藿烏粉的提取工藝研究

盧鵬懷， 曹眾達， 孫耀貴， 孫盼盼， 孫 娜， 李宏全， 程 佳

(中獸醫(yī)藥現(xiàn)代化山西省重點實驗室， 山西農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學學院， 山西太谷 030801)

我國是畜禽養(yǎng)殖與消費大國， 雞蛋產(chǎn)量位居世界首位， 但我國“小規(guī)模、大群體”的產(chǎn)業(yè)特征依然存在， 萬只以下的中小規(guī)模養(yǎng)殖仍然是蛋雞養(yǎng)殖的主體。由于生產(chǎn)設施簡陋、飼養(yǎng)管理不到位、從業(yè)人員專業(yè)知識匱乏、疾病、應激等因素的影響， 導致蛋雞養(yǎng)殖過程中疾病頻發(fā)、高峰產(chǎn)蛋率降低、蛋品質下降。在實際養(yǎng)殖過程中， 經(jīng)營者為了追求蛋雞的生產(chǎn)性能和抗疾病能力， 往往會在飼料中添加抗生素。長期不規(guī)范使用抗生素， 不僅會引起蛋雞免疫能力下降、腸道菌群平衡破壞等一系列問題， 同時還會危害到人類的健康。中草藥富含多種生物活性物質和營養(yǎng)成分， 具有純天然、耐藥性弱、有害殘留少、毒副作用小等優(yōu)勢， 在替代抗生素方面有著巨大的潛力。2020版《中國獸藥典》二部中收錄的具有改善蛋雞產(chǎn)蛋性能、提升蛋品質的中獸藥僅有降脂增蛋散、蛋雞寶、激蛋散三種[1]。且三種中獸藥均為傳統(tǒng)散劑， 存在組方藥味多、制劑工藝粗糙、質量難以控制、藥物利用率低、療效不穩(wěn)定等缺點。蛋雞養(yǎng)殖行業(yè)迫切需要能夠安全、有效延長蛋雞產(chǎn)蛋周期， 提升蛋品質的新型中獸藥。

淫羊藿和制何首烏為傳統(tǒng)補益中藥。淫羊藿為助陽藥， 性溫， 味辛、甘， 歸肝經(jīng)、腎經(jīng)， 具有溫腎助陽、強筋壯骨、益精補氣的功效?，F(xiàn)代藥理研究表明其主要有促進性腺功能、防治骨質疏松、促進造血功能、抗腫瘤、抗炎等作用[2-3]。制何首烏為滋陰藥， 性微溫， 味苦、甘、澀， 歸肝、心、腎經(jīng)， 具有滋補肝腎、填精益血、強筋健骨的功效?，F(xiàn)代藥理研究表明其主要有延緩機體衰老、增強機體免疫力、改善心腦血管功能、預防動脈粥樣硬化等作用[4-5]。課題組前期針對蛋雞產(chǎn)蛋時期的生理特點， 以肝腎陰陽雙補立法， 精選淫羊藿、制何首烏兩味藥材進行組方， 經(jīng)粉碎混合制備成傳統(tǒng)散劑“藿烏散”， 研究發(fā)現(xiàn)其具有提高蛋雞產(chǎn)蛋性能和改善蛋品質的效果。為了更好的推廣應用， 課題組擬將傳統(tǒng)散劑“藿烏散”開發(fā)成一款新型中獸藥“藿烏粉”。

本研究將在前期研究的基礎上， 應用現(xiàn)代中獸藥制劑技術，進行 “藿烏粉”的提取工藝研究， 為將其開發(fā)為微量、安全、高效、質量可控、使用方便的新型中獸藥和在蛋雞養(yǎng)殖過程中的推廣應用奠定基礎。

1 材 料

1.1 儀器 Agilent 1260 Infinity Ⅱ 高效液相色譜儀(美國Agilent公司)；B-491旋轉蒸發(fā)儀(瑞士BU CHI公司)；SB25-12D超聲波清洗機(寧波新芝生物科技股份有限公司)；TB-215D電子分析天平(德國賽多利斯天平有限公司)；HH-56數(shù)顯恒溫水浴鍋(江蘇金壇市金城國勝實驗儀器廠)。

1.2 試藥 對照品2， 3， 5， 4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷(簡稱二苯乙烯苷、批號82373-94-2， 含量98%)、淫羊藿苷(批號489-32-7， 含量98%)、朝藿定A(批號110623-72-8， 含量98%)、朝藿定B(批號110623-73-9， 含量98%)， 購于江西佰草源生物科技有限公司；液相部分所用甲醇、乙腈、乙醇均為色譜純(美國Fisher公司)； 淫羊藿、制何首烏藥材， 購于河北省安國市祁源中藥材有限公司。

