天然低共熔溶劑提取米糠酯酶工藝優(yōu)化及其純化與酶學(xué)性質(zhì)研究

李淑婷，鄧媛元，魏振承，張 雁，唐小俊，劉 光，李 萍，趙志浩，周鵬飛, ，張名位,

（1.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部功能食品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省農(nóng)產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 510610；2.天津科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，天津 300457）

米糠是稻谷碾制精米過程的副產(chǎn)物，占稻米總重的6%～8%。米糠中含有稻米總營養(yǎng)的64%，具有極高的營養(yǎng)價(jià)值[1]，除了碳水化合物（34.1%～52.3%）、油脂（15%～22%）、蛋白質(zhì)（10%～16%）、膳食纖維（7%～11.4%），米糠還含有一系列生物活性化合物，如γ-谷維素、生育酚、植物甾醇和角鯊烯等，是一種優(yōu)質(zhì)食品原料，具有廣闊的應(yīng)用潛力[2?3]。然而，大多數(shù)米糠僅被用作家禽飼料、低成本固體燃料或直接丟棄，只有少量的被制成米糠油，造成一定的資源損失、環(huán)境污染等問題[4]。而導(dǎo)致這種情況主要原因之一是由于高活性脂質(zhì)水解酶類的存在易使米糠發(fā)生酸敗劣質(zhì)，難以作為食品原料用于食品加工生產(chǎn)，因此許多研究者都在關(guān)注米糠脂質(zhì)水解酶類的研究。

酯酶[5]屬于脂質(zhì)水解酶類，類似于脂肪酶，是具有催化酯鍵裂解和形成功能的水解酶類，歸屬于α/β-折疊水解酶類家族。酯酶具有廣泛的底物范圍、高穩(wěn)定性、高活性、不依賴輔助因子、擁有高度的區(qū)域和立體選擇性等優(yōu)勢(shì)。另外，不同來源酯酶其酶學(xué)性質(zhì)如穩(wěn)定性、底物特異性、最適pH或溫度等存在較大差異，因此酯酶在精細(xì)化工[6]、食品醫(yī)藥[7?9]、化妝品[10]等領(lǐng)域有著多樣化的應(yīng)用。目前報(bào)道采用緩沖液體系、硫酸銨沉淀法等方式對(duì)米糠酯酶進(jìn)行分離提取，這些工藝不同程度上存在操作復(fù)雜、酶易失活等問題，因此尋找一種高效、綠色且能保持米糠酯酶高活性的提取方法顯得尤為迫切[11?16]。

天然低共熔溶劑（Natural deep eutectic solvents,NADES）的概念最早于2011年由Choi等提出，是由糖類、有機(jī)酸類、氨基酸、醇類和胺類等生物體內(nèi)代謝產(chǎn)物充當(dāng)氫鍵供體（HBD）或氫鍵受體（HBA），并按照一定比例混合制備而成的均勻穩(wěn)定液體。相比傳統(tǒng)溶劑，NADES具有揮發(fā)性低、不易燃、安全無毒、可生物降解等優(yōu)勢(shì)[17?18]，在天然物質(zhì)的分離與提取[19?20]、生物催化[7,18,21]等方面具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。因此，本文合成了10種NADES，通過單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面法優(yōu)化探索米糠酯酶的最佳提取參數(shù)，進(jìn)一步純化獲得高純度米糠酯酶，并研究其酶學(xué)特性，為天然低共熔溶劑在開發(fā)米糠資源利用方面提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

米糠 廣東海納農(nóng)業(yè)有限公司；氯化膽堿、L-脯氨酸、無水蘋果酸、DL-乳酸、乙醇酸、木糖醇、尿素、乙酰胺 均為國產(chǎn)分析純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；乙二醇、甘油 分析純，天津市大茂化學(xué)試劑生產(chǎn)廠；對(duì)硝基苯酚（p-NP）乙酸酯（C2）、p-NP丁酸酯（C4）、p-NP己酸酯（C6）、p-NP辛酸酯（C8）、p-NP癸酸酯（C10）、p-NP月桂酸酯（C12）、p-NP肉豆酸酯（C14）、p-NP棕櫚酸酯（C16） 上海西格瑪奧德里奇公司。

