鱉甲煎丸抗肝癌作用機制研究進展

李楠楠張玉峰劉玲芳

（1.河南中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，河南鄭州450053；2.河南省中醫(yī)院，河南鄭州450002）

據(jù)2020年全球癌癥統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，全球新發(fā)肝癌約91萬例，死亡約83萬例，發(fā)病率和死亡率分別居全球第6位和第3位[1]。我國是肝癌的高發(fā)地區(qū)，在所有惡性腫瘤中肝癌發(fā)病率排第5，死亡率位居第2[2]。因本病發(fā)病隱匿、早期診斷困難，肝癌患者確診時多已發(fā)展為中晚期，惡性程度高，極易發(fā)生浸潤轉(zhuǎn)移，且預(yù)后較差。目前臨床常規(guī)治療方法有肝切除術(shù)、肝移植術(shù)、局部消融治療、經(jīng)動脈化療栓塞、放射治療、系統(tǒng)抗腫瘤等[3]，雖有一定的治療作用，但存在整體預(yù)后較差、復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率高、化療副作用大、生存質(zhì)量低、生存周期短等問題。

根據(jù)臨床特征可將肝癌歸屬于中醫(yī)學(xué)“肝積”“積聚”“癥瘕”“黃疸”等范疇，虛、瘀、痰、熱為其主要病因，病機虛實夾雜，基本治則為扶正祛邪、活血化瘀、清熱解毒、軟堅散結(jié)[4]。鱉甲煎丸出自《金匱要略·瘧病脈證并治》，方含23味中藥，是仲景名方中第一大方，具有軟堅散結(jié)、行氣活血、祛濕化痰等功效，主治瘧母、癥瘕等疾患[5]，現(xiàn)代臨床常用于治療肝纖維化、肝硬化、肝癌等肝臟疾病，療效確切。本文對近十年來鱉甲煎丸抗肝癌作用機制的相關(guān)文獻進行歸納總結(jié)，闡述其作用機制的研究進展，以期為其后續(xù)的深入研究及臨床推廣應(yīng)用提供依據(jù)。

1 抑制肝癌細胞增殖

細胞增殖是生物體生長、發(fā)育、繁殖及遺傳的基礎(chǔ)，也是腫瘤細胞生長、發(fā)展的重要條件。與正常細胞相比，腫瘤細胞的特點是過度增殖且不受調(diào)控，因此抑制惡性增殖是治療腫瘤的關(guān)鍵。

文彬等[6]以肝癌細胞HepG2為模型，運用血清藥理學(xué)方法研究發(fā)現(xiàn)鱉甲煎丸可阻斷分泌型糖蛋白/β-連環(huán)蛋白（Wnt/β-catenin）信號通路的傳遞，減少β-catenin在細胞核內(nèi)積聚，抑制其下游處于不同過程的靶基因的表達，從而抑制肝癌細胞的增殖。孫海濤等[7]研究亦發(fā)現(xiàn)，鱉甲煎丸通過調(diào)控人肝癌HepG2裸鼠移植瘤Wnt/β-catenin信號通路，抑制肝癌細胞的增殖并促進其凋亡，從而發(fā)揮抗肝癌作用。鱉甲煎丸還可通過調(diào)節(jié)絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號通路，有效抑制肝癌細胞Bel-7402的增殖，起到抗癌作用[8]。此外，林洪升等[9]、李明芬等[10]研究發(fā)現(xiàn)，鱉甲煎丸可抑制肝癌細胞SMMC-7721增殖活性，其機制涉及眾多微小RNA（miRNA）、信使RNA（mRNA）、長鏈非編碼RNA（lncRNA）及其信號通路的傳導(dǎo)，有待進一步研究。

2 誘導(dǎo)肝癌細胞凋亡

細胞凋亡是人體自身為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，由基因控制細胞自主有序的死亡，又稱程序性細胞死亡。目前，應(yīng)用藥物誘導(dǎo)癌細胞的凋亡是臨床治療癌癥常用方法之一。介導(dǎo)凋亡主要有線粒體通路、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路和死亡受體通路三種通路。B細胞淋巴瘤-2（Bcl-2）家族是作用于線粒體的細胞凋亡重要調(diào)節(jié)分子，其中發(fā)揮重要作用的是Bcl-2和Bax，當(dāng)Bcl-2高表達時可抑制細胞凋亡，Bax高表達則促進細胞凋亡。Janus酪氨酸蛋白激酶（JAK）/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子（STAT）信號通路是一種常見的細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，參與細胞增殖、分化、凋亡和免疫調(diào)節(jié)，與各種癌癥和自身免疫性疾病密切相關(guān)[11]。

