石榴皮止瀉散體外抑菌效果研究

伊鵬霏，繆雨臻，蘭新財(cái)，夏 方，安麗娜，趙麗麗*

(1.吉林大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，長春 130062；2.浙江金大康動(dòng)物保健品有限公司，浙江金華 321016；3.石家莊藏諾藥業(yè)股份有限公司，石家莊 050021)

石榴皮止瀉散是由石榴皮飲片和滑石經(jīng)加工制成的散劑，具有澀腸止瀉之功效，主治仔豬白痢。仔豬白痢(White Scour of Piglets)是由致病性大腸桿菌引起的10～30日齡仔豬非敗血性、急性腸道傳染病。臨床表現(xiàn)為拉乳白色或灰白色稀糞，且糞便漿糊狀，腥臭黏膩。病豬嚴(yán)重脫水，可視黏膜蒼白[1]。該病流行廣，傳播快，發(fā)病率可達(dá)80%，且有明顯上升的趨勢。如不及時(shí)治療或治療不當(dāng)，輕者影響仔豬生長發(fā)育，重者造成僵豬，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。

石榴皮的清熱、解毒、健胃、潤肺、澀腸、止血等功效，得到歷代醫(yī)學(xué)家的肯定，中國藥典與中國獸藥典歷版均有收載。石榴皮主含鞣酸類，有收斂殺菌效果，能夠澀腸止血，加之其具有良好的抑菌作用，可治療痢疾、腹瀉、便血等病癥，將石榴皮用水煎煮或粉碎后直接拌料，治療效果明顯。其配伍具有吸附細(xì)菌與毒素作用的滑石，組成復(fù)方制劑，可增強(qiáng)療效，發(fā)揮更強(qiáng)的治療效果。在《中國獸藥典(2015年版)》二部中就收載了多個(gè)配伍滑石的止瀉止痢復(fù)方制劑，如止痢散、雞痢靈片、雞痢靈散等，均配伍了10%～50%不等的滑石藥材。

本研究旨在觀察石榴皮止瀉散對豬大腸桿菌的抑制作用，并測定其最小抑菌濃度(MIC)和最小殺菌濃度(MBC)，為臨床進(jìn)一步研究其對仔豬白痢的治療效果提供基礎(chǔ)。

1 材 料

1.1 菌株 大腸桿菌ATCC25922，購自中國藥品生物制品鑒定所；豬源產(chǎn)腸毒素大腸桿菌CVCC 196，購自中國獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心。

1.2 試驗(yàn)藥品 石榴皮止瀉散，由浙江金大康動(dòng)物保健品有限公司生產(chǎn)，包裝規(guī)格為：800 g/袋；批號為：20170303；用法：口服。

1.3 試劑 MH肉湯培養(yǎng)基、普通肉湯培養(yǎng)基購自青島高科園海博生物技術(shù)有限公司，瓊脂粉、胰蛋白胨、酵母提取物購自英國迪爾拜生物公司，氯化鈉購自北京化工廠。

1.4 主要儀器 恒溫培養(yǎng)振蕩器，哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司；超凈工作臺(tái)，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；TGL-16B型高速臺(tái)式離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；精密電子天平，BSA224S，賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限責(zé)任公司；pH計(jì)，F(xiàn)iveEasy，梅特勒托利多。

2 方 法

2.1 石榴皮止瀉散水煎液的制備 將石榴皮止瀉散用紗布包裹置于鍋內(nèi)，加入約8倍量純凈水，浸泡30 min后，武火加熱至沸，文火煎煮30 min，澄出藥液。再加入約6倍量純凈水，同法煎煮后澄出藥液，將兩次藥液合并后過濾，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器60 ℃濃縮至每1 mL藥液相當(dāng)于1 g生藥的濃度，并用0.1 M/L HCl溶液和1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至7.2～7.4，121 ℃高壓滅菌15 min，于4 ℃冰箱暫存，使用前水浴加熱至37 ℃。

2.2 平板法抑菌試驗(yàn)

2.2.1 菌液制備及細(xì)菌濃度調(diào)整 將大腸桿菌ATCC25922和豬源產(chǎn)腸毒素大腸桿菌CVCC 196分別接種于LB液體培養(yǎng)基，37 ℃過夜培養(yǎng)。倒板法細(xì)菌計(jì)數(shù)：取適量菌液，稀釋107、108或109倍，取1 mL稀釋液分別加入培養(yǎng)皿中，然后向平皿倒入適量冷卻至45 ℃左右的瓊脂培養(yǎng)基，混勻，凝固后轉(zhuǎn)入37 ℃培養(yǎng)箱，培養(yǎng)48 h，計(jì)數(shù)單菌落個(gè)數(shù)，每個(gè)濃度重復(fù)6個(gè)平板。調(diào)整細(xì)菌濃度為108cfu/mL。

