物的裂解途徑。值得一提的是,綠原酸和隱綠原酸的出峰順序與文獻報道略有差異,可能是因為這兩個成分的保留時間比較接近,在不同類型反相色譜柱上的選擇性有差異導(dǎo)致的。利用以上碎片豐度差異以及化合物在BEH Shield RP18色譜柱上的出峰順序?qū)Ρ奖；鼘幩犷惢衔?9、10、15、16、19)和阿魏?；鼘幩犷惢衔?31、50、53)進行了鑒定。

圖2 咖啡?？鼘幩犷惢衔锏亩壻|(zhì)譜圖和綠原酸的質(zhì)譜裂解途徑

除上述已報道的成分外,從刺五加注射液中首次鑒定了10個苯丙酸類成分,具體鑒定過程如下:化合物30、52、59、67、71具有相同的相對分子質(zhì)量和二級碎片,分子式為C10H10O4,主要碎片m/z177和m/z163為丟失H2O和CH3OH產(chǎn)生,經(jīng)CD軟件匹配二級譜圖將其鑒定為3-羥基-5-甲氧基-肉桂酸(3-hydroxy-5-methoxy-cinnamic acid)及其在不同取代位置的異構(gòu)體;化合物82和85互為同分異構(gòu)體,其質(zhì)量數(shù)和二級碎片與刺五加果實中報道的(2E)-3-[4-({(1S,2S)-1-[4-(β-D-吡喃葡萄糖基氧基)-3-甲氧基苯基]-1,3-二羥基-2-丙烯基}氧基)-3-甲氧基苯基]丙烯酸((2E)-3-[4-({(1S,2S)-1-[4-(β-D-glucopyranosyloxy)-3-methoxyphenyl]-1,3-dihydroxy-2-propanyl}oxy)-3-methoxyphenyl] acrylic acid)一致[17],該化合物在刺五加根和根莖中未見報道;化合物84的分子式為C32H36O17,碎片m/z529為[M-Glu]-,碎片m/z353和m/z191為繼續(xù)丟失阿魏酰基和咖啡酰基產(chǎn)生,結(jié)合文獻報道將其鑒定為阿魏?？Х弱？鼘幩崞咸烟擒?feruloyl caffeicyl quinic acid glucoside)[9];化合物41在正離子模式下有碎片m/z131和m/z103,為丟失CH3OH和CO產(chǎn)生,經(jīng)CD軟件匹配二級譜圖將其鑒定為肉桂酸甲酯(methyl cinnamate);化合物64先丟失H2O產(chǎn)生m/z147,再丟失CO和·CH3產(chǎn)生m/z119和m/z103,經(jīng)CD軟件匹配二級譜圖將其鑒定為D(+)-苯乳酸(D(+)-phenyllactic acid)。

2.1.2苯丙醇類成分的鑒定

從刺五加注射液中鑒定到3個苯丙醇類成分,分別為紫丁香苷葡萄糖苷(syringinoside,化合物39)、松柏苷(coniferin,化合物42)和紫丁香苷(syringin,化合物48),其中紫丁香苷葡萄糖苷和松柏苷為首次從刺五加注射液中鑒定得到,其在質(zhì)譜中的裂解從糖苷鍵的斷裂開始,然后發(fā)生H2O、·CH3等中性丟失,松柏苷的裂解途徑見圖3。

圖3 松柏苷的二級質(zhì)譜圖和質(zhì)譜裂解途徑

2.1.3苯丙醛類成分的鑒定

從刺五加注射液中鑒定出1個苯丙醛類成分芥子醛(sinapaldehyde,化合物88),該化合物在正離子模式下響應(yīng)較好,在負離子模式下響應(yīng)較弱,質(zhì)譜裂解以中性丟失CO、CH3OH、·CH3等為主,經(jīng)CD軟件匹配二級譜圖將其鑒定為芥子醛,其裂解途徑見圖4,該化合物為首次從刺五加中鑒定得到。

