超甜玉米對高蛋白納豆加工工藝及風味的影響

陳樂樂，吳雋愷，王乙伊，殷琳虹

（1.寧波職業(yè)技術學院化學工程學院，浙江寧波 315800；2.寧波大學食品與藥學學院，浙江寧波 315800）

大豆，又稱黃豆，它不僅是世界上種植最廣的農(nóng)作物之一，也是人們補充蛋白質的重要來源，蛋白質含量大約36%左右，大豆蛋白的營養(yǎng)價值與動物蛋白非常相似，被認為是人類蛋白質補充的最佳來源[1]。大豆蛋白質含量高于42%的高蛋白品種，稱之為高蛋白大豆[2?3]。大豆發(fā)酵過程中，微生物分泌的酶系與大豆發(fā)生一系列反應，蛋白質、脂類以及糖類等大分子物質被水解，生成游離的氨基酸、小肽、脂肪酸及有機酸等小分子物質，使發(fā)酵大豆擁有更加獨特的風味[4?5]。納豆發(fā)酵過程中，微生物酶系作用于大豆蛋白質將其分解為小分子，使人體對蛋白質的消化率由65%提高至80%，更有利于人們對大豆的消化與吸收[6]，從而提高大豆發(fā)酵產(chǎn)品的營養(yǎng)價值[7?8]。

納豆是日本的一種傳統(tǒng)發(fā)酵食品，從古至今已經(jīng)有了兩千年的歷史[9?11]。作為一種價格低廉、營養(yǎng)豐富的發(fā)酵豆制品，受到多數(shù)人的喜愛，其功效也是人們追捧的原因，但因納豆特殊的刺激性氨臭味[12?14]，一些消費者難以接受。為了降低納豆的氨臭味，針對納豆風味，眾多研究人員根據(jù)國人飲食習慣做了一些研究探索。

陳文珊等[15]的研究發(fā)現(xiàn)，納豆發(fā)酵前，向原材料中加入10:1的姜汁和3%的味精后再發(fā)酵，會產(chǎn)生更多香氣，顯著降低了納豆的氨味。歐陽漣等[16]對風味納豆做了初步的研究，結果表明風味納豆需添加比例為1:2的鹽和糖，并發(fā)酵40 h時最佳。張莉[17]對風味納豆的開發(fā)也作出了較為深入的研究，在納豆發(fā)酵的過程中，向其中加入蔗糖、谷氨酸鈉及茶葉等便可改善納豆的風味，并且研制出一款納豆調料包，最終的結果說明風味納豆需要經(jīng)過浸泡，在蒸煮前需添加谷氨酸鈉、茶葉和蔗糖的量分別為1%、6%和2%，而調料包則可以糖、鹽、芥末汁和醋為主要配比。李戀龍等[18]通過添加不同輔料研究出香辣、五香和泡椒三種不同風味的納豆，并發(fā)現(xiàn)納豆中加入白糖不僅能有很好的拉絲性，還能在保留納豆特有風味的同時消除納豆的氨臭味。

超甜玉米的營養(yǎng)價值和保健作用高，其糖分、蛋白質、維生素、礦物質等的含量遠高于普通玉米。超甜玉米中糖含量為20%～24%，是普通玉米的8～10倍，主要為蔗糖，水溶性糖僅占5%，淀粉含量很低，食之鮮甜香脆[19]，甜玉米鮮有被用于改善食品風味的研究。

本研究以納豆激酶酶活、揮發(fā)性鹽基氮及感官評價為指標，確定高蛋白納豆的最佳工藝，在此基礎上按不同比例添加超甜玉米以改善納豆風味，為高蛋白大豆制備納豆的加工工藝提供了理論依據(jù)，同時利用超甜玉米改善納豆風味，為改善納豆風味奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

高蛋白大豆252（蛋白含量48%） 新農(nóng)糧食種植專業(yè)合作社；納豆粉（2.94×109CFU/g） 昆山佰生優(yōu)生科技有限公司；新鮮金銀水果玉米（超甜玉米）民權縣汝明商貿有限公司；酪蛋白培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基、PBS磷酸鹽緩沖液、牛纖維蛋白原、凝血酶（>250 IU/mg）、瓊脂糖、尿激酶（5×104IU/mg） 上海源葉生物科技有限公司。