MILLI-Q超純水處理系統(tǒng) Millipore公司；SQP電子天平 賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；N-1300V-WB旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海愛郎儀器有限公司；CytationTM5酶標(biāo)儀 美國Bio Tek 公司；AKTA Pure蛋白純化儀 美國GE公司；水平/垂直蛋白電泳儀 上海天能科技有限公司；SH10A水分計(jì) 上海菁海儀器儀表有限公司； pH計(jì) 梅特勒-托利多儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 天然低共熔溶劑的制備 采用加熱法[22]制備NADES，具體過程是按照特定摩爾比準(zhǔn)確稱取一定質(zhì)量的HBA和HBD，混合后在90 ℃下加熱至形成穩(wěn)定的透明液體，10種溶劑具體組成如下表1所示。

表1 天然低共熔溶劑的制備Table 1 Preparation of NADES

1.2.2 NADES和提取方式的篩選 參考文獻(xiàn)[23?24]中的提取方式稍作調(diào)整，對(duì)照組模式體系為米糠4 g，與30 g蒸餾水混合均勻，用1 mol/L NaOH 調(diào)pH至10.0。實(shí)驗(yàn)組模式體系為4 g米糠和30 g 10種NADES分別混合均勻。然后將體系在50 ℃提取2 h后，10000 r/min離心5 min，收集上清液待測，按照1.2.4方法測定米糠酯酶的水解活力。同時(shí)研究了體系在超聲和水浴攪拌兩種處理方式對(duì)米糠酯酶提取的影響，6種處理方法具體過程如下：方法1-水?。?0 ℃）提取2 h；方法2-超聲（50 ℃、180 W）提取2 h；方法3-先水浴提取30 min，再超聲提取30 min，循環(huán)操作2次；方法4-先超聲提取30 min，再水浴提取30 min，循環(huán)操作2次；方法5-先水浴提取60 min，再超聲提取60 min；方法6-先超聲提取60 min，再水浴提取60 min。每組實(shí)驗(yàn)平行操作3次，按照米糠酯酶活力最高篩選出合適的 NADES與提取方法進(jìn)行后續(xù)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 配制100 μg/mLp-NP 的標(biāo)準(zhǔn)母液，依次稀釋成5、10、20、40、60、80 μg/mL，在405 nm處測定吸光值。以p-NP 濃度為橫坐標(biāo)、對(duì)應(yīng)吸光值為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，回歸方程為y=27.08x+0.0015，其擬合度為R2=0.999，在5～80 μg/mL濃度范圍內(nèi)線性良好。

1.2.4 米糠酯酶水解活力的測定 米糠酯酶水解活力的測定采用p-NP 法[25]。具體測定方法為：在 96孔板中依次加入 80 μL 0.1 mol/L pH7.0 的磷酸鹽緩沖液和10 μL 10 mmol/L C8溶液，40 ℃預(yù)熱10 min，加入10 μL 待測液，反應(yīng) 5 min后，使用 100 μL 1%SDS 溶液終止反應(yīng)，在405 nm處測量吸光值。根據(jù)A405nm在p-NP 標(biāo)準(zhǔn)曲線上獲得產(chǎn)物pNP 的釋放量并計(jì)算酶活力，以一定條件下底物每分鐘被水解生成1 μmolp-NP 所需要的酶量即為一個(gè)酶活力單位，用U表示。在同等條件下實(shí)施對(duì)照實(shí)驗(yàn)。

