非洲豬瘟血清學(xué)診斷技術(shù)研究進(jìn)展

楊欽翔，鄒興啟，趙啟祖

(中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所 國(guó)家/WOAH豬瘟參考實(shí)驗(yàn)室，北京 100081)

非洲豬瘟(African swine fever, ASF)是由非洲豬瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)引起的一種豬急性、熱性、廣泛出血傳染病，致死率高達(dá)100%[1]。該病現(xiàn)階段仍然缺乏有效的疫苗，主要通過(guò)監(jiān)測(cè)、撲殺及加強(qiáng)生物安全管理等綜合措施來(lái)防控。診斷是防控該病的第一步，血清學(xué)診斷作為一種特異性、敏感性較強(qiáng)的診斷方法，在臨床使用上操作方便、成本低，發(fā)揮著不可取代的作用，常用方法如酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)、間接免疫熒光(indirect immunofluorescence assay,IFA)、免疫過(guò)氧化物酶試驗(yàn)(immunoperoxidase test,IPT)、免疫印跡試驗(yàn)(immunobiotting test,IBT)以及免疫層析法(immunochromatographic assay, ICA)。本文對(duì)血清學(xué)診斷技術(shù)進(jìn)行總結(jié)，為更好地了解ASFV結(jié)構(gòu)，改進(jìn)和研究新的血清學(xué)診斷方法提供思路。

1 ASF流行病學(xué)

ASF自1921年被發(fā)現(xiàn)以來(lái)，一直受各國(guó)養(yǎng)豬業(yè)的高度重視，世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(WOAH)將ASF列為法定報(bào)告動(dòng)物疫病，同時(shí)也是我國(guó)一類動(dòng)物疫病。1921年ASF首次在肯尼亞爆發(fā)，開(kāi)始呈現(xiàn)地方性流行。1957年，ASF傳到了葡萄牙，至此ASF在歐洲地區(qū)傳播，經(jīng)30多年才得以消滅。2007年，ASF再次從格魯吉亞向周邊擴(kuò)散蔓延，隨后逐年向外延伸，向西傳至歐洲腹地國(guó)家，向東至遠(yuǎn)東地區(qū)，對(duì)周邊國(guó)家形成了嚴(yán)重的威脅[2]。

2018年8月，在沈陽(yáng)發(fā)現(xiàn)中國(guó)首例ASF病例，隨后在中國(guó)各省市迅速蔓延。2018-2019年ASF主要分布在我國(guó)東北及中東部地區(qū)。得益于有效的防控措施，ASF疫情總體可控，呈現(xiàn)發(fā)散、減弱趨勢(shì)。2020年共報(bào)告19起，撲殺生豬1.35萬(wàn)頭，2021年共報(bào)告14起，撲殺0.36萬(wàn)頭，疫情形式總體逐漸平穩(wěn)[3]。

我國(guó)自2018年首次報(bào)道ASF以來(lái)，全國(guó)均發(fā)生并流行ASF，造成了大量豬只死亡和重大經(jīng)濟(jì)損失。初期，ASF急性發(fā)病，病程短，死亡率高，往往未產(chǎn)生抗體豬就死亡，主要采用熒光PCR等快速核酸檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行病原學(xué)診斷。2020年我國(guó)發(fā)現(xiàn)了低致死率ASFV基因Ⅱ型變異株以及基因Ⅰ型毒株[4-5]。國(guó)內(nèi)ASF疫情流行發(fā)生重大變化，出現(xiàn)慢性隱性感染，傳染隱蔽性加強(qiáng)，防控難度加大。豬通常在感染后7～10天內(nèi)產(chǎn)生針對(duì)ASFV的抗體，并持續(xù)很長(zhǎng)一段時(shí)間。因此，對(duì)亞急性和隱性的ASF診斷可以進(jìn)行特異性血清學(xué)檢測(cè)。

2 病毒結(jié)構(gòu)