GR85DA高壓滅菌鍋 致微儀器有限公司；DPH-9012電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒科學儀器有限公司；QUINTIX125D-1CN電子天平 北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 鞏義市英峪高科儀器廠；KDN-04ABC08A凱氏定氮儀 力辰科技有限公司；LG10-2.4A高速離心機 北京醫(yī)用離心機廠；Shimadzu nexis gc2030/QP2020NX氣相色譜質譜聯(lián)機 島津有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 納豆制備工藝 a.原料處理：挑選完整、無蟲眼的大豆經(jīng)過清洗、常溫浸泡，瀝干后，再稱取一定量分裝至燒杯中然后用紗布封住燒杯口，將其置于121 ℃滅菌鍋中蒸熟并殺菌15 min。

b.接種：當處理好的黃豆降至一定溫度時，接入納豆菌粉，并將其混勻使得大豆與納豆菌充分接觸，然后再用紗布封住燒杯口。

c.發(fā)酵：接種好的大豆需放置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中進行發(fā)酵培養(yǎng)，且保持紗布濕潤。

d.后熟：發(fā)酵后的納豆放入4 ℃冰箱中后熟24 h，即得納豆成品[20?21]。

1.2.2 高蛋白大豆制備納豆單因素實驗 高蛋白大豆每組均取10 g，以納豆激酶和揮發(fā)性鹽基氮為指標，當納豆接菌量8%，發(fā)酵時間22 h，發(fā)酵溫度32 ℃時，考察不同浸泡時間（8、12、16、20、24 h）對高蛋白納豆品質的影響；當浸泡時間16 h，發(fā)酵時間22 h，發(fā)酵溫度32 ℃時，考察不同納豆菌接種量（4%、6%、8%、10%、12%）對高蛋白納豆品質的影響；當浸泡時間16 h，納豆接菌量8%，發(fā)酵溫度32 ℃時，考察不同發(fā)酵時間（18、20、22、24、26 h）對高蛋白納豆品質的影響；當浸泡時間16 h，納豆接菌量8%，發(fā)酵時間22 h時，考察不同發(fā)酵溫度（24、28、32、36、40 ℃）對高蛋白納豆品質的影響。實驗均重復三次取平均值。

1.2.3 正交優(yōu)化試驗 在單因素實驗的基礎上，設計四因素三水平的正交試驗優(yōu)化高蛋白大豆制備納豆的加工工藝，試驗因素水平見表1。

表1 正交試驗因素水平設計Table 1 Factors and levels for orthogonal tests

1.2.4 超甜玉米對納豆品質的影響 將高蛋白大豆與超甜玉米按10:0、9:1、8:2、7:3、6:4的比例（質量比）進行原料混合發(fā)酵，研究超甜玉米添加量對高蛋白納豆中納豆激酶、揮發(fā)性鹽基氮、感官品質及風味的影響。

1.2.5 納豆激酶酶活的測定 參照文獻[22]的方法進行。

1.2.6 揮發(fā)性鹽基氮的測定 參照文獻[23]的方法進行。

1.2.7 感官品質評價 邀請10名經(jīng)過專業(yè)培訓的人員對納豆進行感官評分[11]，具體感官評價標準見表2。

表2 感官評分標準Table 2 Sensory rating scale

1.2.8 風味特性測定

1.2.8.1 電子鼻PCA分析 分別稱取高蛋白大豆與超甜玉米不同比例（10:0、9:1、8:2、7:3、6:4）的納豆各2 g放置于頂空瓶內，瓶口處用保鮮膜密封，室溫下放置一段時間。然后將進樣針頭插入頂空瓶中，使用電子鼻測定[24]。

1.2.8.2 電子舌分析 分別準確稱取高蛋白大豆與超甜玉米不同比例（10:0、9:1、8:2、7:3、6:4）的風味納豆各2 g，以1:8的料液比加入50 ℃的蒸餾水，然后對樣品進行水浴加熱，50 ℃水浴鍋中水浴1 h，隨后將樣品取出，冷卻至室溫后，過濾，濾液于6000 r/min、8 ℃離心10 min，取上清液測定[25]。

