巨噬細胞AMPKα1敲除對非酒精性脂肪肝小鼠模型的影響

王順意陳思爍于天力林彩霞王麗京鄭凌云

(廣東藥科大學,生命科學與生物制藥學院,廣州 510006)

非酒精性脂肪肝(non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD)已經(jīng)成為威脅全球人類健康的主要疾病之一,其全球患病率約為25%[1]。NAFLD是指非飲酒條件下,患者超過5%的肝細胞中存在脂肪變性[2-3]。作為一種進行性疾病,NAFLD可從非酒精性肝脂肪變性(NAFL)演變?yōu)榉蔷凭愿窝?NASH),進一步發(fā)展為肝纖維化,最終導致肝硬化或肝癌[4-5]。在NAFLD患者肝中,M1型巨噬細胞為炎癥因子的主要來源,激活將促進炎癥的發(fā)展[6-7]。AMP依賴的蛋白激酶(AMPK)是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶,由α(α1/2)催化亞基,β(β1/2)和γ(γ1/2/3)兩個調節(jié)亞基組成,是細胞內調節(jié)能量平衡和對代謝應激反應的能量傳感器[8]。AMPK參與巨噬細胞線粒體脂質代謝進而調控其炎癥反應[9-10],AMPK缺失將促進巨噬細胞M1型極化[11]。但巨噬細胞特異性敲除AMPKα1對NAFLD的作用尚未見報道。本研究利用巨噬細胞AMPKα1敲除小鼠構建NAFLD模型,檢測血糖及血清TG變化,觀察肝病理改變及脂滴堆積程度,并利用GC/MS技術[12]探究血清脂質組學改變。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

AMPKα1flox/flox(AMPKfl/fl)小鼠及l(fā)yz2-cre小鼠為SPF級的C57BL/6J背景小鼠,雄性,各10只,4周齡,體重14～15 g,購自美國Jackson lab,購買動物衛(wèi)生證書編號為[2011A00085]。于廣東省實驗動物監(jiān)測所進行胚胎凈化,生產(chǎn)許可證號為[SCXK(粵)2018-0044]。飼養(yǎng)于廣東藥科大學實驗動物中心無特殊病原體SPF級環(huán)境,飼養(yǎng)許可證號為[SYXK(粵)2017-0125],環(huán)境溫度為22～26℃,環(huán)境濕度為50%～70%,壓差25 Pa,潔凈度10 000級,氨濃度15 mg/m3,照明度150～300 Lux,定時循環(huán)照明,8:00～20:00為光照時間,夜間20:00至次日8:00為無照明時間。動物飼養(yǎng)設施配備了獨立通風系統(tǒng)(IVC),換氣次數(shù)為每小時10次。小鼠日常維持飼料采購于廣東省醫(yī)學實驗動物中心。本研究所有動物實驗均通過廣東藥科大學動物倫理委員會審查批準許可(gdpulacspf2021006),實驗動物飼養(yǎng)及實驗過程均按照實驗動物使用的3R原則給予人道關懷。

1.2 主要試劑與儀器

GAPDH抗體(CST,2118S);AMPKα抗體(CST,2795S);Oil red(Sigma,O0625);蘇木精&伊紅染液(南昌雨露實驗器材有限公司);油紅O染色液(Sigma,O0625);97% BSTFA+1% TMCS(上海阿拉丁生化科技股份有限公司,B118473);吡啶(上海阿拉丁生化科技股份有限公司,P111512);甲氧胺(百靈威科技有限公司,533032);色譜級甲醇(Sigma,34860);十九烷酸(Sigma,N5252);高脂高糖高膽固醇(HFFC)飼料(D09100310)購自北京博奧派克生物科技有限公司。ImageQuant LAS4000化學發(fā)光成像儀(General Electric,0682345);普通光學顯微鏡(Olympus,BX43);氣相色譜與質譜聯(lián)用儀(Agilent GC/MS,7890B)。

1.3 實驗方法

1.3.1 AMPK△Mφ小鼠的基因型鑒定

以cre-loxp技術,將AMPKfl/fl小鼠及l(fā)yz2-cre小鼠雜交獲得子代,提取組織DNA以PCR的方法鑒定小鼠基因型;提取小鼠骨髓來源原代巨噬細胞(BMDM)蛋白以Western blot的方法檢測AMPKα表達情況鑒定敲除結果,獲得巨噬細胞AMPKα1特異性敲除的AMPK△Mφ小鼠。

