基于近紅外光譜的橙汁中酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌的生長(zhǎng)預(yù)測(cè)

張嘉雯，劉佳元，封雨桐，孫佳怡，周彬靜，屠 康，潘磊慶

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，江蘇南京 210095）

酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌（Alicyclobacillus acidoterrestris），又稱嗜酸耐熱菌，具有耐熱嗜酸的特性，不僅能夠有效對(duì)抗果汁加工時(shí)的高溫滅菌，而且在pH值為酸性的果汁中也可以很好的生長(zhǎng)[1]。果汁在生產(chǎn)制造的高溫滅菌時(shí)，大部分致病菌和致腐菌均能得到抑制[2]。但由于酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌的嗜酸、耐熱、產(chǎn)芽孢、強(qiáng)抗逆性等特征，其芽孢可以抵抗果汁在加工過程中的殺菌過程而存活下來，因此只要環(huán)境條件適當(dāng)，就能快速在果汁中生長(zhǎng)，影響果汁的風(fēng)味和品質(zhì)[3]。由酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌導(dǎo)致的果汁酸敗事件經(jīng)常發(fā)生，許多研究和調(diào)查結(jié)果表明，酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌廣泛分布于果蔬產(chǎn)品生產(chǎn)和加工全過程中[4]，且在大部分果汁中的含量超標(biāo)[5]。所以酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌是使得果汁劣變和敗壞的主要原因，是在果汁生產(chǎn)加工過程中需要嚴(yán)格控制的微生物[6]。芽孢萌發(fā)是細(xì)菌生長(zhǎng)和繁殖的重要環(huán)節(jié)，同時(shí)失去極端抗性[7]。在酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌代謝時(shí)會(huì)產(chǎn)生一些酸性物質(zhì)，但不會(huì)改變果汁本身的酸堿值，只在瓶底顯現(xiàn)出一定的濁度[8]。但菌體在代謝時(shí)仍會(huì)有一些次級(jí)代謝產(chǎn)物出現(xiàn)，比如2,6-二氯苯酚、鄰甲氧基苯酚和2,6-二溴苯酚，導(dǎo)致果汁發(fā)生腐敗變質(zhì)[9]。

預(yù)測(cè)微生物學(xué)是用于預(yù)測(cè)微生物對(duì)于特定環(huán)境變量反應(yīng)的數(shù)學(xué)模型[10]，可以有效的管理微生物安全風(fēng)險(xiǎn)，它依靠數(shù)據(jù)庫(kù)，并結(jié)合計(jì)算機(jī)來預(yù)測(cè)食品中微生物的生長(zhǎng)或殘余變化[11]。預(yù)測(cè)微生物模型通?？梢苑譃?類，包括一級(jí)模型和二級(jí)模型[12]。一級(jí)模型主要是用來描述時(shí)間和微生物的生長(zhǎng)數(shù)量之間的關(guān)系[13?14]，Gompertz模型、Baranyi模型及Huang模型等都是常用的初級(jí)模型[15]。二級(jí)模型是用來描述環(huán)境因素對(duì)一級(jí)模型中參數(shù)的影響，主要包含平方根模型、響應(yīng)面方程等[13?14]。腐敗菌以及一些食源性致病菌在食品生產(chǎn)、加工、儲(chǔ)存和運(yùn)輸中的變化是預(yù)測(cè)微生物學(xué)的重要研究?jī)?nèi)容。微生物生長(zhǎng)或死亡的狀況主要是通過微生物預(yù)測(cè)模型的構(gòu)建來進(jìn)行預(yù)測(cè)的，可為食品質(zhì)量安全提供重要的參考[16]。目前，國(guó)內(nèi)外關(guān)于橙汁中酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌的生長(zhǎng)預(yù)測(cè)模型的研究相對(duì)較少，主要包括平板計(jì)數(shù)法、分子生物學(xué)方法、免疫學(xué)方法等[5]，但是這些檢測(cè)手段均難以實(shí)現(xiàn)生產(chǎn)線上進(jìn)行快速識(shí)別預(yù)測(cè)及控制。