圖4 芥子醛的二級質(zhì)譜圖和質(zhì)譜裂解途徑

2.1.4香豆素類成分的鑒定

從刺五加注射液中鑒定到9個香豆素類成分,均為簡單香豆素及其與葡萄糖、鼠李糖連接形成的糖苷類化合物。化合物55、62、66、90為同分異構(gòu)體,正、負離子模式加合峰和二級碎片均相同,負離子模式下碎片離子m/z206和m/z191為分子離子峰連續(xù)丟失·CH3產(chǎn)生,繼續(xù)連續(xù)丟失CO產(chǎn)生m/z163、m/z135和m/z107,化合物90通過標(biāo)準(zhǔn)品鑒定為異嗪皮啶(isofraxidin),其裂解途徑見圖5,其余3個化合物鑒定為秦皮素定(fraxidin)或白蠟樹精(fraxinol)或網(wǎng)狀菌醇(reticulol),為異嗪皮啶不同取代基位置差異的異構(gòu)體,這3個異構(gòu)體為首次從刺五加注射液中鑒定得到。

化合物56和化合物63根據(jù)其正、負離子模式加合峰推測其分子式分別為C17H20O10和C23H30O14,二級碎片m/z221分別為[M-Glu]-和[M-Glu-Rha]-,其余碎片離子與化合物90一致,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品對比將化合物56鑒定為刺五加苷B1(eleutheroside B1),根據(jù)文獻[13]推測化合物63為刺五加苷B2(eleutheroside B2),其二級質(zhì)譜圖見圖5?；衔?9與化合物56為同分異構(gòu)體,其丟失葡萄糖之后的碎片與秦皮素定和異嗪皮啶等化合物相同,將其鑒定為秦皮素定葡萄糖苷(fraxidin-O-glucoside)。

圖5 異嗪皮啶、刺五加苷 B1、刺五加苷 B2的二級質(zhì)譜圖和異嗪皮啶的質(zhì)譜裂解途徑

化合物46和57通過一級相對分子質(zhì)量匹配分別得到化合物東莨菪素(scopoletin)和秦皮素(fraxetin),二者相差一個羥基,其質(zhì)譜裂解主要為丟失·CH3、H2O、CO、CH3OH等中性基團,符合香豆素類化合物的一般裂解規(guī)律,此外經(jīng)CD軟件匹配二級譜圖發(fā)現(xiàn),這兩個化合物的二級譜圖與數(shù)據(jù)庫中標(biāo)準(zhǔn)品的譜圖匹配良好,因此分別將化合物46和57鑒定為東莨菪素和秦皮素,二者均為首次從刺五加注射液中鑒定得到,其裂解途徑見圖6。

圖6 東莨菪素和秦皮素的二級質(zhì)譜圖和質(zhì)譜裂解途徑

2.1.5木脂素類成分的鑒定

刺五加中的木脂素通常以單糖苷或雙糖苷的形式存在[20-22],一般具有相對較高的相對分子質(zhì)量(>500)。從刺五加注射液中鑒定出16個木脂素類成分,包括6種結(jié)構(gòu)類型:雙環(huán)氧木脂素類(83、87、91、100、102)、氧新木脂素類(76、78、79)、苯駢呋喃類(77、89、95)、單環(huán)氧木脂素類(80、96、97)、芳基萘類(75)和二芳基丁烷類(93)。此類化合物的二級質(zhì)譜通常會先丟失糖基產(chǎn)生苷元的碎片離子,然后根據(jù)苷元上取代基的不同發(fā)生·CH3、CH2O、CH3OH、·OCH3等中性丟失,進一步碰撞還會產(chǎn)生苷元中醚鍵或呋喃環(huán)等結(jié)構(gòu)的斷裂,生成更小的二級碎片。如圖7阿拉克苷(salvadoraside)的裂解途徑,準(zhǔn)分子離子峰m/z789連續(xù)丟失糖基生成m/z581和m/z419,碎片m/z419會丟失CH2O或發(fā)生四氫呋喃環(huán)裂解生成m/z389、m/z222等碎片,該化合物此前只在刺五加莖中有報道[23],本工作為首次從刺五加注射液中鑒定得到。

圖7 Salvadoraside的二級質(zhì)譜圖和質(zhì)譜裂解途徑

根據(jù)文獻報道,刺五加中的苯丙素類成分具有保護神經(jīng)元、改善植物神經(jīng)紊亂、調(diào)節(jié)免疫力、緩解焦慮等多種藥理活性[24-28]。刺五加苷B、刺五加苷E和異嗪皮啶是刺五加中的主要苯丙素類成分,這3個成分在μmol/L水平對β淀粉樣蛋白誘導(dǎo)的軸突和樹突萎縮具有明顯的保護作用,而軸突和樹突萎縮是導(dǎo)致阿爾茨海默癥記憶缺失的直接原因[24]。此外,刺五加苷B還具有心血管保護作用和抗腫瘤作用,刺五加苷E還具有免疫調(diào)節(jié)作用、抗氧化作用和降血糖作用等[28]。本研究從刺五加注射液中鑒定出包含上述3個主要成分在內(nèi)的62個苯丙素類成分,其中27個為首次鑒定到,這些成分為刺五加注射液進一步的藥理研究奠定了基礎(chǔ)。