1.2.5 提取米糠酯酶單因素實(shí)驗(yàn)與響應(yīng)面優(yōu)化

1.2.5.1 提取米糠酯酶單因素實(shí)驗(yàn) 經(jīng)過1.2.2篩選綜合考量，選取最適的NADES以及提取方式進(jìn)行米糠酯酶的提取。單因素實(shí)驗(yàn)主要考察料液比（米糠：NADES，g/g）、NADES體系的含水量、提取時(shí)間和提取溫度等實(shí)驗(yàn)因素，各組實(shí)驗(yàn)除變量條件外，稱取4 g 米糠和30 g NADES混合均勻，NADES體系的含水量為4%，50 ℃恒溫水浴提取2 h，收集上清液待測。分別改變提取操作過程中的料液比（1:30、2:30、3:30、4:30、5:30、6:30、7:30、8:30、9:30 g/g）、NADES體系的含水量（0、1%、2%、3%、4%、5%、15%）、提取時(shí)間（1、2、3、4、5 h）和提取溫度（40、50、60、70、80 ℃）等實(shí)驗(yàn)條件。按照1.2.4方法測定米糠酯酶的水解活力。以米糠酯酶的酶活力為指標(biāo)，考察提取條件變化對(duì)米糠酯酶提取效率的影響。

1.2.5.2 響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化提取米糠酯酶提取條件根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取提取時(shí)間（A）、提取溫度（B）和PG含水量（C）進(jìn)行三因素三水平的響應(yīng)面分析，對(duì)米糠酯酶提取的工藝條件進(jìn)一步優(yōu)化，實(shí)驗(yàn)因素及水平設(shè)計(jì)見表2。

表2 BBD的因素及水平Table 2 Box-Behnken design factors and levels

1.2.6 米糠酯酶的純化 米糠經(jīng)NADES提取后，離心，上層提取物使用20 mmol/L Tris-HCl（pH7.0）于4 ℃過夜透析（10 kDa），收集透析袋樣品用0.45 μm膜過濾。采用AKTA蛋白純化儀、陰離子交換樹脂HiTrapTMCaptoTMDEAE分離純化，收集純化過程中的餾分。采用碧云天蛋白測定試劑盒測定蛋白純化樣品濃度。通過 Bio-Red 垂直電泳儀分析純化酶，電泳結(jié)束后考馬斯亮藍(lán) R-250 染色，經(jīng)脫色液脫色至蛋白條帶清晰，再用凝膠成像系統(tǒng)對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析。

1.2.7 米糠酯酶酶學(xué)性質(zhì)測定

1.2.7.1 米糠酯酶底物選擇性 具體操作按照1.2.4進(jìn)行，使用純化后的米糠酯酶水解10 mmol/L不同烷烴碳鏈長的對(duì)硝基苯酚酯（C2、C4、C6、C8、C10、C12、C14、C16），結(jié)果以所測樣品最大酶活力的百分比表示，以確定其最適底物。

1.2.7.2 米糠酯酶的最適溫度及溫度穩(wěn)定性 具體操作按照1.2.4進(jìn)行，測試的溫度范圍為30～80 ℃，結(jié)果以所測樣品最大酶活力的百分比表示，確定其最適溫度。為測定其溫度穩(wěn)定性，將樣品分別在30～80 ℃孵育1 h，然后在40 ℃、pH8.0的50 mmol/L Tris-HCl緩沖液的條件下測定其殘存酶活，結(jié)果以未經(jīng)熱處理所測酶活力的百分比表示。

1.2.7.3 米糠酯酶的最適pH及其穩(wěn)定性 具體操作按照1.2.4進(jìn)行，測試pH范圍是4.0～10.0。所用緩沖液體系為50 mmol/L 檸檬酸鈉緩沖液（pH4.0～5.0）、50 mmol/L磷酸鹽緩沖液（pH6.0～7.0）、50 mmol/L Tris-HCl 緩沖液（pH8.0）和50 mmol/L Gly-NaOH 緩沖液（pH9.0～10.0）。結(jié)果以所測樣品最大酶活力的百分比表示，確定其最適pH。為測定其pH穩(wěn)定性，將等體積的緩沖液（pH4.0～10.0）與待測液混合均勻，40 ℃下孵育1 h后，測定其殘存酶活，結(jié)果以未經(jīng)緩沖液孵育時(shí)所測的酶活力的百分比表示。

