非洲豬瘟診斷制品注冊(cè)評(píng)審現(xiàn)狀分析

王德麗，滕 穎，李 翠，李旭妮，肖 璐，李偉杰，王 芳，曲鴻飛

(中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081)

非洲豬瘟是由非洲豬瘟病毒(African swine fever，ASFV)引起的豬的一種急性、高度接觸性傳染病[1]，以高熱、皮膚發(fā)紺等為主要特征，死亡率高達(dá)100%，給養(yǎng)豬業(yè)造成了重大經(jīng)濟(jì)損失。ASFV屬于非洲豬瘟病毒科，為雙鏈DNA病毒，病毒基因組約170～193 kb[2]，包含150～167個(gè)開(kāi)放閱讀框，編碼100多個(gè)蛋白[3]。

目前ASFV已在我國(guó)定殖并形成較大污染面，應(yīng)毫不放松抓好非洲豬瘟常態(tài)化防控。利用診斷制品開(kāi)展非洲豬瘟感染檢測(cè)與早期診斷是目前預(yù)防和控制本病的重要手段。2019年以來(lái)，申請(qǐng)非洲豬瘟類(lèi)診斷制品注冊(cè)申報(bào)數(shù)量一直居高不下，但因注冊(cè)申報(bào)資料存在各種問(wèn)題，不符合注冊(cè)要求比例較高。鑒于此，對(duì)我國(guó)非洲豬瘟診斷制品注冊(cè)申報(bào)情況、評(píng)審評(píng)價(jià)政策以及不符合注冊(cè)要求的原因進(jìn)行了分析，并提出了相關(guān)建議，供非洲豬瘟診斷制品研發(fā)、注冊(cè)人員參考。

1 注冊(cè)申報(bào)情況

截至2021年底，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部獸藥評(píng)審中心共收到非洲豬瘟診斷制品注冊(cè)申請(qǐng)226份，共計(jì)89個(gè)產(chǎn)品(存在同一個(gè)產(chǎn)品因不符合注冊(cè)要求而重復(fù)提交注冊(cè)申請(qǐng)的情況，以下均按產(chǎn)品統(tǒng)計(jì))，其中不符合注冊(cè)要求產(chǎn)品52個(gè)，處于注冊(cè)過(guò)程中的產(chǎn)品27個(gè)，批準(zhǔn)發(fā)公告的產(chǎn)品10個(gè)。

1.1 已批準(zhǔn)產(chǎn)品情況 截至2021年底，批準(zhǔn)發(fā)公告10個(gè)產(chǎn)品，包括8個(gè)核酸檢測(cè)試劑盒、1個(gè)抗原熒光微球檢測(cè)試紙條和1個(gè)抗體檢測(cè)試劑盒，詳見(jiàn)表1。

表1 已批準(zhǔn)非洲豬瘟診斷制品Tab 1 Licensed ASF diagnostic test kits

1.2 產(chǎn)品類(lèi)型分析 申報(bào)的89個(gè)產(chǎn)品中，包括核酸檢測(cè)試劑盒、抗原檢測(cè)試劑盒和抗體檢測(cè)試劑盒三大類(lèi)。核酸檢測(cè)試劑盒共52個(gè)產(chǎn)品，占非洲豬瘟診斷制品總數(shù)的58%。其中熒光PCR試劑盒數(shù)量最多，為38個(gè)；其次為等溫?cái)U(kuò)增試劑盒，為13個(gè)；普通PCR試劑盒僅1個(gè)。抗原檢測(cè)試劑盒共10個(gè)產(chǎn)品，占非洲豬瘟診斷制品總數(shù)的11%。其中大多數(shù)為免疫層析試紙條，包括5個(gè)膠體金試紙條、1個(gè)乳膠微球試紙條和1個(gè)熒光微球試紙條；其余為3個(gè)ELISA抗原檢測(cè)試劑盒。抗體檢測(cè)試劑盒共27個(gè)，占非洲豬瘟診斷制品總數(shù)的30%。其中，ELISA抗體檢測(cè)試劑盒為20個(gè)；免疫層析抗體檢測(cè)試紙條為7個(gè)(膠體金試紙條6個(gè)，乳膠微球試紙條1個(gè))。