2.2 刺五加注射液中有機酸類成分的鑒定

除了苯丙素類成分之外,刺五加注射液中還包含大量小分子有機酸類成分,如水楊酸(salicylic acid)、原兒茶酸(protocatechuic acid)、壬二酸(azelaic acid)等,這些化合物多數(shù)為苯環(huán)或長鏈烷烴連接羥基或羧基而成,一般在負離子模式下響應(yīng)較好[29],二級質(zhì)譜以丟失H2O、CO、CO2、HCOOH等小分子為主,從刺五加注射液中鑒定出23個有機酸類成分。

綜上,刺五加注射液的化學(xué)成分鑒定結(jié)果見表2。

2.3 刺五加注射液中黃酮類成分測定

鑒于刺五加注射液現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)WS3-B-3425-98[30]以紫外-可見分光光度法測定總黃酮的含量作為主要質(zhì)量控制方法,但上述質(zhì)譜鑒定發(fā)現(xiàn)主成分均非黃酮類成分,因此我們對刺五加注射液的黃酮類成分進行了探索?？紤]到?jīng)]有文獻報道刺五加注射液中的黃酮類成分,我們參考刺五加藥材化學(xué)成分的研究工作[8],在刺五加注射液中提取相應(yīng)的黃酮類成分的提取離子流圖(EIC),除葛根素和3′-甲氧基葛根素(見圖8)可以提到響應(yīng)很低的色譜峰之外(用標(biāo)準(zhǔn)品對這兩個成分進行確認,發(fā)現(xiàn)保留時間基本一致,但是由于這兩個成分在刺五加注射液中的含量非常低,質(zhì)譜響應(yīng)在104水平,即使采用target模式也無法采集到有效的二級譜圖,因此無法對其碎片進行進一步確認),其他黃酮類成分(包括蘆丁、金絲桃苷、山柰酚、槲皮苷、槲皮素、金合歡素、大豆苷、3′-甲氧基大豆苷、4′-甲氧基葛根素)提取不到色譜峰。我們推測是由于黃酮類成分整體極性相對較弱,注射液采用水提工藝無法有效提取。此外,文獻[31]報道蘆丁等黃酮類成分主要存在于刺五加葉中,因此也可能是文獻所用的刺五加藥材中混入了刺五加葉。

圖8 葛根素和3′-甲氧基葛根素在(a)標(biāo)準(zhǔn)溶液和(b)刺五加注射液中的提取離子色譜圖

3 結(jié)論

本研究通過建立UHPLC-Q/Orbitrap HRMS分析方法,從刺五加注射液中共鑒定出102個化合物,其中包含62個苯丙素類成分,為刺五加注射液臨床治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病和心血管疾病提供了一定的化學(xué)成分依據(jù)。除此之外,本研究首次鑒定了27個苯丙素類成分、22個有機酸類成分、7個核苷類成分、1個環(huán)烯醚萜類成分和8個其他類成分,豐富了刺五加注射液的物質(zhì)組成信息,這些新成分的發(fā)現(xiàn)為刺五加注射液作用機制的闡明奠定了科學(xué)數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。與此同時,我們針對黃酮類成分進行了探索,發(fā)現(xiàn)黃酮類成分并非刺五加注射液的主要成分,現(xiàn)有質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)通過測定總黃酮的含量可能并不能對注射液進行有效的質(zhì)量控制。除上述化學(xué)成分類型之外,有研究報道刺五加中還含有三萜皂苷類成分,該類成分與人參皂苷類成分藥理活性較為相似,與刺五加對心腦血管的治療作用直接相關(guān)[20],然而在本次實驗中從刺五加注射液中未鑒定到三萜皂苷類成分,在對刺五加提取液進行鑒定時也未發(fā)現(xiàn)三萜皂苷類成分,推測可能是由于三萜皂苷類成分極性較弱,在水中溶解度較差導(dǎo)致的,因此現(xiàn)有刺五加注射液的制備方法可能還存在進一步改進的空間。