2 方 法

2.1 含量測定

2.1.1 色譜條件 Agilent 5 TC-C18(250 mm×4.6 mm)色譜柱；柱溫30 ℃， 流速1 mL/min， 進樣量10 μL； 二苯乙烯苷含量檢測：以V(乙腈)∶V(水)= 25∶75為流動相；檢測波長為320 nm； 淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B含量檢測：以V(乙腈)∶V(水)=30∶70為流動相；檢測波長為270 nm。

2.1.2 對照品溶液的制備 精密稱定二苯乙烯苷對照品適量， 加50%乙醇定容至刻度， 制成0.3920 mg/mL的對照品儲備液。精密稱定淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B對照品適量， 加50%乙醇定容至刻度， 制成含淫羊藿苷0.3463 mg/mL、朝藿定A 0.2334 mg/mL、朝藿定B 0.2607 mg/mL的混合對照品儲備液。

2.1.3 供試品溶液的制備 精密稱取藿烏提取物0.1 g， 置具塞錐形瓶中， 加入50%乙醇20 mL， 稱定重量， 超聲處理15 min， 用50%乙醇補足減失的重量， 搖勻， 濾過， 取續(xù)濾液， 即得。

2.1.4 陰性供試品溶液的制備 分別稱取缺制何首烏、淫羊藿的陰性處方量藥材2份， 按最佳工藝制得缺何首烏和缺淫羊藿陰性樣品。精密稱取陰性樣品0.1 g， 同“2.1.3”項下的處理方法， 制得陰性供試品溶液。

2.1.5 方法學考察

2.1.5.1 系統(tǒng)適應性 取對照品、供試品、陰性對照溶液適量， 分別進樣， 得到相應的液相圖譜。二苯乙烯苷色譜圖見圖1， 淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B三種成分的色譜圖見圖2。

A-對照品； B-供試品； C-缺制何首烏陰性供試品；1- 二苯乙烯苷圖1 二苯乙烯苷HPLC圖Fig 1 HPLC chromatograms of Stilbene glycoside

A-對照品； B-供試品； C-缺淫羊藿陰性供試品；1- 朝藿定A； 2-朝藿定B； 3-淫羊藿苷圖2 淫羊藿三種黃酮成分的HPLC圖Fig 2 HPLC chromatograms of three flavonoids in Epimedium

2.1.5.2 線性關系考察 精密吸取上述對照品溶液、混合對照品溶液適量， 對照品溶液依次稀釋2、4、8、16、32倍?；旌蠈φ掌啡芤阂来蜗♂?、4、8、16、32、64倍。按相應的色譜條件進樣測定， 記錄峰面積。以峰面積為縱坐標(Y)， 質量濃度為橫坐標(X)繪制標準曲線， 進行回歸分析， 線性關系考察結果見表1。

表1 線性關系考察Tab 1 Investigation of linear relationship

2.1.5.3 精密度試驗 取對照品溶液、混合對照品溶液各一份， 按相應的色譜條件重復進樣6次， 測得二苯乙烯苷、淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B峰面積的RSD值分別為0.55%、0.66%、0.67%、0.75%， 表明儀器精密度良好。

2.1 穴播根據(jù)樹種的種粒大小，每穴均勻地播入數(shù)粒到數(shù)十粒種子。播后覆土鎮(zhèn)壓。操作簡單、靈活、用工量少。

2.1.5.4 穩(wěn)定性試驗 取對照品溶液、混合對照品溶液各一份， 按相應的色譜條件分別在0， 2， 4， 8， 12， 24 h時進樣， 測得二苯乙烯苷、淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B峰面積的RSD值分別為0.62%、0.42%、0.47%、0.49%， 表明對照品溶液和混合對照品溶液在24 h內穩(wěn)定性良好。

2.1.5.5 重復性試驗 取同一份供試品， 根據(jù)“2.1.3”項下的供試品制備方法， 平行制備6份供試品溶液， 并按照相應的色譜條件測定各成分的含量， 測得二苯乙烯苷、淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B的平均質量分數(shù)分別為35.23、19.70、7.12、11.20 mg/g，RSD分別為1.55%、0.48%、0.78%、0.77%。

2.1.5.6 加樣回收率試驗 精密稱取已知含量的樣品(二苯乙烯苷35.78 mg/g、淫羊藿苷19.78 mg/g、朝藿定A 7.10 mg/g、朝藿定B 11.39 mg/g)0.025 g， 共6份， 分別置于50 mL錐形瓶中， 加入1 mL混合對照品溶液(二苯乙烯苷0.8931 mg/mL、淫羊藿苷1.648 mg/mL、朝藿定A 0.625 mg/mL、朝藿定B 1.060 mg/mL， 50%乙醇制)， 50%乙醇定容至20 mL。按“2.1.3”項下供試品的處理方法進行處理， 之后按相應的色譜條件測定， 測得二苯乙烯苷、淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B的平均加樣回收率分別為102.05%、99.40%、101.04%、99.14%，RSD值分別為1.80%、0.43%、0.41%、0.40%， 結果表明該方法回收率良好。