1.2.8.3 GC-MS分析 稱取3 g復合納豆進行研磨，再加入6 mL蒸餾水，將其攪拌均勻。將處理好的樣品置于10 mL頂空瓶中，放入50 ℃恒溫水浴鍋中保溫20 min。柱型采用30 m×0.25 mm×0.25 μm的DB-5ms毛細管柱；柱溫的設置為初溫40 ℃，持續(xù)3 min，以5 ℃/min的速度升至150 ℃，再以10 ℃/min的速度升至250 ℃，持續(xù)10 min，然后以20 ℃/min的速度升至260 ℃，持續(xù)1 min；其中進樣口的溫度為250 ℃，進樣方式采用不分流進樣，載氣He，流量為1.0 mL/min。離子源溫度200 ℃，電離方式EI，電子能量70 eV，燈絲電流150 μA，掃描質量范圍33～500 m/z[26]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每組試驗均進行三次平行，試驗數(shù)據(jù)通過Microsoft Excel及SPSS statistics 22.0分析，采用Origin 9.1軟件進行作圖。

2 結果與分析

2.1 高蛋白大豆發(fā)酵納豆制備工藝的研究

2.1.1 浸泡時間對高蛋白大豆發(fā)酵納豆品質的影響

納豆激酶是由納豆芽孢桿菌分泌的相當重要的胞外酶，通過刺激細胞產(chǎn)生纖溶酶原的激活物以此激活纖溶酶分解纖維蛋白[27]。揮發(fā)性鹽基氮指氨及胺類堿性含氮物質，能一定程度上反映納豆的氨臭味大小[27]。

由圖1可以看出，高蛋白大豆的浸泡時間對納豆制取工藝的影響顯著（P<0.05）。隨著浸泡時間的延長，納豆激酶酶活呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢，當浸泡時間達到16 h時，納豆激酶酶活達到最大值，之后酶活開始降低，同時納豆的口感也逐漸變差，這是因為黃豆浸泡時間過長會使豆子內部營養(yǎng)物質流失[28]，從而導致感官品質降低。而揮發(fā)性鹽基氮的含量則隨著浸泡時間的增長先降低后增加，即納豆的風味會因為浸泡時間的過長或過短變差，因此高蛋白大豆制備納豆的最佳浸泡時間為16 h。

圖1 浸泡時間對高蛋白納豆品質的影響Fig.1 Effect of soaking time on the quality of high protein natto

2.1.2 接種量對高蛋白大豆發(fā)酵納豆品質的影響如圖2所示，納豆菌接種量對納豆激酶酶活和揮發(fā)性鹽基氮的影響顯著（P<0.05）。納豆激酶酶活隨接種量的增加先上升再下降，當接種量為8%時，酶活達到最高值951.672 U/g，隨后接種量繼續(xù)增加，酶活開始不斷降低。這是因為當接種量較低時，納豆芽孢桿菌不能將納豆充分發(fā)酵，但當接種量達到8%時，納豆芽孢桿菌能最大程度的利用大豆中的營養(yǎng)物質，使其風味及營養(yǎng)達到最佳。而隨著接種量的不斷增加，由于營養(yǎng)物質的減少與其代謝產(chǎn)物的增加抑制了發(fā)酵過程，因此納豆激酶的酶活降低[29]；同時由于代謝產(chǎn)物的增加，揮發(fā)性鹽基氮含量逐漸降低，納豆氨味增加，接菌量8%時，達到最低63.25 mg/g，因此在接種量為8%時即可得到較好口感的高蛋白納豆又能達到高營養(yǎng)的要求。

圖2 接種量對高蛋白納豆的品質影響Fig.2 Effect of inoculum on the quality of high protein natto

2.1.3 發(fā)酵時間對高蛋白大豆發(fā)酵納豆品質的影響如圖3，隨著發(fā)酵時間的延長，納豆激酶酶活迅速增長，當發(fā)酵時間達24 h時，納豆激酶酶活達到最大961.763 U/g，之后，酶活隨時間的增加緩慢降低。因為發(fā)酵時間較短，高蛋白大豆中的營養(yǎng)物質未完全釋放，酶活較低，發(fā)酵時間過長，營養(yǎng)物質消耗殆盡，酶活因營養(yǎng)物質減少而降低[30]。因為發(fā)酵時間短則發(fā)酵不完全，大豆的營養(yǎng)物質不能被充分利用，使納豆不酥軟；繼續(xù)延長發(fā)酵時間，就會散發(fā)更多的氨味影響風味，甚至可能感染空氣中的其他雜菌，這樣就會影響到納豆營養(yǎng)物質的有效利用，所以酶活會逐漸下降。揮發(fā)性鹽基氮含量隨發(fā)酵時間的延長顯著降低（P<0.05），發(fā)酵至24 h時達到最低42.86 mg/g，隨后又升高，分析原因可能是納豆的營養(yǎng)物質隨著發(fā)酵時間的增加一直被消耗，同時不斷產(chǎn)生氨味，且伴隨著代謝產(chǎn)物的增加，揮發(fā)性鹽基氮含量也在增加，這使得納豆風味逐漸降低。發(fā)酵時間在22 h后，粘度拉絲程度明顯增加，納豆的氣味逐漸達到可接受的程度。因此可以確定出制取高蛋白納豆的最佳發(fā)酵時間為24 h。