1.3.2 NAFLD模型

隨機選取4周齡健康的AMPKfl/fl和AMPK△Mφ小鼠給予HFFC飲食12周,分組為AMPKfl/fl對照組、AMPK△Mφ對 照 組、AMPKfl/flHFFC組和AMPK△MφHFFC組。

1.3.3 口服葡萄糖耐量實驗(OGTT)

小鼠空腹12 h后測定0 min時血糖濃度,將100 μg/mL的葡萄糖溶液以20 μL/g劑量灌胃,測定15、30、60、120 min的血糖濃度。

1.3.4 HE染色

肝組織脫水并石蠟包埋后制作石蠟切片,于65℃烘箱30 min,二甲苯脫蠟,梯度乙醇復水,蘇木素染色1 min 30 s,流水返藍30 min,伊紅染色10 s。

1.3.5 油紅O染色

肝組織蔗糖脫水后制作冰凍切片,于60%異丙醇水溶液潤洗5 min,置于油紅工作液中避光染色30 min,于60%異丙醇水溶液中分化,蘇木素染色1 min,流水返藍30 min。

1.3.6 GC-MS非靶向代謝組學

(1)樣品制備:將小鼠麻醉后以毛細采血管對小鼠眼眶靜脈采血,室溫靜置5 min,4℃ 5000 r/min離心15 min,取上層血清置于-80℃待用。取小鼠血清50 μL,加入10 μL的1 mg/mL的十九烷酸甲醇溶液,加入250 μL萃取溶液(水v:甲醇v:氯仿v=2∶5∶2),混勻后4℃靜置20 min,13 300 r/min離心15 min,取200 μL上清于新的1.5mL EP管中,真空干燥,加入80 μL甲氧胺吡啶(15mg/mL),37℃ 孵育90 min,加入80 μL的含1% TMCS的BSTFA溶液,70℃孵育60 min,樣品轉移至微量反應瓶中,上機。

(2)氣相色譜-質譜條件:色譜條件:Agilent HP-5MS石英毛細管柱,進樣體積為1 μL,模式為不分流進樣,載氣為He(1 mL/min),進樣口260℃,傳輸線240℃,程序為:初始60℃(1 min),8℃/min至100℃(保持5 min),15℃/min至170℃(保持5 min),10℃/min至210℃(保持5 min),15℃/min升溫至350℃(保持5 min),運行條件為350℃,7 min。質譜條件:離子源(230℃),四級桿(150℃),離子化方式為EI,電子轟擊能量為70 eV,離子掃描模式為全掃描模式,溶劑延遲為12 min。

1.4 統(tǒng)計學方法

本研究中病理圖像數(shù)據(jù)用Image pro plus 6.0圖像分析軟件進行統(tǒng)計,實驗數(shù)據(jù)主要用Graphpad prism 9.0進行分析及可視化。GC-MS結果均用Agilent Masshunter Qualitative Analysis B.07.00定性軟件和NIST 14.L數(shù)據(jù)庫對混標進行定性分析得到化合物信息,用Agilent Masshunter定量分析B.07.01根據(jù)混標化合物表對化合物定量分析,結果用Simca Version 14.1.0.2047進行PCA分析獲得VIP＞1及P＜0.05的化合物,KEGG在線數(shù)據(jù)庫比對獲得KEGG ID,在Metaboanalyst 5.0在線進行富集分析及通路分析。P＜0.05為具有統(tǒng)計學差異。

2 結果

2.1 AMPK△Mφ小鼠基因型鑒定

對小鼠腳趾組織抽提DNA后,以PCR的方法鑒定AMPK△Mφ小鼠基因型,PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳,根據(jù)電泳結果PCR擴增產(chǎn)物長度判斷基因型。

如圖1A所示,對比DL1000 DNA Marker條帶,Lyz2-cre條帶為700 bp,野生型條帶為350 bp。AMPKα1flox/flox條帶為450 bp,野生型條帶為334 bp。如圖1B所示,與AMPKfl/fl對照組小鼠相比,AMPK△Mφ小鼠敲除巨噬細胞AMPKα1后,巨噬細胞AMPKα不表達,說明巨噬細胞特異性敲除AMPKα1的AMPK△Mφ小鼠構建成功。