2.2 干膏得率測定 將藿烏粉提取液減壓濃縮， 得生藥質量濃度0.5 g/mL的濃縮液。精密吸取濃縮液100 mL， 置已干燥恒重的蒸發(fā)皿內， 60 ℃水浴蒸干， 于105 ℃干燥3 h， 取出置干燥器冷卻0.5 h， 精密稱定重量， 計算干膏得率。干膏得率=(m1-m0)/M×100%， m0為蒸發(fā)皿質量， m1為干浸膏與蒸發(fā)皿總質量， M為中藥飲片的質量。

2.3 單因素試驗 取處方量藥材14份， 分別以乙醇濃度(A)、固液比(B)、提取時間(C)和提取次數(shù)(D)為自變量， 以二苯乙烯苷含量、三種黃酮之和以及干膏得率的綜合評分為因變量， 進行提取， 提取液抽濾后照2.2項下方法得到干浸膏， 并計算干膏得率。將干浸膏粉碎， 照2.1項下的方法測定三種黃酮之和以及二苯乙烯苷的含量。

2.4 正交試驗 在前期單因素實驗的基礎上， 以乙醇濃度(A)、固液比(B)、提取時間(C)和提取次數(shù)(D)為自變量， 以二苯乙烯苷、三種黃酮之和以及干膏得率的綜合評分為因變量， 采用L9(34)正交試驗優(yōu)化提取工藝， 正交試驗設計表見表2。綜合評分Y=二苯乙烯苷含量/最高含量×權重系數(shù)+三種黃酮之和/最高含量×權重系數(shù)+干膏得率/最高得率×權重系數(shù)。

表2 正交因素水平L9(34) 表Tab 2 Factors and levels of L9(34) orthogonal test

2.5 指標權重的確定

2.5.1 AHP法 據(jù)藿烏粉中各指標對藥理活性作用的強弱， 采用1 ～ 9標度法[6]對二苯乙烯苷、三種黃酮之和以及干膏得率三個權重指標進行量化， 各指標優(yōu)先順序如下：二苯乙烯苷>三種黃酮之和>干膏得率， 構建成對比較的優(yōu)先判斷矩陣， 見表3。根據(jù)矩陣評分情況利用SPSSAU軟件進行AHP層次分析， 分析得二苯乙烯苷、三種黃酮之和以及干膏得率的權重系數(shù)分別為 0.5390、0.2972、0.1638。一致性比例因子(CR)=0.0089<0.10,因此判斷矩陣評分具有良好的一致性， 求得的權重系數(shù)有效。

表3 判斷矩陣評分Tab 3 Judgment matrix scoring

2.5.2 CRITIC法 CRITIC法是一種客觀的權重賦值方法， 它通過數(shù)據(jù)的標準差和相關系數(shù)來體現(xiàn)評價指標之間的變異性和沖突性[7]。首先將正交中的數(shù)據(jù)進行歸一化處理， 歸一化的數(shù)據(jù)經(jīng)SPSSAU軟件分析， 得二苯乙烯苷、三種黃酮之和、干膏得率的權重系數(shù)分別為0.2969、0.4439、0.2592。

2.5.4 綜合評價結果比較 分別采用AHP、CRITIC、AHP-CRITIC綜合加權法對正交試驗的數(shù)據(jù)進行綜合評價， 結果見表4。使用SPSS 25軟件對三種方法的評分結果進行相關系數(shù)分析。AHP法和AHP-CRITIC法、CRITIC法和AHP-CRITIC法、AHP法和CRITIC法評分的相關系數(shù)分別為0.9817、0.9212、0.8854， 三者相關性顯著(P<0.01)。AHP和CRITIC法各指標權重系數(shù)的相關系數(shù)為0.0291， 接近于0， 且P>0.05， 說明AHP和CRITIC法確定的權重系數(shù)沒有相關關系， 故選用AHP-CRITIC綜合加權法來評價試驗結果。