1.2.7.4 米糠酯酶的有機(jī)溶劑及NADES耐受性具體操作按照1.2.4進(jìn)行，將待測液與不同溶劑（甲醇、乙酸乙酯、正丁醇、氯仿、甲苯、正己烷、PG和CG）等體積混合，40 ℃下孵育30 min，測定其殘存酶活，結(jié)果以不使用有機(jī)溶劑時(shí)所測酶活力的百分比表示。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)均進(jìn)行三次平行實(shí)驗(yàn)。響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)和數(shù)據(jù)處理采用Design expert 10；利用Origin 9.0軟件繪圖，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。所有數(shù)據(jù)通過SPSS 22 進(jìn)行單因素方差的Duncan 檢驗(yàn)，圖中字母大小寫表示不同數(shù)據(jù)組的分析，不同字母表示存在顯著性差異（P<0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 NADES及提取方法的篩選

不同的NADES具有不同的極性、溶解性等物理化學(xué)性質(zhì)，對(duì)米糠酯酶的提取效果會(huì)存在差異[20]。如圖1所示，傳統(tǒng)水提法得到的粗酶催化活性最低，而10種NADES對(duì)提取過程中米糠酯酶的催化活性一定的維持效果，其中氨基酸類NADES效果最佳，其它三類NADES表現(xiàn)次之。這可能是氯化膽堿中氯離子與氫鍵供體具有更強(qiáng)的氫鍵結(jié)合能力[21]，對(duì)米糠酯酶活性有一定的抑制作用，因此氯化膽堿類NADES（有機(jī)酸類：CMa、CLa、CGa，多元醇類：CEG、CG、CX，胺類：CU、CA）提取得到的米糠酯酶的催化活性要低于非氯化膽堿類NADES（氨基酸類：PLa、PG）。另外，同類型的NADES對(duì)米糠酯酶的提取表現(xiàn)也存在差異，如 CLa 溶劑表現(xiàn)要比 CMa溶劑效果好（提取方法 1），CG 和 CX 的表現(xiàn)比 CEG好（提取方法 1）。這是由于“滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)”乳酸、甘油和木糖醇等小分子在穩(wěn)定生物大分子結(jié)構(gòu)、作為米糠酯酶的保護(hù)物質(zhì)等方面起著重要作用[26]。綜上所述，相比水溶液提取方式，NADES提取體系能更好地維持米糠酯酶活性，且NADES組分對(duì)其活性的影響也是顯著的。比較而言，PG溶劑作為提取米糠酯酶的最佳溶劑。

圖1 不同NADES及提取方法對(duì)米糠酯酶提取的影響Fig.1 Effect of different NADES and extraction methods on rice bran esterase

在此基礎(chǔ)上，研究了不同提取方法（如攪拌、超聲和超聲輔助水浴攪拌等）對(duì)PG溶劑提取米糠酯酶的影響。結(jié)果顯示超聲處理2 h（提取方法 2）后待測液中基本無水解活力，可能原因是提取過程米糠與NADES接觸不充分，導(dǎo)致米糠中酯酶未溶出，未能提取到米糠酯酶；而攪拌（提取方法1）、超聲與水浴處理的順序及其時(shí)間不同（提取方法 3～6）對(duì)PG溶劑提取米糠酯酶的效果沒有顯著差異（P>0.05），最后考慮操作簡便性，選擇處理方式 1 即恒溫水浴攪拌2 h 對(duì)米糠酯酶進(jìn)行提取。因此，提取方式選擇恒溫水浴處理，選擇PG溶劑進(jìn)行米糠酯酶的提取。

2.2 天然低共熔溶劑提取米糠酯酶的單因素實(shí)驗(yàn)