孫陽等[12-13]采用H22荷瘤小鼠制作體內(nèi)抗腫瘤實驗?zāi)Ｐ停邝M甲煎丸干預(yù)H22移植瘤后通過電鏡觀察其細胞形態(tài)學(xué)變化發(fā)現(xiàn)，鱉甲煎丸可誘導(dǎo)肝癌細胞凋亡，細胞內(nèi)線粒體形態(tài)變化最為明顯，可知其抗腫瘤作用機制是通過抑制白細胞介素-6（IL-6）/JAK/STAT信號通路，下調(diào)Bcl-2表達、上調(diào)Bax表達，從而誘導(dǎo)肝癌細胞線粒體途徑凋亡。另有研究表明，經(jīng)鱉甲煎丸干預(yù)后的肝癌細胞SMMC-7721凋亡率顯著增高，且具有濃度依賴性，其機制與細胞中STAT3、Bcl-2表達降低、Bax表達升高有關(guān)[14]。

3 阻滯肝癌細胞周期

細胞周期通?？煞譃镈NA合成前期（G1期）、DNA合成期（S期）、DNA合成后期（G2期）、有絲分裂期（M期）。在細胞周期過程中，細胞周期蛋白（cyclin）、細胞周期蛋白依賴性激酶（CDK）及其抑制劑（CKI）共同構(gòu)成復(fù)雜的信號調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，以確保整個細胞周期過程的精準調(diào)控。細胞周期在腫瘤的生長增殖調(diào)控中具有重要作用，阻滯腫瘤細胞周期可有效抑制腫瘤的生長。

賈文燕等[15]研究發(fā)現(xiàn)，鱉甲煎丸可通過調(diào)控Wnt/β-catenin信號通路，下調(diào)cyclin D1表達，使肝癌細胞HepG2在G1期發(fā)生停滯，抑制肝癌細胞過度增殖，從而發(fā)揮抗癌作用。李明芬等[10]將鱉甲煎丸作用于肝癌細胞SMMC-7721后，與空白對照組比較，鱉甲煎丸組肝癌細胞的G0/G1期比例增加、G2/M期與S期所占比例減少，表明其增殖活性受到明顯抑制。增殖細胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）合成并存在于細胞核內(nèi)，是DNA復(fù)制的必需物質(zhì)，參與多種DNA代謝過程，與細胞周期關(guān)系密切[16]，并有研究證實在原發(fā)性肝癌組織中PCNA陽性表達率明顯高于癌旁組織[17]。文彬等[18]動物實驗研究表明，鱉甲煎丸能夠抑制人肝癌HepG2裸鼠移植瘤組織中PCNA的表達，減少DNA的合成，阻滯肝癌細胞周期，從而抑制肝癌細胞的生長和增殖，且抑制作用與鱉甲煎丸藥物濃度呈正相關(guān)。

4 抑制肝癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移

侵襲和轉(zhuǎn)移是腫瘤的基本特征，也是癌癥患者死亡的主要原因。上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelialmesenchymal transition，EMT）參與腫瘤的發(fā)生與發(fā)展，可促進腫瘤的轉(zhuǎn)移和侵襲，是腫瘤轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。EMT主要指上皮細胞向間質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化的生物學(xué)過程，在這過程中腫瘤細胞獲得侵襲轉(zhuǎn)移的能力，其標志蛋白E-鈣黏蛋白（E-cadherin）、N-鈣黏蛋白（N-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）表達水平也發(fā)生了變化，因其過程的可逆性，可作為腫瘤治療的切入點[19]。其中，轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）信號通路是目前調(diào)控EMT的作用機制較為明確的通路，分為經(jīng)典Smad信號通路和非Smad信號通路。TGF-β在腫瘤的發(fā)生過程中具有雙重作用，在腫瘤早期階段，TGF-β通過抑制腫瘤細胞生長和誘導(dǎo)凋亡發(fā)揮抑癌作用；在腫瘤后期，細胞對TGF-β誘導(dǎo)的生長抑制產(chǎn)生抗性，此刻TGF-β加速了腫瘤EMT進程，具有促癌作用[20]。