圖1 小鼠基因型鑒定結果Figure 1 The results of mouse genotype identification

2.2 小鼠口服葡萄糖耐量(OGTT)檢測

給予AMPKfl/fl小鼠及AMPK△Mφ小鼠高脂高膽固醇高糖飲食(HFFC)12周后進行口服葡萄糖耐量檢測。如圖2所示,饑餓12 h后AMPKfl/fl小鼠組空腹血糖(9.33±0.97)mmol/L,AMPK△Mφ組小鼠組(7.46±1.34)mmol/L,兩者無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。兩種小鼠血糖在灌胃葡萄糖溶液后迅速升高,15 min時達到峰值,隨后逐漸下降,在120 min時基本恢復空腹時血糖水平,兩組小鼠血糖變化規(guī)律基本一致。15 min時AMPKfl/fl組小鼠血糖(17.5±3.5)mmol/L,AMPK△Mφ組小鼠血糖(22.5±1.9)mmol/L,兩者有顯著差異(P＜0.05),提示巨噬細胞特異性敲除AMPKα1在NAFLD誘導后出現(xiàn)糖耐量異常。

圖2 巨噬細胞AMPK敲除對HFFC飲食小鼠口服葡萄糖耐量的影響(n=5)Figure 2 Effects of AMPK knockout in macrophages on oral glucose tolerance(OGTT)in HFFC-fed mice

2.3 血清甘油三酯(TG)檢測

為探究巨噬細胞特異性敲除AMPK對HFFC飲食下小鼠體內脂質代謝的變化,我們檢測小鼠血清甘油三酯(TG)水平,如圖3所示,與對照組AMPKfl/fl組小鼠相比,AMPK△Mφ組小鼠血清甘油三酯水平顯著提高(P＜0.05)。

圖3 巨噬細胞AMPK敲除對HFFC飲食小鼠血清甘油三酯水平(n=4)Figure 3 Serum triglyceride levels in macrophage AMPK knockout HFFC diet mice

2.4 HFFC飲食小鼠肝組織病理學觀察

如圖4所示,小鼠肝HE染色可以發(fā)現(xiàn),AMPKfl/fl組小鼠肝出現(xiàn)輕微的小空泡樣變性,但肝基本結構正常,小葉結構完整。AMPK△Mφ組小鼠肝基本結構不清晰,肝小葉結構紊亂,肝出現(xiàn)嚴重的彌漫性空泡樣變性,空泡增大,部分肝索結構消失,肝細胞細胞核偏移至細胞邊緣,肝細胞大小不均一,部分肝細胞體積膨大,核膜邊界不清晰。油紅染色結果顯示,AMPKfl/fl組小鼠肝細胞中堆積的紅色脂滴數(shù)量少、體積小,與對照組AMPKfl/fl組小鼠相比,AMPK△Mφ組小鼠肝細胞內紅色脂滴數(shù)量明顯增多(P＜0.01),體積變大,顏色較為鮮艷,說明AMPK△Mφ組小鼠肝細胞脂質沉積多于AMPKfl/fl組小鼠。

圖4 巨噬細胞敲除AMPK小鼠肝病理結果(n=3)Figure 4 Pathological results of liver in macrophage knockout AMPK mice

2.5 NAFLD小鼠血清代謝組學分析

基于GC-MS對樣品進行分析,將混標原始數(shù)據(jù)導入Agilent Masshunter Qualitative Analysis B.07.00定性軟件,獲得249個峰信號化合物,如圖5總TIC結果,各峰在保留時間上可見有良好的重現(xiàn)性,各組代謝輪廓存在一定差異。

圖5 小鼠血清GC-MS總離子流圖(TICs)(n=5)Figure 5 Mouse serum GC-MS total ion current map (TICs)

如圖6A所示,各組小鼠血清代謝物在PCA圖上能較好的分離,并且組內可以很好的聚合起來,R2X[2]=0.302。如圖6B所示,對PCA模型進行Hotelling’sT2檢驗所有樣本檢驗值均明顯低于T2(95%),PCA模型擬合度較高?；赑CA模型建立有監(jiān)督的PLS-DA模型及HFFC組兩組間OPLS-DA模型對249個差異化合物進行分析。如圖6C所示,PLS-DA各組之間可以很好的分離開來,R2X[2]=0.305。將PLS-DA結果進行200次的置換檢驗,圖6D可見,Q2與Y軸交點低于0,PLS-DA模型具有較好的擬合度,模型可靠性及預測性強。將PLSDA模型的AMHF組(AMPKfl/fl+ HFFC組)及ALHF組(AMPK△Mφ+ HFFC組)進行OPLS-DA分析結果顯示(圖6E),R2X0[1]=0.235,兩組可以很好的分離,組內聚合度較高,OPLS-DA模型進行200次置換檢驗結果顯示(圖6F),Q2與Y軸交點明顯低于0,說明模型可靠。