2.2.1 料液比對(duì)米糠酯酶提取的影響 首先考察了料液比對(duì)米糠酯酶提取的影響，模式反應(yīng)混合物為30 g PG 溶劑與一定質(zhì)量的米糠混勻，在50 ℃下恒溫水浴攪拌提取2 h。由圖2 可知，隨著米糠量不斷增加，米糠酯酶的催化活性也隨之升高（P<0.05）。這可能是隨著米糠量增加，酶蛋白的提取量增加，從而使酶活力增加。當(dāng)米糠物料增加到9 g后，體系攪拌困難，故料液比不作為進(jìn)一步優(yōu)化實(shí)驗(yàn)的考慮因素，最終選擇米糠/PG=9:30（g/g）的料液比用于提取米糠酯酶。

圖2 料液比（米糠/ NADES）對(duì)米糠酯酶提取的影響Fig.2 Effect of solid-liquid ratio (rice bran/NADES) on extraction of rice bran esterase

2.2.2 天然低共熔溶劑的含水量對(duì)米糠酯酶提取的影響 PG溶劑的含水量是影響米糠酯酶提取效果的重要因素。PG含水量不同，其粘度和極性發(fā)生變化[20]，從而影響米糠酯酶的催化活性。本文共考察了不同含水量的PG溶劑對(duì)提取米糠酯酶的影響。圖3表明當(dāng)含水量從0%增加到5%時(shí)，米糠酯酶的催化活性維持在（1.60±0.03）～（1.85±0.04）U，當(dāng) PG 含水量增加到15%時(shí)，米糠酯酶活性為（0.66±0.03）U，這可能是 PG溶劑中過高的含水量破壞了 NADES 緊密連接的超分子網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)[27]，從而使米糠酯酶的提取效果變?nèi)?，催化活性大幅度喪失。故選擇3%～5%含水量的PG混合溶劑進(jìn)一步優(yōu)化。

圖3 含水量對(duì)米糠酯酶提取的影響Fig.3 Effect of water content on extraction of rice bran esterase

2.2.3 提取時(shí)間對(duì)米糠酯酶提取的影響 提取時(shí)間關(guān)聯(lián)目標(biāo)物質(zhì)是否充分溶出，并影響米糠酯酶在提取溶劑中的催化活性。本文在料液比 9:30、PG 含水量為4%的條件下，考察了處理時(shí)間對(duì)米糠酯酶提取的影響，結(jié)果如圖4 所示。在較短時(shí)間內(nèi)（0.5 h）待測液中米糠酯酶的催化活性能達(dá)到（1.55±0.05）U，且4 h內(nèi)活性均能維持良好的水平，持續(xù)5 h后米糠酯酶活性顯著喪失，酶活達(dá)到（1.27±0.04）U，可能原因是過長的提取時(shí)間作用下影響酶的穩(wěn)定性，導(dǎo)致酶活性喪失[28]，故選取3～5 h的提取時(shí)間進(jìn)一步優(yōu)化。

圖4 提取時(shí)間對(duì)米糠酯酶提取的影響Fig.4 Effect of extraction time on rice bran esterase extraction

2.2.4 提取溫度對(duì)米糠酯酶提取的影響 NADES在料液比9:30 g/g、PG含水量為4%、提取時(shí)間為4 h時(shí)，研究了不同溫度下對(duì)米糠酯酶提取的影響，結(jié)果如圖5所示。隨溫度從40 ℃升高至70 ℃，米糠酯酶的催活性均維持在較高水平，之后溫度達(dá)到80 ℃，米糠酯酶活性為（1.36±0.01）U，其活力開始顯著下降（P<0.05），說明 PG 體系能在較寬溫度范圍內(nèi)很好的保持酶活性，故選擇60～80 ℃的提取溫度進(jìn)一步優(yōu)化。