1.3 檢測(cè)靶標(biāo)分析 根據(jù)注冊(cè)申報(bào)資料統(tǒng)計(jì)，核酸檢測(cè)的主要靶標(biāo)基因?yàn)镻72、CD2v和MGF；抗原檢測(cè)的主要檢測(cè)靶標(biāo)為P72蛋白和P30蛋白；抗體檢測(cè)主要靶標(biāo)為P72蛋白、P30蛋白、P54蛋白及CD2v蛋白等的抗體。

2 技術(shù)評(píng)審的主要政策要求

2.1 注冊(cè)資料要求 為推進(jìn)獸醫(yī)診斷制品的評(píng)審改革，近幾年，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部畜牧獸醫(yī)局會(huì)同農(nóng)業(yè)農(nóng)村部獸藥評(píng)審中心積極修訂獸醫(yī)診斷制品的注冊(cè)資料要求，保證敏感特異的評(píng)審標(biāo)準(zhǔn)不降低的前提下，逐步減少注冊(cè)資料的項(xiàng)目要求。2020年9月29日，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部發(fā)布新的《獸醫(yī)診斷制品注冊(cè)分類(lèi)及注冊(cè)資料要求》(農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公告第342號(hào))[4]。因此根據(jù)非洲豬瘟診斷制品提交注冊(cè)申請(qǐng)時(shí)間的不同，按照不同的注冊(cè)資料要求進(jìn)行評(píng)審。2020年10月15日前已申請(qǐng)的，按照農(nóng)業(yè)部公告第2335號(hào)執(zhí)行[5]；2020年10月15日后申請(qǐng)的，按照農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公告第342號(hào)執(zhí)行。

2.2 評(píng)審工作機(jī)制 2021年1月21日，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部發(fā)布新的《獸藥注冊(cè)評(píng)審工作程序》(農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公告第392號(hào))，實(shí)施評(píng)審中心專(zhuān)家主審與獸藥注冊(cè)評(píng)審專(zhuān)家?guī)炱渌麑?zhuān)家咨詢(xún)相結(jié)合的獸藥注冊(cè)評(píng)審工作機(jī)制[6]。該文件明確要求，原則上對(duì)每個(gè)獸藥注冊(cè)申請(qǐng)的評(píng)審，初次評(píng)審和復(fù)評(píng)審均不超過(guò)一次。這意味著，凡是需要再次提交初審會(huì)討論的產(chǎn)品，尤其是涉及修改質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)核心檢驗(yàn)項(xiàng)目，均予以退審。這也是目前獸藥注冊(cè)退審率高的一個(gè)重要原因。

2.3 評(píng)審工作方式 2019年，為應(yīng)對(duì)非洲豬瘟疫情，滿(mǎn)足防控需求，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部畜牧獸醫(yī)局在農(nóng)牧便函〔2019〕276號(hào)明確提出對(duì)ASFV檢測(cè)試劑盒予以?xún)?yōu)先評(píng)審；初審對(duì)試劑盒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)無(wú)修改意見(jiàn)的，可在補(bǔ)充其他材料的同時(shí)開(kāi)展質(zhì)量復(fù)核檢驗(yàn)工作。目前農(nóng)業(yè)農(nóng)村部已批準(zhǔn)的非洲豬瘟診斷制品可以滿(mǎn)足市場(chǎng)非洲豬瘟診斷檢測(cè)需求，且非洲豬瘟診斷制品申報(bào)數(shù)量大。從2022年9月19日起非洲豬瘟診斷制品不再實(shí)行優(yōu)先評(píng)審。