陳煒聰?shù)萚21]研究發(fā)現(xiàn)，鱉甲煎丸可下調(diào)二乙基亞硝胺（DEN）誘導(dǎo)制作肝癌模型大鼠肝癌組織中TGF-β1的表達水平，抑制TGF-β/Smad信號通路的激活及相關(guān)通路介導(dǎo)的肝癌細胞EMT，降低癌細胞的遷移能力，從而抑制肝癌細胞的轉(zhuǎn)移侵襲。招文婷等[22]以大鼠肝卵圓細胞WB-F344為研究對象，采用TGF-β1誘導(dǎo)WB-F344細胞發(fā)生EMT，通過蛋白免疫印跡法（Western blot）檢測WB-F344細胞發(fā)生EMT時相關(guān)標志蛋白的變化發(fā)現(xiàn)，其上皮標志物E-cadherin蛋白表達水平降低，間質(zhì)標志物N-cadherin、Vimentin蛋白表達水平升高，而鱉甲煎丸可通過上調(diào)E-cadherin蛋白表達，下調(diào)N-cadherin、Vimentin蛋白表達，有效逆轉(zhuǎn)TGF-β1誘導(dǎo)WB-F344細胞的EMT改變，從而減弱WB-F344細胞遷移能力，發(fā)揮防治肝癌的作用。鐘曉丹等[23]以肝癌細胞HepG2為研究對象，同樣以TGF-β1誘導(dǎo)HepG2細胞發(fā)生EMT以構(gòu)建EMT模型，結(jié)果表明鱉甲煎丸可阻斷核轉(zhuǎn)錄因子κB（NF-κB）/Snail信號通路的激活，抑制Snail表達，提高E-cadherin表達水平，抑制HepG2細胞的EMT進程，減弱肝癌細胞的增殖和遷移能力，從而起到抗癌作用。此外，磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT）/糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β）信號通路也參與調(diào)控腫瘤細胞的EMT[24]，孫嘉玲等[25]研究證實，鱉甲煎丸通過調(diào)控肝癌細胞Hep3B細胞中PI3K/AKT/GSK-3β信號通路，上調(diào)GSK-3β的表達，下調(diào)其下游Snail蛋白表達，升高E-cadherin蛋白表達水平，降低N-cadherin蛋白表達水平，以調(diào)節(jié)肝癌細胞Hep3B的EMT改變，從而抑制肝癌細胞的侵襲轉(zhuǎn)移。

另外，Wnt/β-catenin信號通路不僅通過參與EMT的信號傳導(dǎo)干預(yù)腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移，還可調(diào)控該通路相關(guān)蛋白促進腫瘤的生長及轉(zhuǎn)移性病變。β-catenin是Wnt/β-catenin信號通路重要的信號分子，參與細胞間黏附，調(diào)控細胞生長、分化和凋亡等過程，在肝細胞癌的侵襲轉(zhuǎn)移過程中具有雙重作用：一方面，β-catenin在鈣粘連蛋白和細胞骨架連接中起重要的橋梁作用，使E-cadherin保持黏附功能；另一方面，β-catenin入核轉(zhuǎn)運可促進腫瘤細胞轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的表達，如糖蛋白Dickkopf-1（DKK-1）、基質(zhì)金屬蛋白酶-2（MMP-2）、細胞粘附分子CD44變異體6（CD44v6）、環(huán)氧合酶-2（COX-2）、T-box轉(zhuǎn)錄因子3（Tbx3）等是Wnt/β-catenin信號通路的相關(guān)靶基因，與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[26]。賀松其團隊以Wnt/β-catenin信號通路為切入點，通過多項細胞和動物實驗研究得出：鱉甲煎丸可顯著降低肝癌細胞HepG2中β-catenin表達，上調(diào)DKK-1表達[27]，下調(diào)MMP-2[6]、CD44v6[28]、COX-2[15]、Tbx3[18]表達，阻斷Wnt信號通路的信號傳遞，從而抑制肝癌細胞的侵襲轉(zhuǎn)移。