了解ASFV粒子的結(jié)構(gòu)以及蛋白質(zhì)的組成對(duì)于血清診斷有著免疫學(xué)意義，ASFV是一個(gè)大型的雙鏈DNA病毒，基因組全長(zhǎng)為170～190 kb，可以分為24個(gè)基因型，根據(jù)基因型的不同有151～167個(gè)開(kāi)放閱讀框(ORF)，編碼50多結(jié)構(gòu)蛋白和100多種非結(jié)構(gòu)蛋白[6-7]。ASFV粒子呈現(xiàn)二十面體形態(tài)，有囊膜[8]。病毒粒子由內(nèi)到外主要由五個(gè)部分組成，分別是第一層病毒基因組(Genome)DNA的擬核、第二層內(nèi)核芯殼(Core shell)、第三層內(nèi)膜(Inner envelope)、第四層衣殼(Capsid)和第五層囊膜(External envelope)[9]。結(jié)構(gòu)圖如圖1所示。

圖1 ASFV 顆粒圖示和每一層中的蛋白質(zhì)[10]Fig 1 Illustration of ASFV particle and examples of proteins in each layer[10]

3 診斷靶標(biāo)

對(duì)于血清學(xué)診斷，尋找具有良好反應(yīng)原性的抗原是構(gòu)建診斷方法的關(guān)鍵。Alejo等人使用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，質(zhì)譜和免疫電子顯微鏡的方法建立具有Vero適應(yīng)的ASFV的蛋白質(zhì)抗原圖譜，總共鑒定68種病毒蛋白和44種未被識(shí)別的蛋白[11]。由B646L編碼p72蛋白是ASFV構(gòu)成二十面體衣殼的主要結(jié)構(gòu)蛋白，是ASFV晚期表達(dá)蛋白，分子質(zhì)量在73.2 ku。p72是第一批被確定為在自然感染后誘導(dǎo)抗體的病毒蛋白之一[12]，具有很強(qiáng)的反應(yīng)原性和免疫原性，也是病毒感染后血清中存在的主要抗體[13]。但部分ASFV毒株的p72基因在C末端不保守，所以以p72抗原開(kāi)發(fā)血清學(xué)診斷方法時(shí)應(yīng)該注意C末端的使用[14]。

p54蛋白是ASFV早期表達(dá)蛋白，編碼基因?yàn)镋183L，位于病毒的內(nèi)囊膜，其免疫原性好、結(jié)構(gòu)保守。實(shí)驗(yàn)中將重組蛋白克隆到pGEX中以大腸桿菌表達(dá)，用感染血清進(jìn)行測(cè)試，重組p54的IgG和IgM抗體具有良好的反應(yīng)性[15]。由于p54蛋白在感染后早期表達(dá)，并且血清中p54抗體可以長(zhǎng)期存在，是血清學(xué)檢測(cè)的重要靶點(diǎn)。p54在不同地區(qū)毒株的氨基酸具有一定的差異，但也有研究表明p54作為血清學(xué)檢測(cè)靶點(diǎn)容易造成假陰性[16]。

p30蛋白也被命名為p32蛋白，編碼基因?yàn)镃P204L，在感染后早期表達(dá)，可以誘導(dǎo)中和抗體的產(chǎn)生,并且和p54一樣在整個(gè)感染過(guò)程中都能被明顯的檢測(cè)[17]。ASF診斷國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)國(guó)標(biāo)GB/T18648-2020《非洲豬瘟診斷技術(shù)》推薦使用p30蛋白作為間接ELISA的檢測(cè)抗原[18]。

CD2v蛋白是由EP402R基因編碼，存在于病毒的囊膜上，與病毒毒力有關(guān)，也是病毒紅細(xì)胞吸附現(xiàn)象的關(guān)鍵蛋白質(zhì)[19]，同時(shí)CD2v也介導(dǎo)ASFV血吸附的血清學(xué)特異性反應(yīng)[20]。早期研究報(bào)道CD2v免疫原性較弱，但近期發(fā)現(xiàn)CD2v蛋白可以表現(xiàn)出很好的免疫原性[21]。所以CD2v也是ASF潛在的診斷靶點(diǎn)。