2.2.2 抑菌試驗(yàn) 無菌條件下，分別取100 μL 2種供試菌液，均勻涂布于MH肉湯固體培養(yǎng)基表面，待培養(yǎng)基表面晾干后，用滅菌的打孔器在培養(yǎng)基上打直徑為6 mm的圓孔，將石榴皮止瀉散水煎液滴滿孔，重復(fù)3孔，另設(shè)一孔生理鹽水對照孔，靜置15 min后平穩(wěn)的轉(zhuǎn)入37 ℃培養(yǎng)16 h，取出平板觀察是否有抑菌圈，并用直尺測量抑菌圈直徑。

2.3 MIC和MBC的測定

2.3.1 大腸桿菌肉眼可見濃度的判定 藥物對細(xì)菌MIC的測定通常是通過肉眼觀察菌液是否變渾濁，來判斷細(xì)菌是否有明顯的增殖。因較高濃度的中藥有顏色干擾，不能單憑肉眼或借助分光光度計(jì)判斷是否有細(xì)菌增殖，因而先對肉眼可見細(xì)菌濃度進(jìn)行測定。

將大腸桿菌ATCC25922接種于LB液體培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)12 h，細(xì)菌計(jì)數(shù)后，用新鮮MH肉湯培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)菌濃度為4×107cfu/mL、2×107cfu/mL、107cfu/mL和5×106cfu/mL，肉眼觀察菌液是否渾濁。

2.3.2 菌液制備及細(xì)菌濃度調(diào)整 將大腸桿菌ATCC25922和豬源產(chǎn)腸毒素大腸桿菌CVCC 196分別接種于LB液體培養(yǎng)基，37 ℃過夜培養(yǎng)。倒板法細(xì)菌計(jì)數(shù)后，用新鮮MH肉湯培養(yǎng)基稀釋，調(diào)整細(xì)菌濃度為106cfu/mL。

2.3.3 測定MIC 將石榴皮止瀉散水煎液用MH培養(yǎng)基稀釋至400 mg/mL。其余參照文獻(xiàn)[1-3]進(jìn)行，如表1：取9支滅菌試管，編號排列在試管架上，于每管中加入1 mL新鮮的MH培養(yǎng)基，然后向第1支試管中加入1 mL石榴皮止瀉散稀釋液，混勻后取1 mL加入到第2支試管，依次倍比稀釋至第9管，棄去1 mL。然后向各試管中加入1 mL細(xì)菌濃度為106cfu/mL的大腸桿菌ATCC25922菌液，混勻，各管的含藥濃度依次為100 mg/ml、50 mg /mL、25 mg /mL、12.5 mg /mL、6.25 mg /mL，細(xì)菌濃度為5×105cfu/mL。另設(shè)1支陽性對照(1 mL MH培養(yǎng)基加1 mL大腸桿菌ATCC25922菌液)和1支陰性對照(2 mL MH培養(yǎng)基)。37 ℃培養(yǎng)16 h。大腸桿菌CVCC 196的檢測方法同上。

表1 MIC測定方法Tab 1 MIC determination method

將培養(yǎng)好的菌液進(jìn)行倒板法細(xì)菌計(jì)數(shù)[2-4]。倒板法細(xì)菌計(jì)數(shù)的方法如下：將各含藥菌液于37 ℃培養(yǎng)16 h后，分別取適量進(jìn)行倍比稀釋，然后分別取1 mL稀釋倍數(shù)為103、104、105倍的稀釋液，加入培養(yǎng)皿中，然后向平皿倒入適量冷卻至45 ℃左右的瓊脂培養(yǎng)基，混勻，凝固后轉(zhuǎn)入37 ℃培養(yǎng)箱，培養(yǎng)48 h，計(jì)數(shù)單菌落個(gè)數(shù)。

2.3.4 測定MBC 取高于MIC的所有試管中的液體適量，稀釋10倍后，取1 mL加入培養(yǎng)皿中，然后向平皿倒入適量冷卻至45 ℃左右的瓊脂培養(yǎng)基，混勻，凝固后轉(zhuǎn)入37 ℃培養(yǎng)箱，培養(yǎng)48 h，計(jì)數(shù)單菌落個(gè)數(shù)。菌落數(shù)低于5個(gè)且含藥液最少的藥液濃度即為MBC[4]。