2.4 簡(jiǎn)化評(píng)審要求

2.4.1 按2335號(hào)公告評(píng)審的產(chǎn)品 農(nóng)牧便函〔2019〕411號(hào)(以下簡(jiǎn)稱(chēng)“便函”)中對(duì)非洲豬瘟診斷類(lèi)制品的注冊(cè)資料要求進(jìn)行了相應(yīng)簡(jiǎn)化。一是按照2335號(hào)公告要求，凡與我國(guó)已批準(zhǔn)上市銷(xiāo)售、檢測(cè)方法和檢測(cè)標(biāo)的物相同的同類(lèi)診斷制品相比，無(wú)根本改進(jìn)的診斷產(chǎn)品不作為新獸藥審批[5]；但鑒于當(dāng)時(shí)非洲豬瘟檢測(cè)試劑需求量大，便函中規(guī)定對(duì)不符合新獸藥定義但經(jīng)評(píng)審和檢驗(yàn)認(rèn)為產(chǎn)品質(zhì)量符合要求的，不再核發(fā)新獸藥注冊(cè)證書(shū)，對(duì)具備生產(chǎn)條件的相關(guān)企業(yè)核發(fā)產(chǎn)品批準(zhǔn)文號(hào)。二是按照2335號(hào)公告評(píng)審的制品，按照“老人老辦法、新人新辦法”要求補(bǔ)充比對(duì)試驗(yàn)報(bào)告。2019年2月27日，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公告第138號(hào)公布了國(guó)家非洲豬瘟參考實(shí)驗(yàn)室、專(zhuān)業(yè)實(shí)驗(yàn)室和區(qū)域?qū)嶒?yàn)室[7]。對(duì)138號(hào)公告發(fā)布前已申請(qǐng)注冊(cè)的制品，不再要求補(bǔ)充比對(duì)試驗(yàn)報(bào)告；138號(hào)公告發(fā)布后申請(qǐng)注冊(cè)的產(chǎn)品，可在注冊(cè)評(píng)審復(fù)審前提供比對(duì)報(bào)告；而且非洲豬瘟區(qū)域?qū)嶒?yàn)室出具的比對(duì)試驗(yàn)報(bào)告也予以認(rèn)可。三是，臨床試驗(yàn)研究中陽(yáng)性樣品數(shù)量不做硬性要求。

2.4.2 按342號(hào)公告評(píng)審的產(chǎn)品 僅申請(qǐng)注冊(cè)為創(chuàng)新型獸醫(yī)診斷制品的，需要提供3家獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室的評(píng)價(jià)試驗(yàn)報(bào)告；申請(qǐng)注冊(cè)為改良型獸醫(yī)診斷制品的，不需要提供評(píng)價(jià)試驗(yàn)報(bào)告。而且臨床試驗(yàn)研究中陽(yáng)性樣品數(shù)量仍不做硬性要求。

3 常見(jiàn)不符合注冊(cè)要求原因分析

89個(gè)產(chǎn)品中，不符合注冊(cè)要求比例高達(dá)58%?，F(xiàn)根據(jù)試劑盒檢測(cè)原理將原因分類(lèi)匯總?cè)缦隆?/p>

3.1 共性問(wèn)題 一是申報(bào)資料不全，缺少必要的研究數(shù)據(jù)。如研究報(bào)告中檢測(cè)的樣本來(lái)源與背景不清等。二是申報(bào)資料前后邏輯錯(cuò)誤，難以評(píng)價(jià)申報(bào)資料和試驗(yàn)數(shù)據(jù)的真實(shí)性。如多個(gè)研究報(bào)告的試驗(yàn)時(shí)間前后矛盾等。三是制品成品檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定難以控制產(chǎn)品質(zhì)量。如敏感性檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)中不同稀釋度質(zhì)控品缺少對(duì)應(yīng)檢測(cè)值范圍規(guī)定。四是質(zhì)控品問(wèn)題。如敏感性質(zhì)控血清未采用經(jīng)典方法(如IFA等)進(jìn)行檢驗(yàn)和標(biāo)定。

3.2 分子生物學(xué)試劑盒存在的其他問(wèn)題 引物、探針選擇依據(jù)方面，缺少對(duì)引物及探針適用性分析報(bào)告。針對(duì)多重PCR試劑盒，缺少雙重?zé)晒馀c單熒光敏感性比較研究報(bào)告。針對(duì)有凍干組分的試劑盒，缺少凍干工藝系統(tǒng)研究報(bào)告。