圖6 小鼠肝組織代謝輪廓分析Figure 6 Metabolic profile analysis of mouse liver tissue

如表1所示,以OPLS-DA模型進行VIP預測差異化合物,得到VIP＞1共15個化合物。其中P＜0.05的差異化合物中,(R)-3-羥基丁酸、對辛弗林、乙烯發(fā)生上調(FC＞0),丙酸、N,N-二乙基甘氨酸、D-乳酸、羥基乙酸、十三烷、9-十六碳烯酸發(fā)生下調(FC＜0)。

表1 HFFC飲食下AMPKfl/fl組及AMPK△Mφ組小鼠血清差異代謝物Table 1 Differential metabolites in serum of mice in AMPKfl/flgroup and AMPK△Mφgroup under HFFC diet

進一步對篩選化合物進行富集分析(圖7A)這些差異化合物的相關代謝通路主要包括半乳糖代謝、氨基糖和核苷酸糖代謝、酮體的合成和降解、丁酸代謝、果糖和甘露糖代謝、丙酮酸代謝及丙酸代謝。對差異化合物進行基因-化合物網(wǎng)絡分析,如圖7B所示,包括ACSL1、GUSB、ABHD6、DECR1、SLC16A1、GCG、CAT、LDHD。在genecards在線綜合數(shù)據(jù)庫及NCBI gene數(shù)據(jù)庫查詢可以發(fā)現(xiàn),ACSL1編碼長鏈脂肪酸輔酶A連接酶的同工酶,在脂質生物合成及脂肪酸代謝中發(fā)揮關鍵作用,相關途徑包括脂肪酸β-氧化和PPARα調節(jié)脂質代謝。GUSB編碼葡萄糖醛酸酶β,在葡糖苷酸分解代謝中起作用。ABHD6啟用?；视椭久富钚?參與?；视头纸獯x過程。DECR1編碼蛋白參與不飽和脂肪烯醇輔酶A酯的β-氧化。SLC16A1編碼一種單羧酸鹽轉運蛋白,相關代謝途徑包括丙酮酸代謝及TCA循環(huán)反應,在高脂飲食中影響營養(yǎng)吸收、白色脂肪及體重增加,同時也對血糖穩(wěn)態(tài)產(chǎn)生影響。GCG編碼胰高血糖素的前體蛋白,胰高血糖素在葡萄糖代謝中起重要作用,通過增加糖異生和減少糖酵解來調節(jié)血糖。CAT編碼過氧化氫酶,是機體抵御氧化應激的關鍵抗氧化酶,保護細胞免受過氧化氫的毒性作用,其相關代謝途徑包括嘌呤代謝及DNA損傷反應。LDHD編碼乳酸脫氫酶D,相關代謝途徑為乳酸分解代謝,位于線粒體中。

圖7 差異代謝物通路富集分析及基因-化合物通路分析Figure 7 Differential metabolite pathway enrichment analysis and gene-compound pathway analysis

3 討論

HFFC飲食誘導的NAFLD模型中,巨噬細胞AMPKα1敲除促進肝脂質沉積。OGTT結果顯示巨噬細胞AMPKα1敲除小鼠糖耐量受損,且血清甘油三酯(TG)水平上調,提示巨噬細胞AMPKα1敲除可加重NAFLD引起的小鼠糖脂代謝異常,推測可能由于肝細胞損傷加重,AMPKα1敲除的巨噬細胞向M1極化而產(chǎn)生促炎細胞因子,持續(xù)炎癥刺激導致肝細胞胰島素抵抗。組織學檢測結果進一步證實,巨噬細胞AMPKα1敲除促使肝細胞中脂滴增多,肝脂肪變性加重,考慮到肝脂肪變性可引起全身糖脂代謝異常,在小鼠模型的血清非靶向脂質組學研究中,對篩選出的15個化合物進行富集分析,可以發(fā)現(xiàn)與AMPKfl/fl小鼠相比,巨噬細胞AMPKα1敲除小鼠血清中丙酸及乳酸下調。有報道指出,在飲食中添加丙酸可以降低肝和血中的脂肪酸含量[13],據(jù)此推測NAFLD模型中巨噬細胞AMPK敲除小鼠血清丙酸及乳酸下調可能與肝脂肪變性加重有關。但血清中丙酸含量與炎癥之間的具體機制未見報道,我們還尚不明確。

綜上所述,我們初步證實,巨噬細胞AMPKα1敲除導致NAFLD小鼠模型口服糖耐量受損,血清甘油三酯上調,肝脂肪變性,以及血清中丙酸與乳酸水平下調,血清代謝物的差異變化與基因ACSL1、GUSB、ABHD6、DECR1、SLC16A1、GCG、CAT、LDHD有關,具體機制有待進一步探究。