圖5 提取溫度對(duì)米糠酯酶的影響Fig.5 Effect of extraction temperature on rice bran esterase

2.3 天然低共熔溶劑提取米糠酯酶的響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

2.3.1 統(tǒng)計(jì)分析和模型擬合 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定提取時(shí)間（A）、含水量（B）、提取溫度（C）3個(gè)水平，設(shè)定3因素3水平、5次中心平行的實(shí)驗(yàn)方案。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及米糠酯酶活力的響應(yīng)值見表3。經(jīng)擬合回歸后，得到米糠酯酶活力相對(duì)于各因素實(shí)際值的二次響應(yīng)面回歸方程為：Y（U） = 0.64×A+0.19×B+0.33×C?0.092×AB+0.000053×AC+0.0041×BC?0.043×A2?0.012×B2?0.0023×C2?11.10，其顯著性與方差分析結(jié)果見表4?；貧w方程分析表可知，酯酶活力的回歸模型P<0.0001，表明回歸方程具有很高的可靠性、結(jié)果有效。R2和校正系數(shù)R2Adj分別為 0.9995 和 0.9988，失擬項(xiàng)P= 0.06773>0.05相對(duì)于純誤差不顯著，表明模型擬合度高，即實(shí)際值和預(yù)測值之間的高度一致，實(shí)驗(yàn)結(jié)果誤差對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響較小。在所有考察的因素中，提取時(shí)間、含水量、提取溫度對(duì)米糠酯酶的提取影響顯著，其中，對(duì)提取米糠酯酶的活力影響最大的是提取時(shí)間、提取溫度，其次是含水量。

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與響應(yīng)值Table 3 Response design and results of experiment

表4 響應(yīng)值的回歸方程分析Table 4 Analysis of variance (ANOVA) for hydrolysis activity

2.3.2 各因素交互影響分析 分別構(gòu)建了三維響應(yīng)面圖和等高線圖，以描繪兩個(gè)顯著性影響因素對(duì)米糠酯酶活力的影響及交互作用大小。如圖6所示，A和B、B和C的交互作用對(duì)米糠酯酶的酶活提有非常顯著影響，且 A 與B 之間響應(yīng)曲面傾斜度最高，說明提取時(shí)間和 PG 含水量之間的交互作用對(duì)米糠酯酶的提取影響最大，PG 含水量和提取時(shí)間之間的交互作用次之。根據(jù)等高線圖，B（PG 含水量）與 A（提取時(shí)間）相比，沿A（提取時(shí)間）方向的等高線密度高，故提取時(shí)間比 PG 含水量對(duì)結(jié)果的顯著性高；B（PG 含水量）與C（提取溫度）相比，沿C（提取溫度）方向的等高線密度高，故提取溫度比 PG 含水量對(duì)結(jié)果的顯著性高，說明在極低含水量（3%～5%）條件下，提取溫度和提取時(shí)間對(duì)酶活影響更大。以米糠酯酶活力最大為標(biāo)準(zhǔn)，使用Design expert 10 軟件擬合方程和方差分析結(jié)果擬合各因素的最優(yōu)提取工藝為：提取時(shí)間3.023 h，溫度73.734 ℃，含水量4.976%，所得的米糠酯酶活力的預(yù)測值為3.012 U。

圖6 米糠酯酶活力的因素交互作用Fig.6 Response surface of interaction with various factors for rice bran esterase activity

2.3.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 考慮到實(shí)際操作性，后續(xù)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)最終選取提取時(shí)間為3.0 h，溫度74.0 ℃，PG的含水量為5.0%。在最佳實(shí)驗(yàn)條件下，進(jìn)行三次平行實(shí)驗(yàn)，得到 PG 體系提取的米糠酯酶的酶活力為（2.96±0.02）U，誤差為0.07%。說明模型擬合的條件及預(yù)測值良好，可以用于進(jìn)行米糠酯酶的提取。

2.4 天然低共熔溶劑提取米糠酯酶的純化

NADES 富集相通過透析、陰離子交換柱 DEAE純化后，可以得到3個(gè)蛋白峰（圖7a）。餾分用 SDSPAGE 蛋白質(zhì)電泳分析結(jié)果如圖7b所示，在30% 洗脫液洗脫條件（泳道4）下，可以得到純度更高的條帶，其分子量約為35 kDa，結(jié)果與 Yu 等[29]報(bào)道的一致。純化后的米糠酯酶純度為1.74倍，回收率為69.40%（表5）。

