片仔癀保護小鼠局灶性腦缺血再灌注后血腦屏障的分子機制研究

高驍君 田 珊 管 敏 劉 順

（南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，江蘇省中醫(yī)院，江蘇南京210029）

2019年，我國有近219萬人死于腦卒中，在收治的340萬卒中患者中，缺血性腦卒中約占82.6%[1]?；謴?fù)缺血區(qū)血流再通是缺血性腦卒中的首要治療手段，然而血流再灌注亦會造成血腦屏障（blood brain barrier，BBB）損傷，加重腦損傷和神經(jīng)功能障礙，因此保護BBB的完整性可作為治療缺血性腦卒中的治療靶點[2]。

片仔癀是由牛黃、蛇膽、麝香、三七等中藥經(jīng)發(fā)酵制成的中成藥，常用于病毒性肝炎、癰疽疔瘡及各種炎癥的治療。已有文獻報道，片仔癀可顯著改善局灶性腦缺血再灌注大鼠的神經(jīng)功能缺損，減少腦梗死體積[3-4]。然而，片仔癀對缺血再灌注后BBB完整性的保護作用及其分子機制尚未見報道。BBB的功能依賴于內(nèi)皮細胞間的緊密連接蛋白，如胞質(zhì)緊密粘連蛋白1（ZO-1）和閉合蛋白5（Claudin-5），糖原合酶激酶-3β（GSK3β）/β-連環(huán)蛋白（β-catenin）通路的激活可促進緊密連接蛋白的表達，而GSK3β作為通路的負向調(diào)控因子，其活性受到上游蛋白激酶B（Akt）活性的調(diào)控[5-8]。本研究制備小鼠大腦中動脈閉塞/再灌注（MCAO/R）模型，探索片仔癀對腦缺血再灌注損傷后腦梗死率、BBB通透性的調(diào)控作用，以及對Akt/GSK3β/β-catenin通路活化和緊密連接蛋白ZO-1、Claudin-5表達的調(diào)控作用，探討片仔癀對腦缺血再灌注損傷后BBB的保護作用及其潛在的分子機制，為片仔癀應(yīng)用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療奠定實驗基礎(chǔ)。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 SPF級健康成年雄性C57BL/6J小鼠，體重（23±2）g，購于南通大學(xué)實驗動物中心，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（蘇）2019-0001。小鼠于溫度25 ℃、濕度60 %~70 %、光暗比12 h/12 h的環(huán)境中適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d，自由攝食飲水。本實驗經(jīng)江蘇省中醫(yī)院實驗動物倫理委員會審議批準，動物使用許可證號：SYXK（蘇）2017-0069。

1.2 藥物與試劑 片仔癀（批號2109161），漳州片仔癀藥業(yè)股份有限公司；丁苯酞（批號B304122），上海阿拉丁生化科技股份有限公司；異氟烷（批號R510），深圳市瑞沃德生命科技有限公司；LY294002（批號S1105），Selleck生物科技有限公司；MCAO線栓（批號L3800），北京西濃科技有限公司；2,3,5-氯化三苯基四氮唑（TTC，批號T8170）、核蛋白提取試劑盒（批號T8877）、全蛋白提取試劑盒（批號T8877）、BCA蛋白定量檢測試劑盒（批號PC0020），北京索萊寶科技有限公司；ECL發(fā)光液（批號A38555），賽默飛世爾科技公司；蘇木素-伊紅（HE）染色試劑盒（批號KGA224），江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司；β-catenin一抗（批號17565-1-AP）、ZO-1一抗（批號21773-1-AP），武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；p-Akt一抗（批號#4060）、Akt一抗（批號#4691）、p（Ser9）-GSK3β一抗（批號#9322）、GSK3β一抗（批號#9315），賽信通生物試劑有限公司；Claudin-5一抗（批號ab131259）、Histone H3一 抗（批 號ab1791）、β-actin一抗（批號ab8226），艾博抗貿(mào)易有限公司；伊文思藍（EB，批號D10878），北京沃凱生物科技有限公司。