表4 3種賦權方法綜合評分Tab 4 Synthetical scores of three weighting methods

2.6 提取工藝的驗證 精密稱取粗粉過的混合藥材3份， 每份100 g， 以篩選出的最優(yōu)工藝條件進行試驗， 測定各項指標。

3 結果與分析

3.1 單因素試驗 試驗結果見表5(序號1～5、6～10、11～14依次為乙醇濃度、固液比、提取時間的單因素試驗)。由序號1～5的結果可知， 隨著提取溶劑中乙醇濃度的增加， 評分先增加后減少， 并在濃度為60%時評分最高， 因此將正交試驗中乙醇的濃度水平設置為60%、70%、80%； 由序號6～10的結果可知， 隨著固液比的增加， 評分先增加后減少， 并在固液比為1∶12時達到最高， 因此將正交試驗中固液比的水平定為1∶8、1∶12、1∶16； 由序號11～14的結果可知， 隨著提取時間的增加， 評分先增加后減少， 并在1.5 h時達到最高， 因此將提取時間的水平設置為0.5 h、1 h、1.5 h； 前期預試驗結果表明提取次數(shù)也對提取效果有一定的影響， 為此增加了提取次數(shù)因素， 并將水平設置為1、2、3次。

表5 單因素試驗設計與結果Tab 5 Single factor test design and results

3.2 正交試驗 根據(jù)AHP-CRITIC法確定的權重系數(shù)對正交試驗結果進行綜合評分， 正交試驗設計與結果見表6， 方差分析見表7。根據(jù)表6極值(R)的大小， 可知各因素主次關系為C>D>B>A。由表7可知， 四個因素對提取效果均無顯著性影響， 因此取各因素較高水平的組合， 得最佳工藝為A2B2C3D2?？紤]到乙醇濃度(A因素)K1和K2的值相差不大， 且對提取效果的影響最小， 故選用成本更低的A1， 最終確定提取工藝為A1B2C3D2， 即12倍量60%的乙醇加熱回流2次， 每次1.5 h。

表6 正交試驗設計與結果Tab 6 Orthogonal test design and results

表7 方差分析Tab 7 Analysis of variance

3.3 提取工藝的驗證 提取工藝的驗證結果見表8。由表8可知， 各指標成分和綜合評分的RSD值均小于2%， 且平均綜合評分大于之前所有的單因素試驗。結果表明優(yōu)選出的工藝穩(wěn)定， 主要活性成分的提取率高， 可用于藿烏粉的制備。

表8 提取工藝的驗證結果/(mg·g- 1)Tab 8 Results of extraction process verification experiment/(mg·g- 1)

4 討 論

本研究在查閱淫羊藿、制何首烏提取工藝相關文獻后， 選擇了二苯乙烯苷作為評價藿烏粉中制何首烏提取效果的指標[9-10], 淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B三種黃酮成分作為評價淫羊藿提取效果的指標[11-12]。二苯乙烯苷是制何首烏中的主要活性成分， YANG等的研究表明二苯乙烯苷類成分能增強D-半乳糖致衰老小鼠肝臟的抗氧化能力從而延緩小鼠衰老[13]。淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B是淫羊藿總黃酮的評價指標。淫羊藿總黃酮是淫羊藿的主要活性成分， 具有促進蛋雞生殖系統(tǒng)發(fā)育的作用， GUO等的研究表明淫羊藿總黃酮能顯著提高蛋雞顆粒細胞的增殖、分化， 并促進初級卵泡向層前卵泡的轉化[14]。

在選擇藿烏粉中二苯乙烯苷、淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B四種成分的含量測定方法時， 曾借鑒了江勛等人的思路[15]， 嘗試建立一種一測多評四種成分的HPLC方法。但最終的效果并不理想， 為此選擇了分開測定二苯乙烯苷和淫羊藿三種黃酮成分的含量。二苯乙烯苷含量的測定方法參照了《中國藥典》2020版一部何首烏項下的方法[16]， 該方法重復性好， 且陰性無干擾， 故使用該方法作為測定藿烏粉中二苯乙烯苷含量的方法。淫羊藿三種黃酮成分含量的測定方法主要參照了《中國藥典》2020版一部淫羊藿項下的方法[16]， 但該方法用時較長， 需要近35 min才能完全出峰， 因此適當提升了流動相中乙腈的比例， 將三種物質的出峰時間壓縮至20 min內。

在選擇多指標權重方法時， 本文提到的AHP法雖能在一定程度上體現(xiàn)復方中藥君臣佐使的配伍規(guī)律， 但容易受主觀判斷的影響， 忽略數(shù)據(jù)本身的客觀屬性。CRITIC法雖能體現(xiàn)數(shù)據(jù)波動性和數(shù)據(jù)間相關關系等客觀屬性， 但它沒有考慮到指標間的輕重關系。AHP-CRITIC綜合加權法則結合了上述兩種方法的優(yōu)點， 在考慮各指標輕重關系的同時又兼顧了數(shù)據(jù)本身的客觀屬性， 因此選用AHP-CRITIC綜合加權法對正交試驗的結果進行分析。

5 結 論

采用AHP-CRITIC綜合加權法結合正交試驗優(yōu)選出的提取工藝經(jīng)驗證穩(wěn)定、可行重復性好， 可用于藿烏粉的制備。