圖7 米糠酯酶純化的譜圖Fig.7 Purification spectra of rice bran esterase

表5 米糠酯酶的純化Table 5 Purification of rice bran esterase

2.5 天然低共熔溶劑提取米糠酯酶的酶學(xué)特性

2.5.1 底物選擇性 為探究該酶的底物選擇性，選用碳鏈長度在2～16的pNP 底物，測定酶活力，結(jié)果如圖8所示。該酶最易水解C2底物，水解C6時(shí)仍有C2催化活性的48.41%，但對(duì)長鏈底物C10的水解能力只是C2的10.47%，對(duì)于碳鏈更長的酯（C12～C16），水解能力小于5%。由于該酶對(duì)于短鏈底物的催化活性顯著高于長鏈底物，具有典型的酯酶底物選擇性，因此該水解酶類為米糠酯酶。

圖8 不同烷烴碳鏈長的對(duì)硝基苯酚酯對(duì)樣品相對(duì)酶活力的影響Fig.8 Effect of p-nitrophenol ester with different alkane carbon chain length on the relative enzyme activity of samples

2.5.2 最適溫度和溫度穩(wěn)定性 溫度是影響酶活力的重要參數(shù)。在最適溫度下，米糠酯酶表現(xiàn)出最佳活力，溫度升高酶因變性而喪失活力。本文探究了米糠酯酶在30～80 ℃下的酶活力，以及在不同溫度下孵育1 h的熱穩(wěn)定性，結(jié)果如圖9所示。當(dāng)溫度由30 ℃上升至40 ℃，米糠酯酶活力增加，且在40 ℃表現(xiàn)出最佳活性。溫度繼續(xù)升高，米糠酯酶活性迅速降低。米糠酯酶在不同溫度下保溫1 h后，相較于未經(jīng)熱處理組，米糠酯酶活力在30～40 ℃時(shí)活性沒有顯著變化（P>0.05），表明在低溫條件下米糠酯酶具有良好的熱穩(wěn)定性。溫度高于40 ℃酶活力逐漸喪失，至80 ℃時(shí)殘存酶活約為40%。由此可知，米糠酯酶在溫度為40 ℃表現(xiàn)出最佳水解酶活，且在低溫（<40 ℃）時(shí)具有良好的穩(wěn)定性。

圖9 不同孵育溫度對(duì)樣品相對(duì)酶活力的影響Fig.9 Effect of different incubation temperature on relative enzyme activity of samples

2.5.3 最適pH和pH穩(wěn)定性 pH 是影響酶活性的重要影響因素。過酸或過堿可以使酶的空間結(jié)構(gòu)破壞，引起酶活性部位構(gòu)象的改變，進(jìn)而影響酶的活性；另外，pH改變會(huì)影響底物的解離狀態(tài)或活性部位有關(guān)基團(tuán)的解離，從而影響底物和酶分子的結(jié)合或催化，使酶活力降低。本文探討了米糠酯酶在pH4～10范圍內(nèi)的活性變化，以獲取其最適pH及pH穩(wěn)定性，結(jié)果如圖10所示。米糠酯酶的最適pH為8.0，pH的降低或升高，其活性顯著降低（P<0.05），在pH<7或pH10時(shí)，活力急劇下降，表明其為弱堿性酯酶。米糠酯酶在 pH7～9 （中性或弱堿性）時(shí)最穩(wěn)定，強(qiáng)酸或強(qiáng)堿均顯著降低活性（P<0.05），但在酸性條件下米糠酯酶顯得更不穩(wěn)定。故米糠酯酶為中性或弱堿性酶，在pH為8.0時(shí)表現(xiàn)出最佳水解酶活。