3 結(jié)果與分析

3.1 平板法抑菌試驗(yàn) 石榴皮止瀉散水煎液孔周圍均有明顯的抑菌圈出現(xiàn)(圖1)，抑菌圈直徑詳見表2；生理鹽水對照孔周圍沒有抑菌圈。石榴皮止瀉散水煎液有明顯的抑制大腸桿菌的效果。

A：石榴皮止瀉散水煎液對大腸桿菌ATCC25922的抑菌圈B：石榴皮止瀉散水煎液對大腸桿菌CVCC 196的抑菌圈A:Bacteriostatic circle of pomegranate peel Decoction for Relieving diarrhea and dispersive water against Escherichia coli ATCC25922B:Bacteriostatic circle of pomegranate peel Decoction for Relieving diarrhea and dispersive water against Escherichia coli CVCC 196圖1 石榴皮止瀉散水煎液體外抑制大腸桿菌生長Fig 1 pomegranate peel antidiarrheal powder Decoction inhibits the growth of Escherichia coli in vitro

表2 石榴皮止瀉散水煎液體外抑制大腸桿菌生長試驗(yàn)結(jié)果(n=3)Tab 2 Experimental results of pomegranate peel antidiarrheal powder Decoction inhibiting the growth of Escherichia coli in vitro (n=3)

3.2 大腸桿菌肉眼可見濃度的判定 細(xì)菌濃度為4×107cfu/mL、2×107cfu/mL和107cfu/mL的菌液呈渾濁狀，其中濃度為107cfu/mL的菌液渾濁程度較輕；細(xì)菌濃度為5×106cfu/mL的菌液不可見渾濁(表3、圖2)。即大腸桿菌肉眼可見濃度為大于或等于107cfu/mL。所以細(xì)菌濃度小于107cfu/mL即判為無大量細(xì)菌生長。

表3 肉眼可見細(xì)菌濃度判定Tab 3 Determination of visible bacterial concentration

1：陰性對照；2：細(xì)菌濃度為4×107cfu/mL的菌液；3：細(xì)菌濃度為2×107cfu/mL的菌液；4：細(xì)菌濃度為107cfu/mL的菌液；5：細(xì)菌濃度為5×106cfu/mL的菌液。1: Negative control;2: The concentration of bacteria was 4×107cfu/mL bacterial solution;3: The concentration of bacteria was 2×107cfu/mL bacterialsolution;4: The concentration of bacteria was 107cfu/mL bacterial solution;5: The concentration of bacteria was 5×106cfu/mL bacterial solution.圖2 肉眼可見細(xì)菌濃度判定Fig 2 Determination of bacteria concentration visible to the naked eye

3.3 石榴皮止瀉散水煎液對大腸桿菌MIC的測定 藥物濃度為100 mg/mL、50 mg/mL的培養(yǎng)液(第1、2支試管)對應(yīng)的細(xì)菌計(jì)數(shù)的各個(gè)平板上均沒有細(xì)菌生長，即該培養(yǎng)液的細(xì)菌濃度為0；藥物濃度為25 mg/mL的培養(yǎng)液(第3支試管)對應(yīng)的部分平板可見單菌落生長，選擇其中較為適合計(jì)數(shù)的一組平板進(jìn)行單菌落計(jì)數(shù)，可得該培養(yǎng)液的細(xì)菌濃度均低于107cfu/mL；藥物濃度為12.5 mg/mL、6.25 mg/mL、3.125 mg/mL、1.562 mg/mL、0.781 mg/mL和0.390 mg/mL的培養(yǎng)液(第4、5、6、7、8、9支試管)對應(yīng)的各個(gè)平板上均形成菌苔，不適合計(jì)數(shù)，可得該培養(yǎng)液的細(xì)菌濃度遠(yuǎn)大于107cfu/mL。詳細(xì)數(shù)據(jù)及相對應(yīng)的培養(yǎng)液的細(xì)菌濃度見表4、表5。

表4 各含藥培養(yǎng)液的細(xì)菌濃度Tab 4 bacterial concentration of each medicated culture medium

表5 含25 mg/mL石榴皮止瀉散培養(yǎng)液的細(xì)菌濃度Tab 5 bacterial concentration of culture solution containing 25 mg/mL pomegranate peel Zhixie powder