由于分子生物學(xué)的發(fā)展，近年來(lái)大家都以大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)重組抗原作為原材料進(jìn)行血清學(xué)診斷試驗(yàn)的開(kāi)發(fā)，國(guó)外有使用病毒感染細(xì)胞直接包被抗原。對(duì)比重組蛋白來(lái)說(shuō)，避開(kāi)了操作ASFV活毒的風(fēng)險(xiǎn)，并且可以做到標(biāo)準(zhǔn)化，在不同實(shí)驗(yàn)室獲取結(jié)果的一致性。其中Reis等人使用原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)了血清學(xué)的12種目標(biāo)蛋白(p54、K205R、A104、B602L、p72、p30、CP312R、NP419L、F334L、K196R、p10、C44L)，用ASFV分離株感染后的豬血清對(duì)重組蛋白進(jìn)行酶聯(lián)吸附反應(yīng)，在感染后第7天E183L/p54、K205R、A104R、CP204L/p30抗體水平升高，在感染后第14天敏感性達(dá)到100%；B602L、B646L/p72、CP312R、NP419L、F334L在感染后14天血清學(xué)反應(yīng)升高，在第21天敏感性達(dá)到100%，并且抗體可以存在很長(zhǎng)時(shí)間；其余蛋白K196R/胸苷激酶、K78R/p10和C44L在感染后未見(jiàn)明顯的血清學(xué)反應(yīng)[15]。常見(jiàn)診斷標(biāo)靶見(jiàn)表1。ASFV蛋白極性極強(qiáng)，對(duì)表達(dá)蛋白不做適宜的修飾很難表達(dá)成功，但修飾后表達(dá)蛋白可能與ASF陽(yáng)性血清反應(yīng)性變差，這也是ASFV重組蛋白作為診斷抗原的難點(diǎn)所在。

表1 ASFV常見(jiàn)診斷標(biāo)靶Tab 1 Common diagnostic targets of African swine fever virus

4 血清學(xué)診斷方法

感染ASFV后，急性發(fā)作機(jī)體未產(chǎn)生抗體就死亡，但隨著病毒變異，亞急性或慢性感染的出現(xiàn)，病毒感染誘導(dǎo)體液反應(yīng)，血液出現(xiàn)可檢測(cè)到的抗體水平。以下介紹幾種常用的血清學(xué)檢測(cè)方法。

4.1 ELISA ELISA反應(yīng)是將已知的抗原或抗體結(jié)合在酶標(biāo)板上，利用抗原抗體結(jié)合，通過(guò)酶標(biāo)抗體進(jìn)行標(biāo)記，最后通過(guò)顯色物顯色，可用酶標(biāo)儀或肉眼直接觀察，其顯色深淺與酶標(biāo)抗體的含量成正比。ELISA一般分為間接ELISA，競(jìng)爭(zhēng)ELISA和夾心ELISA。在特異性上夾心ELISA最高，而在敏感性上間接ELISA最高，但容易出現(xiàn)非特異性結(jié)合。在控制敏感性和特異性一直是建立ELISA檢測(cè)方法中重要的一環(huán)。我國(guó)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部于2021年公布ASFV抗體檢測(cè)試劑盒名單，一共有26家企業(yè)的33個(gè)產(chǎn)品通過(guò)比對(duì)評(píng)價(jià)，其中間接ELISA試劑盒17個(gè)，阻斷ELSIA試劑盒12個(gè)，夾心ELSIA試劑盒4個(gè)。這些試劑盒多用p72、p30、p54的重組蛋白作為診斷靶標(biāo)。其中個(gè)別企業(yè)以病毒MGFs和CD2v為診斷靶標(biāo)建立ELSIA抗體檢測(cè)試劑盒[22]。

國(guó)外生產(chǎn)的ID-VET ELISA抗體檢測(cè)試劑盒是基于p72建立的[23]，同時(shí)INGENASA公司也基于p30、p54、p72多肽生產(chǎn)間接ELISA試劑盒[24]。INgezim PPA COMPAC ELISA試劑盒同樣以p72蛋白為包被物建立血清學(xué)檢測(cè)方法[25]。E. Nieto通過(guò)p30與p72蛋白建立間接ELISA檢測(cè)方法。