圖3 發(fā)酵時間對高蛋白納豆的品質影響Fig.3 Effect of fermentation time on the quality of high protein natto

2.1.4 發(fā)酵溫度對高蛋白大豆發(fā)酵納豆品質的影響在浸泡時間16 h，接種量8%，發(fā)酵時間22 h的條件下，研究不同發(fā)酵溫度（24、28、32、36、40 ℃）對高蛋白納豆的納豆激酶酶活和揮發(fā)性鹽基氮的影響，如圖4所示，高蛋白納豆的納豆激酶酶活呈顯著上升的趨勢（P<0.05），當發(fā)酵溫度升高至32～40 ℃范圍內，納豆激酶酶活較高，差異不顯著（P>0.05），36 ℃時酶活達最高值972.870 U/g。這是因為溫度是影響微生物生長與代謝的重要因素[31]，36 ℃時納豆菌的代謝最旺盛，能更好地利用納豆的營養(yǎng)物質，同時揮發(fā)性鹽基氮的含量也顯著降低（P<0.05），36 ℃時，揮發(fā)性鹽基氮含量最低為56.86 mg/g，納豆氨味較少，氣味的刺激性逐漸降低，粘度拉絲效果最好，感官品質最好。

圖4 發(fā)酵溫度對高蛋白納豆的品質影響Fig.4 Effect of fermentation temperature on the quality of high protein natto

2.1.5 正交試驗 在單因素實驗的基礎上，以浸泡時間、接種量、發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度為自變量，以感官評分為指標設計四因素三水平正交試驗。正交試驗的結果與分析見表3。

表3 正交試驗結果與分析Table 3 Results and analysis of orthogonal tests

如表3所示，根據(jù)試驗結果的極差分析可知，各影響因素對復合納豆的影響程度大小為D>C>A>B，即發(fā)酵溫度（D）對納豆感官品質的影響最大，其次是發(fā)酵時間（C）和接種量（B），最后是浸泡時間（A）。通過對k值的分析可知，高蛋白大豆發(fā)酵納豆的最佳工藝為：A3B2C3D2，即浸泡時間20 h，接菌量8%，發(fā)酵時間26 h，發(fā)酵溫度36 ℃，在此條件下進行3次驗證試驗，制得的納豆感官評分97.85±0.21分。

2.2 超甜玉米對納豆品質風味的影響研究

2.2.1 原料復合比例對納豆品質的影響 從圖5中可以看出，隨著超甜玉米在高蛋白大豆中比例的提高，納豆的納豆激酶酶活和感官評分呈先上升后下降的趨勢，當原料復合比例為8:2時，酶活最高達1134.76 U/g，感官評分最高達98.85分，揮發(fā)性鹽基氮含量隨著超甜玉米占比的增多呈現(xiàn)顯著降低的趨勢（P<0.05）?？赡艿脑蚴浅鹩衩椎暮橇扛?，復合發(fā)酵的過程中，超甜玉米的糖類物質與高蛋白大豆的蛋白質相互作用，生成更多的碳水化合物，減少了游離氨的產(chǎn)生，改善了納豆風味；但隨著超甜玉米的繼續(xù)增加，玉米與大豆開始粘成一團，同時高蛋白大豆含量減少，納豆的風味被超甜玉米稀釋[32]，因此高蛋白大豆與超甜玉米復合比例為8:2時，納豆的品質最好。

圖5 復合比例對納豆品質的影響（高蛋白大豆:超甜玉米）Fig.5 Effect of compound ratio on quality of natto (high protein soybean:super sweet corn)

2.2.2 原料復合比例對納豆風味的影響

2.2.2.1 電子鼻分析 電子鼻PCA分析法是對電子鼻數(shù)據(jù)進行降維處理，將主要特征提取出來后進行線性分析，并把主要的信息保留在幾個不相關的主成分中[33]。PCA的累計貢獻率越大，則越能反映出樣品的信息，樣品對應的坐標距離越遠，則表示樣品間的風味差異越大[34]。