即藥物濃度為25 mg/mL、50 mg/mL和100 mg/mL時(shí)，培養(yǎng)液的細(xì)菌濃度低于107cfu/mL，無大量細(xì)菌生長。故石榴皮止瀉散水煎液對兩株大腸桿菌的最小抑菌濃度均為25 mg/mL。

3.4 石榴皮止瀉散水煎液對大腸桿菌MBC的測定 高于MIC的所有培養(yǎng)液對應(yīng)的平板上均無細(xì)菌生長，所以石榴皮止瀉散水煎液對大腸桿菌的MBC為50 mg/mL。

4 討論與結(jié)論

石榴皮是一味具有悠久應(yīng)用歷史的中獸藥，為石榴科植物石榴PunicagranatumL. 的干燥果皮，中國獸藥典記載[5]，味酸、澀，性溫，歸大腸經(jīng)，具有澀腸止瀉、止血，驅(qū)蟲等功效。用于久瀉，久痢，便血，脫肛，帶下，蟲積腹痛。而仔豬白痢臨床表現(xiàn)為拉乳白色或灰白色稀糞，且糞便漿糊狀，腥臭黏膩。臨床選用石榴皮止瀉散進(jìn)行治療，能有效緩解仔豬白痢的癥狀。而造成仔豬白痢的病原是大腸桿菌，眾多研究報(bào)告表明，中藥石榴皮對多種細(xì)菌、真菌有抑制或殺滅作用，石榴皮的水提物對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏桿菌、黑曲霉、綠膿桿菌、白色念珠菌等有顯著抑制作用，其抑菌的主要成分可能為多酚類物質(zhì)和生物堿[6-9]。

陳雪珊等通過一系列的抑菌試驗(yàn)來驗(yàn)證石榴皮的抑菌效果，石榴皮提取液、濃縮液、冷干粉末及軟膏對金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌的抑菌圈直徑分別在23.5～11.6 mm，最小抑菌濃度在2500～78.1 μg/mL，最小殺菌濃度在5000～156.3 μg/mL[7]，表明石榴皮的提取液、濃縮液、冷干粉末及軟膏均具有較好的體外抗菌活性，幽門螺桿菌甲硝唑耐藥株及敏感株都對其敏感[10]，對鮑曼不動(dòng)桿菌也有較好的抑制作用[11]。熊素英等用石榴皮醇提液進(jìn)行試驗(yàn)，證明其具有廣譜抗菌作用，對金黃色葡萄球菌的最低抑菌濃度為3.125%，對枯草芽抱桿菌和蠟狀芽抱桿菌為6.25%，對大腸桿菌為12.5%，對青霉和黑曲霉分別為12.5%、25%，對啤酒酵母和面包酵母為50%[12]。董周永等研究認(rèn)為，石榴果皮提取物的抑菌機(jī)理是其抑制了菌體的己糖磷酸途徑(HMP)引起代謝功能障礙，使調(diào)控菌體生長、分裂相關(guān)蛋白的合成受到抑制，引起細(xì)胞質(zhì)固縮，最終使菌體的生長繁殖受到抑制，甚至死亡[13]。

滑石為硅酸鹽類礦物滑石族滑石，主含含水硅酸鎂[Mg3(Si4O10)(OH)2]。滑石粉具有保護(hù)皮膚和粘膜的作用，能吸附大量化學(xué)刺激性物或毒物，因此當(dāng)撒布于發(fā)炎或破損組織的表面時(shí)，可有保護(hù)的作用；內(nèi)服時(shí)除保護(hù)發(fā)炎的胃腸粘膜而發(fā)揮鎮(zhèn)吐、止瀉作用外，還能阻止毒物在胃腸中的吸收?；圻€有抗菌作用，用平板法使培養(yǎng)基含10%的滑石粉，對傷寒桿菌與副傷寒甲桿菌有抑制作用；用紙片法則僅對腦膜炎球菌有輕度抑菌作用。

本研究對由石榴皮和滑石制成的石榴皮止瀉散水煎液進(jìn)行抑菌試驗(yàn)結(jié)果也表明，含藥濃度為1 g/mL的石榴皮止瀉散水煎液對大腸桿菌有明顯的抑制作用，對大腸桿菌的MIC為25 mg/mL，MBC為50 mg/mL。

每1 mL含1 g生藥的石榴皮止瀉散水煎液在體外對大腸桿菌(大腸桿菌ATCC25922，大腸桿菌CVCC 196)具有抑制作用，MIC為25 mg/mL，MBC為50 mg/mL。