5 抑制腫瘤血管生成

腫瘤新血管的生成不僅為腫瘤的生長提供更多的氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)，還為腫瘤的轉(zhuǎn)移提供可能的血管通路，在惡性腫瘤增殖、侵襲與轉(zhuǎn)移中起關(guān)鍵作用。肝癌與血管關(guān)系密切，是典型的多血管惡性腫瘤，抗腫瘤血管生成為肝癌的治療提供了新的途徑。體內(nèi)有多種因子可以調(diào)控腫瘤血管生長，其中血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是最重要的促血管生成因子。

鄭艷等[29]使用肝癌細胞HepG2培養(yǎng)液上清培養(yǎng)人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞（human umbilical vascular endothelial cell，HUVEC）以建立體內(nèi)腫瘤血管內(nèi)皮細胞模型，結(jié)果證實鱉甲煎丸可以抑制HUVEC的異常增殖，其機制是通過阻斷Wnt/β-catenin信號通路，降低HepG2中VEGF的表達，從而抑制肝癌細胞血管生成，且抑制作用強度與藥物濃度成正相關(guān)。常欣峰等[30]研究發(fā)現(xiàn)，鱉甲煎丸可通過降低VEGF、Delta樣配體4（Dll4）蛋白表達，阻斷VEGF/Dll4-Notch信號通路，抑制腫瘤血管生成，且抑制作用隨藥物濃度的升高而逐漸加強。

6 改善腫瘤微環(huán)境

腫瘤微環(huán)境指腫瘤細胞與非腫瘤細胞及其產(chǎn)生和釋放的分子共同構(gòu)成的一種特殊生物環(huán)境，有利于腫瘤生長和轉(zhuǎn)移，在腫瘤發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮決定性作用，可作為治療腫瘤的靶點[31]。缺氧是腫瘤微環(huán)境的重要特征，與細胞增殖、血管生成、新陳代謝和腫瘤免疫反應(yīng)密切相關(guān)，可促進腫瘤的進展，增強腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移能力[32]。鐵明慧等[33]將肝癌皮下轉(zhuǎn)移瘤模型Hepa1-6小鼠隨機分為鱉甲煎丸組、貝伐單抗組，干預(yù)14 d后檢測各組腫瘤組織微血管密度計數(shù)、周細胞覆蓋率、血管基底膜面積、血管通透性、乏氧區(qū)域面積發(fā)現(xiàn)，鱉甲煎丸能夠使小鼠腫瘤血管正?；?、減少腫瘤乏氧區(qū)域面積、降低血管通透性，從而改善肝癌細胞微環(huán)境，達到抑癌作用。

持續(xù)的炎癥反應(yīng)是肝癌發(fā)生發(fā)展的重要因素，肝癌往往是由慢性肝炎或肝硬化等肝臟疾病進展而來，因此，改善炎癥微環(huán)境對肝癌的發(fā)生發(fā)展有一定抑制作用。二乙基亞硝胺（DEN）可使動物體內(nèi)產(chǎn)生自由基，造成機體氧化損傷和炎癥反應(yīng)，從而引起動物從肝纖維化至肝硬化向腫瘤的病理發(fā)展，很好地模擬了體內(nèi)持續(xù)的炎性環(huán)境對肝癌的促進作用。多項研究表明，鱉甲煎丸可通過調(diào)控NLRP3炎癥小體、IL-6/STAT3通路、下調(diào)炎癥因子表達，從而改善肝臟氧化應(yīng)激及炎癥微環(huán)境，以降低肝功能損傷，維持肝臟正常功能，延緩肝臟從肝硬化進展至肝細胞癌的進程，有效抑制癌體的生長[34-36]。