3.3 免疫學(xué)試劑盒存在的其他問(wèn)題 包被抗原的選擇依據(jù)方面，缺少采用混合蛋白與單個(gè)蛋白分別作為包被抗原進(jìn)行敏感性比對(duì)的研究報(bào)告。表達(dá)蛋白鑒定方面，表達(dá)蛋白的western-blot分析缺少用非洲豬瘟病毒陽(yáng)性血清進(jìn)行測(cè)定的試驗(yàn)數(shù)據(jù)。生產(chǎn)工藝方面，缺少抗原包被工藝和酶結(jié)合物制備、標(biāo)準(zhǔn)等系統(tǒng)性研究數(shù)據(jù)等。質(zhì)量研究報(bào)告方面，ELISA抗體檢測(cè)方法建立研究報(bào)告中未采用已知非洲豬瘟病毒陽(yáng)性血清進(jìn)行相關(guān)研究。

4 建 議

4.1 一般建議 一是關(guān)于ASFV陽(yáng)性樣品。如用到ASFV陽(yáng)性樣品，應(yīng)說(shuō)明是否為滅活樣品。如未滅活，應(yīng)說(shuō)明是否符合生物安全相關(guān)要求。購(gòu)自中監(jiān)所、非洲豬瘟參考/專(zhuān)業(yè)/區(qū)域?qū)嶒?yàn)室以及軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院軍事獸醫(yī)研究所的樣品予以認(rèn)可，可不提供制備研究報(bào)告，但需提供標(biāo)準(zhǔn)及購(gòu)買(mǎi)證明。如為饋贈(zèng)，也需提供標(biāo)準(zhǔn)及饋贈(zèng)單位證明。二是質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)敏感性檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)明確檢測(cè)范圍。敏感性質(zhì)控品含量如為定值，敏感性檢驗(yàn)暫不要求必須檢到陰性；敏感性質(zhì)控品含量如非定值，敏感性檢驗(yàn)應(yīng)檢到陰性。三是作用與用途中涉及的樣品類(lèi)型均需有研究數(shù)據(jù)支持。四是申報(bào)資料應(yīng)提供具體試驗(yàn)數(shù)據(jù)，包括電泳圖、ELISA檢測(cè)OD值等。五是敏感性質(zhì)控品和特異性質(zhì)控品應(yīng)采用本試劑盒之外的方法檢驗(yàn)。六是敏感性研究報(bào)告中應(yīng)包括臨床陽(yáng)性樣品的研究數(shù)據(jù)。七是特異性研究報(bào)告中應(yīng)包括臨床樣品的研究數(shù)據(jù)。八是保存期研究報(bào)告應(yīng)提供制品達(dá)到規(guī)定保存期并延長(zhǎng)3個(gè)月的研究數(shù)據(jù)。九是臨床試驗(yàn)研究報(bào)告所用臨床樣品中應(yīng)包括陰性樣品、陽(yáng)性樣品；針對(duì)非洲豬瘟診斷制品，暫不要求陽(yáng)性樣品比例達(dá)到10%。

4.2 分子生物學(xué)檢測(cè)試劑盒建議 一般情況下，可以使用質(zhì)粒作為質(zhì)控品。多重?zé)晒釶CR檢測(cè)試劑盒應(yīng)提供多重?zé)晒馀c單熒光檢測(cè)敏感性比較研究報(bào)告。如有凍干組分，應(yīng)提供凍干工藝研究報(bào)告。

4.3 免疫學(xué)檢測(cè)試劑盒建議 一是抗體檢測(cè)類(lèi)的制品，一般應(yīng)使用全病毒陽(yáng)性血清作為質(zhì)控品。二是重組抗原應(yīng)采用非洲豬瘟病毒陽(yáng)性血清進(jìn)行特異性鑒定。三是抗體檢測(cè)試劑盒特異性質(zhì)控品除陰性樣品外，一般應(yīng)包括出現(xiàn)交叉/干擾反應(yīng)的其它血清及生產(chǎn)包被抗原時(shí)所用細(xì)胞、表達(dá)載體、標(biāo)簽蛋白等的陽(yáng)性血清。四是應(yīng)提供單抗特異性鑒定、酶標(biāo)抗體活性、酶標(biāo)抗原質(zhì)量控制等研究資料。五是抗體檢測(cè)試劑盒ELISA方法建立研究報(bào)告中應(yīng)采用已知非洲豬瘟病毒陽(yáng)性血清進(jìn)行相關(guān)研究，臨界值確定所用血清應(yīng)采用經(jīng)典方法進(jìn)行確認(rèn)。