4.2 IFA與IPT 對(duì)于ASF陽(yáng)性或者可疑確診的樣品，可進(jìn)行IFA檢測(cè)。IFA與IPT試驗(yàn)是基于對(duì)ASF特異性抗體進(jìn)行檢測(cè)，這些抗體結(jié)合了被ASFV感染后固定的細(xì)胞，抗原抗體反應(yīng)后對(duì)標(biāo)記的熒光素蛋白或者過(guò)氧化物酶進(jìn)行檢測(cè)，IFA試驗(yàn)陽(yáng)性樣本會(huì)在感染細(xì)胞中出現(xiàn)特異性的熒光，IPT試驗(yàn)則是觀察細(xì)胞的特異性染色，IPT區(qū)別于IFA試驗(yàn)是不需要熒光顯微鏡即可進(jìn)行。IFA和IPT的特異性高于ELISA 檢測(cè)方法，常作為抗體檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)方法用于新建抗體檢測(cè)方法的驗(yàn)證。此實(shí)驗(yàn)需要高級(jí)生物安全實(shí)驗(yàn)室操作病毒以及熒光顯微鏡，很難實(shí)現(xiàn)高通量，在臨床中使用并不廣泛。目前還沒(méi)有商品化的IFA試劑盒。

IPT技術(shù)是歐盟參考實(shí)驗(yàn)室(National Reference Laboratories NRL)中選定的驗(yàn)證性測(cè)試，它是一種應(yīng)用于固定細(xì)胞的免疫-細(xì)胞技術(shù)，通過(guò)過(guò)氧化物酶的作用來(lái)確定抗體抗原復(fù)合物的形成。它具有很高的靈敏度，該方法還可以檢測(cè)多種種類的豬材料，如血液、滲出液組織或體液。Pastor等[26]在斑點(diǎn)免疫結(jié)合試驗(yàn)(DIA)的基礎(chǔ)上，研制了一種硝酸纖維素試紙條檢測(cè)ASFV，將可溶性抗原吸附在試紙上，通過(guò)過(guò)氧化物酶結(jié)合檢測(cè)抗體，國(guó)內(nèi)也有免疫過(guò)氧化物酶單層細(xì)胞試驗(yàn)(IPMA)的研究，與三種ELISA試劑盒(針對(duì)p54蛋白的ELISA方法、針對(duì)p30蛋白的iELISA和針對(duì)p72的阻斷ELISA)進(jìn)行了對(duì)比，IPMA的符合率均在98%以上[27]。

4.3 IBT 對(duì)于針對(duì)ASF陽(yáng)性或者可疑確診的樣品，進(jìn)行IBT驗(yàn)證試驗(yàn)，其實(shí)驗(yàn)步驟是病毒純化后進(jìn)行SDS-PAGE電泳，通過(guò)電流將蛋白轉(zhuǎn)到硝化纖維素膜上，陽(yáng)性血清與膜上的抗原蛋白(IP 12、IP 23、IP 25、IP 25.5、IP 30、IP 31、IP 34 和 IP 35)反應(yīng)，通過(guò)染色判斷是否感染ASFV。膜上的蛋白質(zhì)可以與急性期和恢復(fù)期豬血清發(fā)生反應(yīng)，因?yàn)橛≯E條帶大小的不同這個(gè)方法在理論上可以做到區(qū)分ASF的感染早期或晚期，具有很好的臨床診斷應(yīng)用前景。但該方法存在ASFV純化困難、免疫印跡技術(shù)重復(fù)性不佳等問(wèn)題，在臨床上應(yīng)用還需要進(jìn)一步攻克難題。Kazakno[28]將p30蛋白與HIS標(biāo)簽鏈接，層析純化得到了p30蛋白，在此基礎(chǔ)上建立了基于p30的ASF血清學(xué)診斷免疫印跡方法，避免了原核表達(dá)的重組蛋白不與血清反應(yīng)的影響，敏感性和特異性都得到了顯著提升。