1.3 主要儀器 R500小動物氣體麻醉機（深圳市瑞沃德生命科技有限公司），XTL-165-XTWZ萬向支架體視顯微鏡（鳳凰光學(xué)股份有限公司），BS224型電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司），HW-1000超級恒溫水浴箱（成都泰盟科技有限公司），BX53正置生物顯微鏡（奧林巴斯有限公司），WG2003臺式干燥箱（重慶萬達有限公司），TGL-18M型高速冷凍離心機（湖南賽特湘儀離心機儀器 有 限 公 司），Criterion?電 泳 槽（Bio-Rad公 司），Trans-Blot?轉(zhuǎn)印槽（Bio-Rad公司），Tanon 6600發(fā)光成像工作站（Tanon公司），Infinite M200 Pro全波長酶標儀（TECAN公司），Chemidoc XRS+化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)（Bio-Rad公司）。

2 實驗方法

2.1 分組與造模 將小鼠隨機分為假手術(shù)組和造模組。造模組按照CHIANG T等[9]的線栓法建立小鼠MCAO/R模型，缺血1 h后移除線栓，形成再灌注；假手術(shù)組不插入線栓，其余手術(shù)操作與造模組一致。造模組再灌注1 h后進行神經(jīng)功能缺陷評分[10]，評分為2～3分的小鼠為造模成功。將造模成功的小鼠隨機分為模型組、丁苯酞組（120 mg/kg）、片仔癀低劑量組（370 mg/kg）、片仔癀高劑量組（740 mg/kg）和片仔癀（740 mg/kg）+LY294002（20 mg/kg）組，每組23只，假手術(shù)組亦取23只。

2.2 藥物配制及給藥方法 以0.5%羧甲基纖維素鈉水溶液將片仔癀配制成濃度分別為74.0 mg/mL、37.0 mg/mL的均勻混懸液，將陽性對照藥丁苯酞配制成濃度為12.0 mg/mL的藥液；按產(chǎn)品說明將Akt抑制劑LY294002配制成濃度為2 mg/mL的澄清溶液。藥物劑量均根據(jù)成人臨床用量按人-小鼠體表面積系數(shù)折算[11]。各給藥組于再灌注后2 h給藥，片仔癀、丁苯酞給藥容積均為0.1 mL/10 g，灌胃給藥，LY294002按0.1 mL/10 g腹腔注射給藥，假手術(shù)組和模型組同時期開始每日灌胃給予等體積生理鹽水，各組均每日給藥或生理鹽水1次，連續(xù)3 d。

2.3 觀察指標

2.3.1 神經(jīng)功能缺陷評分 末次給藥后2 h，各組分別取8只小鼠，按照文獻[10]報道的5分制法對小鼠進行神經(jīng)功能缺陷評分，分值越高表明神經(jīng)功能缺陷越嚴重。

2.3.2 腦梗死率 神經(jīng)功能缺陷評分結(jié)束后，以頸椎脫臼法對同一批小鼠進行安樂死，取腦，將腦組織沿冠狀面切為5片，浸沒于含2%TTC的溶液中，37 ℃溫育15 min，其中梗死區(qū)呈現(xiàn)蒼白色，非缺血區(qū)呈現(xiàn)鮮紅色。按公式計算腦梗死率[12]：腦梗死率（%）=（非缺血側(cè)半球面積－缺血側(cè)半球正常區(qū)面積）/（2×非缺血側(cè)半球面積）×100%。

2.3.3 腦組織病理形態(tài) 末次給藥后2 h，各組分別取3只小鼠進行麻醉，剪開胸腔，暴露心臟，將灌注針插入左心室，再將右心耳剪破，先后以100 mL 37 ℃的0.9%NaCl注射液和50 mL 4 ℃的4%多聚甲醛溶液進行心臟灌流，以去除腦中血細胞并固定腦組織，灌流至動物全身僵硬、肝臟發(fā)白后，斷頭取腦包埋，制備4 μm切片，HE染色。使用正置顯微鏡（×100）對切片的皮層區(qū)域進行觀察，細胞核呈藍色，胞漿呈紅色，其他成分呈深淺不同的紅色。