不同復合比例的納豆PCA分析結果如圖6所示，根據(jù)相關性矩陣模式：第一主成分貢獻率為79.33%，兩個主成分貢獻率之和為99.24%，所以這兩個成分能夠表達樣品的主要信息特征[35]。從圖中可以看出五種不同復合比例的復合納豆均可被電子鼻顯著區(qū)分。這說明試驗中復合納豆原料復合比例的不同使得其具有不同的香氣特征，并且電子鼻能根據(jù)不同香氣特點將不同復合比例的復合納豆有效區(qū)分開來。

圖6 電子鼻PCA分析圖Fig.6 PCA analysis diagram of the electronic nose

2.2.2.2 電子舌分析 電子舌采用了人工脂膜傳感器技術，能客觀的評價食品等樣品的酸味、甜味、苦味、咸味、澀味、鮮味等味覺感官指標，還能分析出苦的回味、澀的回味以及鮮的回味等[36]。

基于電子舌對不同復合原料比例的復合納豆的PCA分析，結果如圖7所示，第一主成分的貢獻率為62.79%，第二主成分的貢獻率為22.80%，總貢獻率達到了85.59%，說明這兩個主成分包含了樣品的主要信息，因此可作為樣本分析的兩個主要成分。所有納豆樣品分布在三個不同象限內，而且距離較遠，表明電子舌能夠較好地區(qū)分不同復合原料比例的復合納豆，說明對于納豆的風味改善有著較好的效果。

圖7 電子舌分析圖Fig.7 Electronic tongue analysis diagram

2.2.2.3 GC-MS分析 高蛋白大豆與超甜玉米比例為10:0、9:1、8:2、7:3、6:4的納豆使用HS-SPMEGC-MS進行揮發(fā)性風味物質的測定。對于不同原料比例的復合納豆揮發(fā)性風味物質成分分析的結果如表4所示。

高蛋白納豆共檢測出86種化合物，主要包括醇、酸、酮、酯、醛、烷烯烴等物質，其中烷烯烴的香氣閾值比較高，氣味活性越低，對納豆的風味貢獻也就越小。其中未添加超甜玉米的高蛋白納豆檢測出86種，原料比例9:1的復合納豆檢測出21種，原料比例8:2的復合納豆檢測出32種，原料比例7:3的復合納豆檢測出24種，原料比例6:4的復合納豆檢測出26種揮發(fā)性物質。從表4中可以看出揮發(fā)性化合物的數(shù)量及相對含量，納豆中占比最多的為烷烯烴，而1-辛烯-3-醇是大豆風味產(chǎn)生的重要物質[36]，具有干草香氣，來源為酶催化氧化亞油酸和亞麻酸[37]。隨著超甜玉米的添加，復合納豆的風味物質發(fā)生變化，當高蛋白大豆與超甜玉米比例為8:2時，復合納豆的風味物質最多，主要包括醇、酸、酮、醛、烷烯烴類，且與高蛋白納豆相比，產(chǎn)生氨腥味的風味物質減少，如高蛋白納豆中的嗎啉（約占5.218%）等；產(chǎn)生的主要香氣物質增多，如乙酸（約占4.284%）、2,3-丁二醇（約占4.310%）、1-辛烯-3醇（約占2.575%）等，而在高蛋白納豆中1-辛烯-3醇（約占0.204%）含量少且不含乙酸、2,3-丁二醇。說明超甜玉米的添加量對復合納豆的風味影響顯著，改善了納豆的風味，有效地降低了納豆的氨腥味。

表4 超甜玉米不同比例復合納豆中揮發(fā)性化合物的種類及相對含量Table 4 Types and relative content of volatile compounds in composite natto in different raw material ratios

3 結論

本研究首先利用高蛋白大豆發(fā)酵制備納豆，再利用超甜玉米改善納豆風味，提高人們的可接受度。在單因素實驗的基礎上設計正交試驗優(yōu)化高蛋白納豆加工工藝，在此工藝條件下改變高蛋白大豆和超甜玉米復合比例改善風味，結果表明，取10 g高蛋白大豆，浸泡時間20 h，接種量8%，發(fā)酵時間26 h，發(fā)酵溫度36 ℃的條件下制備的納豆感官品質最好，在此工藝的基礎上，高蛋白大豆和超甜玉米復合比例為8:2的條件下，納豆的納豆激酶酶活達到1134.76 U/g，揮發(fā)性鹽基氮含量32.87 mg/g，納豆的風味最好，感官品質最好，為高蛋白納豆的加工工藝和納豆風味的改善提供了理論依據(jù)。