4.4 ICA 免疫層析法是將特定的抗體或抗原固定于載體的某一區(qū)帶，在一段加入血清后由于毛細(xì)管作用，待檢樣品移動(dòng)到固有區(qū)域發(fā)生抗原抗體特異性結(jié)合。傳統(tǒng)免疫層析技術(shù)以膠體金為標(biāo)記物，通過(guò)條帶顯色對(duì)目標(biāo)物定性檢測(cè)或半定量分析。無(wú)需借助大型儀器，通過(guò)抗原抗體結(jié)合可以快速的實(shí)現(xiàn)檢測(cè)分析。由孟康等將p72蛋白噴涂在標(biāo)記物墊上，制得的膠體金檢測(cè)試紙可快速地檢出血清中ASFV抗體[29]。Sastre[30]在層析技術(shù)基礎(chǔ)上研發(fā)抗原測(cè)定的側(cè)流分析(LFA)，使黑色乳膠珠值結(jié)合抗p72單克隆抗體，檢測(cè)血中的抗體，在10 min內(nèi)得到檢測(cè)結(jié)果。在臨床進(jìn)行ASFV檢測(cè)時(shí)，使用最廣泛和最成熟的免疫層析法為膠體金免疫層析試紙條，該方法操作簡(jiǎn)單，結(jié)果迅速，但該方法的敏感性不足，容易造成假陽(yáng)性。隨著新技術(shù)的發(fā)展，有研究使用截短的 p54 蛋白作為抗原，并將其與Eu摻雜的熒光微球作為示蹤劑結(jié)合，特異性檢測(cè)ASFV抗體[31]。由熒光微球標(biāo)記的試紙條既保留膠體金快速的優(yōu)點(diǎn)，也具有熒光素的高敏感性。

5 總結(jié)與展望

由于ASFV感染后抗體第1周產(chǎn)生并持續(xù)很長(zhǎng)一段時(shí)間，因此血清學(xué)是診斷ASF的主要方法。我國(guó)從2018年傳入ASF至今，ASF臨床表現(xiàn)已由急性型臨床特征轉(zhuǎn)為亞急性型、低死亡率、臨床癥狀不明顯等弱毒株感染特征，由最初以qPCR技術(shù)為主的檢測(cè)ASF到現(xiàn)在血清學(xué)檢測(cè)抗體，血清學(xué)診斷應(yīng)用逐步擴(kuò)增。在ASF沒(méi)有可用的商品化疫苗的情況下，血清學(xué)檢測(cè)抗體陽(yáng)性即表示著ASFV感染。

我國(guó)現(xiàn)階段多采用ELISA方法進(jìn)行血清學(xué)的檢測(cè)，但由于ASFV結(jié)構(gòu)復(fù)雜開(kāi)放閱讀框多，靶向抗原的選擇以及重組蛋白的表達(dá)是ELISA方法建立的難點(diǎn)。WOAH建議在陽(yáng)性ELISA的結(jié)果下需要通過(guò)其他方法確認(rèn)，如IPT、IFA試驗(yàn)。基于ASFV感染細(xì)胞的檢測(cè)方法，如IFA與IPT，對(duì)于診斷亞急性或隱匿型疾病非常有用，但涉及生物安全和標(biāo)準(zhǔn)化問(wèn)題，很難在臨床上進(jìn)行大批量應(yīng)用。隨著ASF的大流行，迫切需要開(kāi)發(fā)敏感性強(qiáng)、特異性高、適合于臨床診斷的快速檢測(cè)方法，如新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)免疫IgM/IgG 抗體檢測(cè)方法[32]，通過(guò)硒納米顆粒橫向流動(dòng)可以方便、快速、靈敏地檢測(cè)人血清和血液中的抗SARS-CoV-2 IgM和IgG。隨著技術(shù)發(fā)展，相信會(huì)有更加可靠的技術(shù)和產(chǎn)品推動(dòng)ASF的有效防控。