2.3.4 BBB通透性 末次給藥后2 h，各組分別取6只小鼠進行麻醉，自小鼠股靜脈注入3%的EB溶液（20 μL/10 g體 重），1 h后 以100 mL 0.9%NaCl注射液進行心臟灌流，斷頭取腦稱重，加入甲酰胺（0.5 mL/0.2 g腦組織），勻漿，取上清檢測吸光度（OD 632 nm），根據(jù)標準曲線計算腦組織EB滲漏量，以此評估BBB通透性。

2.3.5 缺 血 大 腦 皮 層p-Akt、p-GSK3β、ZO-1和Claudin-5的表達及β-catenin的核轉(zhuǎn)位水平 末次給藥后2 h，各組分別取6只小鼠，分離缺血側(cè)大腦皮層組織，其中3只小鼠用于提取總蛋白（檢測p-Akt、p-GSK3β、ZO-1和Claudin-5的表達水平），另外3只小鼠用于提取核蛋白（檢測β-catenin的核轉(zhuǎn)位水平）。BCA法測定蛋白濃度，加入適當(dāng)量的蛋白上樣緩沖液混勻、變性、上樣。每孔上樣20 μg蛋白，經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、抗體孵育、ECL顯影后，使用Image J定量分析蛋白表達水平，以目的蛋白與參比蛋白的灰度比進行量化（其中以Akt作為p-Akt的參比蛋白，以GSK3β作為p-GSK3β的參比蛋白，以Histone H3作 為 核 內(nèi)β-catenin的參比蛋白，以β-actin作為ZO-1和Claudin-5的參比蛋白）。

2.4 統(tǒng)計學(xué)方法 使用SPSS 22.0統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進行分析。滿足正態(tài)分布的計量資料以（x-±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，方差齊時采用Tukey事后檢驗對組間數(shù)據(jù)進行兩兩比較，方差不齊時引入Welch校正后用Games-Howell檢驗進行兩兩比較。不滿足正態(tài)分布的計量資料以中位數(shù)和四分位數(shù)[M（P25，P75）]表示，采用非參數(shù)檢驗進行組間比較。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 實驗結(jié)果

3.1 各組小鼠神經(jīng)功能缺陷評分、腦梗死率比較 造模成功后小鼠隨機分組，模型組與各給藥組小鼠神經(jīng)功能缺陷評分比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。末次給藥后2 h，假手術(shù)組小鼠未見神經(jīng)功能缺陷，也未出現(xiàn)腦梗死；模型組小鼠神經(jīng)功能缺陷評分、腦梗死率均顯著高于假手術(shù)組（P＜0.01）；丁苯酞組和片仔癀高劑量組小鼠神經(jīng)功能缺陷評分、腦梗死率均顯著低于模型組（P＜0.05，P＜0.01），片仔癀低劑量組腦梗死率顯著低于模型組（P＜0.01）；片仔癀+LY294002組上述指標與模型組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），其中神經(jīng)功能缺損評分顯著高于片仔癀高劑量組（P＜0.05）。各組小鼠神經(jīng)功能評分、腦梗死率比較詳見表1，腦組織梗死情況見圖1。

圖1 各組小鼠腦組織梗死情況（TTC染色，標尺示：4 mm）

表1 各組小鼠神經(jīng)功能缺損評分、腦梗死率比較

3.2 各組小鼠腦組織病理變化 見圖2。假手術(shù)組小鼠腦皮層區(qū)域神經(jīng)元組織形態(tài)和結(jié)構(gòu)未見異常，腦組織未見水腫和缺血病變；模型組小鼠可見缺血區(qū)腦組織水腫，神經(jīng)元胞體呈多角形，固縮，空泡變性；片仔癀高劑量組和丁苯酞組小鼠腦組織可見神經(jīng)元變性壞死明顯減輕。與片仔癀高劑量組比較，片仔癀+LY294002組小鼠腦組織病理變化明顯加重。

圖2 各組小鼠腦組織病理變化（HE染色，×100）

3.3 各組小鼠腦組織EB滲漏量比較 模型組小鼠腦組織EB滲漏量顯著高于假手術(shù)組（P＜0.01）；丁苯酞組和片仔癀高劑量組小鼠腦組織EB滲漏量顯著低于模型組（P＜0.05，P＜0.01），丁苯酞組和片仔癀各劑量組組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；片仔癀+LY294002組小鼠腦組織EB滲漏量顯著高于片仔癀高劑量組（P＜0.01），與模型組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。詳見表2。