圖10 不同pH對(duì)樣品相對(duì)酶活力的影響Fig.10 Effect of different pH on relative enzyme activity of samples

2.5.4 溶劑耐受性 有機(jī)溶劑對(duì)酶活性會(huì)產(chǎn)生顯著影響，如在疏水性較強(qiáng)溶劑中酶活力較高，相反在親水性較強(qiáng)溶劑中特別是高極性溶劑體系易奪取酶分子表面的結(jié)構(gòu)水，易導(dǎo)致酶失活[30]。如圖11所示，甲苯對(duì)米糠酯酶活性無顯著性影響（P>0.05），其它溶劑均顯著降低米糠酯酶活性（P<0.05），結(jié)果表明，高極性的有機(jī)溶劑對(duì)米糠酯酶活性具有較強(qiáng)的抑制作用，低極性溶劑正己烷對(duì)米糠酯酶活性的影響較甲苯要大，研究結(jié)果與Yu等[29]報(bào)道類似。另外，NADES如PG和CG與水能以任何比例混溶，是強(qiáng)極性溶劑，但對(duì)于維持酶的穩(wěn)定性也具有積極作用，說明極性不是影響酶穩(wěn)定性的唯一關(guān)鍵因素，其他因素如溶劑分子結(jié)構(gòu)及其官能團(tuán)、酶的結(jié)構(gòu)和表面氨基酸的類型也可能發(fā)揮作用，比如PG和CG中含有如脯氨酸、甘油這一類小分子“滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)”，根據(jù)“水替代假說”[31]，即當(dāng)?shù)鞍自诟邼舛鹊拿副Ｗo(hù)劑中時(shí)，蛋白表面維持結(jié)構(gòu)的結(jié)合水的位置被這些小分子有機(jī)物所取代，而這些小分子有機(jī)物具有比水分子更低的活動(dòng)能力，能夠抵抗外界復(fù)雜條件的影響，因此米糠酯酶在PG和CG溶劑中催化活性較高極性溶劑如甲醇等溶劑高。據(jù)此可知，含有滲透調(diào)節(jié)組分的NADES盡管表現(xiàn)出強(qiáng)極性，但對(duì)于米糠酯酶活性的保持仍具有高于傳統(tǒng)強(qiáng)極性溶劑的貢獻(xiàn)作用。

圖11 不同有機(jī)溶劑對(duì)樣品相對(duì)酶活力的影響Fig.11 Effect of different organic solvents on the relative enzyme activity of samples

3 結(jié)論

本研究建立了一種 NADES 輔助水浴攪拌法提取米糠酯酶的工藝。通過單因素和響應(yīng)面試驗(yàn)，得到提取米糠酯酶的最佳條件為：在含有5%水分的脯氨酸-甘油（摩爾比1:2）溶劑體系中，水浴攪拌3.0 h，溫度74.0 ℃，米糠和溶劑料液比為9:30。與傳統(tǒng)水提法相比，NADES 法從米糠中提取米糠酯酶能更好地維持其催化活性。本文通過 DEAE 陰離子交換樹脂獲得了純度較高的米糠酯酶，其純化倍數(shù)為 1.74 倍，回收率為69.40%，分子量約為35 kDa，該酶最適底物為對(duì)硝基苯酚乙酯，最適溫度和分別pH分別是40.0 ℃、pH8.0，在30.0～40.0 ℃和pH7.0～9.0 時(shí)均保持良好的穩(wěn)定性。與傳統(tǒng)高親水性的有機(jī)溶劑比較，氯化膽堿-甘油和脯氨酸-甘油兩種 NADES 對(duì)米糠酯酶的活力有較好的維持作用。結(jié)果表明，NADES提取法是一種簡單高效、綠色環(huán)保、且有利于米糠酯酶活性保持的方法。本研究結(jié)果為進(jìn)一步深入研究米糠深加工利用以及新型溶劑在食品領(lǐng)域的應(yīng)用提供理論依據(jù)。