7 增強機體免疫功能

腫瘤免疫治療是一種新型癌癥療法，通過提高機體免疫系統(tǒng)功能，利用自身的免疫細胞去對抗腫瘤，以抑制或殺傷腫瘤細胞，并能引發(fā)長期的抗腫瘤免疫響應(yīng)。脾臟和胸腺都是機體的免疫器官，具有重要的免疫作用，可反映機體的免疫功能。T淋巴細胞作為重要免疫細胞，在機體的抗腫瘤免疫排斥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，參與抗腫瘤免疫主要以輔助性T淋巴細胞CD4+T淋巴細胞和抑制性T淋巴細胞CD8+T淋巴細胞為主。據(jù)報道，在腫瘤患者中CD3+、CD4+T淋巴細胞比例明顯降低，CD4+/CD8+比值也明顯下降，機體處于免疫失衡狀態(tài)[37]。羅慶東等[38]研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)鱉甲煎丸治療的H22荷瘤小鼠外周血內(nèi)CD4+T淋巴細胞比例顯著上升，CD8+T淋巴細胞比例顯著下降，糾正了CD4+/CD8+比值失衡，增強抗腫瘤免疫反應(yīng)，達到抑制腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的目的。另有研究證實，鱉甲煎丸可提高H22荷瘤鼠的脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)，增強小鼠的免疫功能，間接發(fā)揮抗腫瘤作用[12-13]。

8 其他作用機制

除上述機制外，鱉甲煎丸還有抑制肝癌干細胞增殖、與化療藥共用減毒增效等功效。腫瘤干細胞是腫瘤細胞的一個小亞群，具有影響自我更新、分化和腫瘤發(fā)生的能力，在腫瘤的發(fā)生、進展、耐藥、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用[39]。謝楊益等[40]通過免疫磁珠法分選出肝癌干細胞進行培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)，肝癌干細胞的增殖和侵襲能力較肝癌細胞均明顯提高，經(jīng)鱉甲煎丸含藥血清干預(yù)后，肝癌干細胞的增殖能力明顯受抑制，其抑制作用機制與下調(diào)Wnt/β-catenin信號通路分子表達有關(guān)。

化療是臨床治療癌癥的常用手段，然而化療藥物在殺滅癌細胞的同時，亦會損害人體的正常細胞，具有一定毒副作用，并且在長期化療后，容易出現(xiàn)多藥耐藥，降低化療效果。于笑笑等[41]研究發(fā)現(xiàn)，鱉甲煎丸聯(lián)合環(huán)磷酰胺在抑制H22小鼠肝癌細胞皮下瘤生長的同時，還能改善環(huán)磷酰胺引起的肝損害，表明常規(guī)西藥治療基礎(chǔ)上聯(lián)合鱉甲煎丸可起到增效減毒的效果。

9 結(jié)語

鱉甲煎丸作為臨床治療肝癌的中藥復(fù)方之一，其配伍嚴謹，集寒熱并用、攻補兼施、益氣活血、活血化瘀、解毒散結(jié)之功，可從多途徑、多通路、多靶點發(fā)揮抗肝癌作用，具有療效確切、副作用小等特點。雖然現(xiàn)代實驗研究已證實鱉甲煎丸治療肝癌的多種作用機制，但也存在不足之處：一是目前鱉甲煎丸抗肝癌作用機制在逆轉(zhuǎn)肝癌耐藥性方面缺少相關(guān)研究，可進一步探索鱉甲煎丸逆轉(zhuǎn)肝癌耐藥的作用；二是鱉甲煎丸抗肝癌機制研究多是細胞和動物實驗，需進一步驗證其臨床療效；三是對鱉甲煎丸抗肝癌作用機制的信號通路研究多集中于單一通路，而各通路間往往是相互聯(lián)系的，可進一步加深相關(guān)信號通路及靶點研究，從整體上闡釋其作用機制；四是鱉甲煎丸抗肝癌藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)尚未完善，中藥復(fù)方治病的關(guān)鍵不僅是單味藥物的功效，更重要的是通過君臣佐使配伍后藥物之間產(chǎn)生的協(xié)同治療作用，下一步要明確鱉甲煎丸抗肝癌的物質(zhì)基礎(chǔ)；五是多項研究表明鱉甲煎丸抗癌作用隨藥物濃度的增加而加強，但也有研究顯示低劑量鱉甲煎丸抑制血管生成作用強于高劑量鱉甲煎丸，對肝癌起最優(yōu)治療作用的藥物濃度和劑量還沒有確切標準，需進一步證實藥物的量效關(guān)系，使藥效最大化，以助于臨床更好地推廣。