表2 各組小鼠腦組織EB滲漏量比較（x-±s） 單位：μg/g腦組織

3.4 各組小鼠缺血大腦皮層p-Akt、p-GSK3β、ZO-1、Claudin-5蛋白表達及β-catenin核轉(zhuǎn)位水平比較 與假手術(shù)組比較，模型組小鼠腦缺血再灌注后，缺血側(cè)皮層腦組織p-Akt、p-GSK3β、ZO-1、Claudin-5蛋白表達水平均顯著降低（P＜0.01），β-catenin核轉(zhuǎn)位水平顯著降低（P＜0.01）。丁苯酞組與片仔癀低、高劑量組小鼠上述指標表達均顯著高于模型組（P＜0.05，P＜0.01），其中以片仔癀高劑量組改善更為明顯；片仔癀+LY294002組上述指標表達均顯著低于片仔癀高劑量組（P＜0.05，P＜0.01），且與模型組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。詳見圖3、表3。

表3 各組小鼠缺血大腦皮層p-Akt、p-GSK3β、ZO-1、Claudin-5蛋白表達及β-catenin核轉(zhuǎn)位水平比較（x-±s）

圖3 各組小鼠缺血大腦皮層p-Akt、p-GSK3β、β-catenin、Claudin-5、ZO-1蛋白電泳圖

4 討論

缺血性腦卒中是國民健康的首要威脅。自20世紀80年代Simon教授提出“神經(jīng)保護”的概念以來，針對神經(jīng)元保護的藥物研究大量涌現(xiàn)，然而1000余種候選藥物的臨床轉(zhuǎn)化幾乎全部失敗，提示僅針對缺血區(qū)神經(jīng)元的單一保護策略可能具有一定局限性[13-14]。近年來，有學(xué)者提出“神經(jīng)血管單元”概念，將腦缺血區(qū)的血管、神經(jīng)元、膠質(zhì)細胞等作為整體進行研究，以期尋找有效的腦缺血損傷干預(yù)策略[15]。腦血管是神經(jīng)血管單元的重要組分，亦是BBB的重要組成結(jié)構(gòu)，腦缺血后，血管內(nèi)皮細胞損傷造成BBB的完整性破壞，通透性升高，促使血漿蛋白成分和外周免疫細胞進入腦組織，造成血管源性腦水腫和炎癥損傷，加重腦缺血損傷和神經(jīng)功能障礙[16]。因此，保護腦血管內(nèi)皮細胞，維持BBB的完整性可以作為腦缺血再灌注損傷的干預(yù)手段。丁苯酞是我國從芹菜籽中提取的左旋芹菜甲素消旋體，是治療急性腦梗死的國家一類新藥，可降低腦組織炎癥因子水平，維持血管內(nèi)皮功能，促進缺血區(qū)血流量恢復(fù)，抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)，進而改善腦缺血患者神經(jīng)功能損傷，在本研究中作為陽性對照藥物[17]。

磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/Akt信號參與細胞增殖、凋亡、血管生成等過程，主要通過Akt的活化發(fā)揮調(diào)控作用。生理狀態(tài)下Akt以非活化構(gòu)象駐留在細胞質(zhì)中，當(dāng)細胞受到生長因子等第一信使作用時，PI3K首先發(fā)生激活，介導(dǎo)3,4,5-磷脂酰肌醇三磷酸（PIP3）的生成，由于Akt的PH作用域?qū)IP3的高親和力，促使Akt易位至細胞膜上，并暴露磷酸化位點Thr308和Ser473殘基。3-磷酸肌醇依賴性蛋白激酶1（PDK1）可介導(dǎo)Thr308位點的磷酸化使得Akt部分活化，而Akt的充分活化則需要包括PDK2在內(nèi)的多種激酶共同作用介導(dǎo)Ser473位點的磷酸化[18]。Akt活化后也可介導(dǎo)其他底物蛋白的磷酸化修飾，已有研究顯示Akt可通過介導(dǎo)GSK3β絲氨酸殘基Ser9的磷酸化，抑制GSK3β活性。GSK3β是Wnt/β-catenin通路的負向調(diào)控元件，活化態(tài)的GSK3β可與腺瘤息肉蛋白APC和軸蛋白Axin等組成降解復(fù)合體，介導(dǎo)β-catenin的降解，使其在胞漿處于低水平，無法作為轉(zhuǎn)錄輔助因子促進緊密連接相關(guān)蛋白ZO-1和Claudin-5的表達[19-20]。在生理狀態(tài)下，BBB的屏障功能依賴于細胞間的緊密連接，而緊密連接的形成主要涉及特定的細胞間跨膜蛋白相互作用，在BBB內(nèi)皮細胞中Claudin-5是最主要的Claudin亞型，其可通過與相鄰細胞表面的Claudin-5發(fā)生同源相互作用，形成閉鎖結(jié)構(gòu)，Claudin-5的胞內(nèi)段則通過與支架蛋白ZO-1相互作用而與細胞骨架相連，并且對于維持BBB屏障功能至關(guān)重要[21]?；罨腁kt可介導(dǎo)GSK3β的Ser9磷酸化修飾，使降解復(fù)合體失活，進而促進β-catenin的胞漿積累和核轉(zhuǎn)位[22-23]，同時促進ZO-1、Claudin-5的表達，維持BBB的屏障功能[24-25]。

本研究結(jié)果顯示，給予片仔癀可改善MCAO/R小鼠神經(jīng)功能缺陷，降低腦梗死率，改善BBB通透性，提高Akt和GSK3β的磷酸化水平，促進β-catenin的核轉(zhuǎn)位并上調(diào)ZO-1和Claudin-5的表達，其作用表現(xiàn)出一定的劑量依賴性，高劑量片仔癀對神經(jīng)功能、腦梗死率、BBB通透性的改善與丁苯酞相當(dāng)，對上述蛋白表達的調(diào)節(jié)作用優(yōu)于丁苯酞。LY294002是PI3K/Akt通路的特異性抑制劑，可抑制Akt的磷酸化激活，本研究在給予高劑量片仔癀的同時給予LY294002，以探究片仔癀是否通過激活A(yù)kt發(fā)揮腦保護作用。結(jié)果表明，在給予片仔癀的同時給予LY294002可阻斷片仔癀對p-Akt的上調(diào)作用，降低GSK3β的磷酸化水平和β-catenin的核轉(zhuǎn)位，下調(diào)ZO-1和Claudin-5的表達，增加BBB通透性。此外，LY294002也顯著逆轉(zhuǎn)了片仔癀對小鼠神經(jīng)功能缺陷和腦梗死的改善作用。因此，我們推測片仔癀可能通過調(diào)控Akt/GSK3β/β-catenin途徑保護BBB的完整性，從而減輕腦缺血再灌注損傷。

綜上，本研究表明，腦缺血再灌注模型小鼠呈現(xiàn)顯著的神經(jīng)功能缺陷，腦組織發(fā)生明顯的梗死，BBB的滲漏性顯著升高，而給予片仔癀治療后由缺血再灌注造成的腦組織損傷和神經(jīng)行為缺陷得到改善，其機制可能與激活A(yù)kt/GSK3β/β-catenin途徑，上調(diào)緊密連接蛋白ZO-1和Claudin-5的表達，維持BBB的完整性相關(guān)。本研究結(jié)果將為片仔癀臨床應(yīng)用于影響B(tài)BB功能的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾?。X卒中、帕金森病、阿爾茲海默病等）的治療奠定基礎(chǔ)。

本研究已初步明確片仔癀對Akt/GSK3β/β-catenin信號通路的激活作用，已有研究顯示GSK3β/β-catenin通路在中樞神經(jīng)系統(tǒng)血管新生過程中亦發(fā)揮重要功能，且血管新生與缺血性腦卒中的神經(jīng)功能預(yù)后密切相關(guān)，本課題組未來將進一步探究片仔癀對缺血性腦卒中恢復(fù)期血管新生的促進作用，以期為促進腦卒中后神經(jīng)功能恢復(fù)提供新的療法。