微生物預(yù)測(cè)模型已被廣泛應(yīng)用于食品領(lǐng)域，但大部分模型是在培養(yǎng)基培養(yǎng)條件下建立的[17]，不僅操作復(fù)雜，并且耗時(shí)費(fèi)力。因此更需要開發(fā)快速高效的方法來作為微生物預(yù)測(cè)模型的數(shù)據(jù)來源。近紅外光譜法是用來分析紅外光和可見光之間波長(zhǎng)范圍的一種方法，該方法操作便捷、效率高，不消耗樣品，成本較低，在同一時(shí)間可以完成多種不同化學(xué)指標(biāo)的檢測(cè)，并且在檢測(cè)過程中不會(huì)產(chǎn)生污染，已被廣泛應(yīng)用于食品檢測(cè)、微生物研究、藥物分析等多個(gè)領(lǐng)域[18]。微生物樣本的近紅外光譜由其結(jié)構(gòu)和組成信息構(gòu)成，因此，樣本的光譜與樣本的組成特性參數(shù)之間有較好的相關(guān)性[19]。目前，尚未有采用近紅外光譜技術(shù)對(duì)橙汁中酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌快速檢測(cè)的研究。

因此，本研究以橙汁為研究對(duì)象，通過測(cè)定在正?？諝鉂穸群蜌怏w成分下，4、20、40 ℃三種不同溫度橙汁中酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌的含量，來分析酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌對(duì)橙汁品質(zhì)的影響，同時(shí)利用近紅外光譜技術(shù)，結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)，建立光譜與酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌的聯(lián)系。將近紅外光譜預(yù)測(cè)的酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌菌落數(shù)作為數(shù)據(jù)來源，通過“一步法”構(gòu)建橙汁中酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌的生長(zhǎng)預(yù)測(cè)模型，并將近紅外光譜獲得預(yù)測(cè)菌落數(shù)構(gòu)建的生長(zhǎng)模型與平板計(jì)數(shù)法構(gòu)建的生長(zhǎng)模型進(jìn)行相關(guān)性分析，為橙汁生產(chǎn)加工中酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌的快速識(shí)別預(yù)測(cè)與控制提供了理論方法和技術(shù)支持，為保障橙汁加工產(chǎn)品和行業(yè)的健康、快速發(fā)展提供了參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌（Alicyclobacillus acidoterrestris） 菌種編號(hào)CMGCC 1.1801，購(gòu)買自中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，在4 ℃條件下保藏于南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院實(shí)驗(yàn)室；贛南臍橙（Citrus sinensis（L.） Osbeck） 購(gòu)自南京市玄武區(qū)蘇果超市（鐵匠營(yíng)社區(qū)店）；營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基 上海盛思生化科技有限公司；BAT培養(yǎng)基 青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司。

紫外超凈臺(tái) 蘇州蘇凈安泰有限公司；立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠；恒溫恒濕培養(yǎng)箱 南京貝蒂實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；MXW-20DL型渦旋混合儀 杭州齊威儀器有限公司；ANTARIS傅里葉變換近紅外光譜儀 美國(guó) Thermo Nicolet 公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品處理與接種 將酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌菌種轉(zhuǎn)接至營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，于40℃條件下培養(yǎng)24 h進(jìn)行活化，在相同條件下進(jìn)行二次活化后，用無菌生理鹽水將活化好的酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌制成菌懸液，并調(diào)整濃度至102～103CFU/mL，備用。

挑選大小形態(tài)一致、新鮮的臍橙，清洗、去皮、榨汁，用紗布過濾裝于玻璃瓶中，采用巴氏殺菌法進(jìn)行滅菌處理[5]。在無菌環(huán)境下，將活化的酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌菌懸液接入橙汁，并用10 mL的離心管進(jìn)行分裝，使用封口膜進(jìn)行封口處理，置于4、20、40 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中分別貯藏288、120、46 h。貯藏過程中在合適的時(shí)間間隔取出5個(gè)橙汁樣品用于近紅外光譜檢測(cè)和微生物含量檢測(cè)。

1.2.2 微生物含量的測(cè)定 在無菌環(huán)境下，將每10 mL的樣品放置于無菌袋中，加入90 mL生理鹽水緩沖液，使用渦旋混合儀混合均勻，獲得酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌懸液。按照一定的稀釋度進(jìn)行稀釋，選擇2～3個(gè)合適的梯度，取100 μL涂布于BAT培養(yǎng)基上，于40 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（48±1） h后進(jìn)行平板計(jì)數(shù)。

1.2.3 近紅外光譜掃描與采集 將 Antaris Ⅱ 傅里葉變換近紅外光譜儀調(diào)整到透射模式，進(jìn)行樣本近紅外光譜數(shù)據(jù)的采集。采集光譜前以空氣為背景進(jìn)行背景光譜采集，取不同溫度下的橙汁樣本進(jìn)行近紅外透射光譜的掃描，每個(gè)樣本重復(fù)采集3次，取其平均光譜作為該樣本的原始光譜。采集光譜所用參數(shù)設(shè)置如下：掃描次數(shù)為32次，增益8x，分辨率為16 cm?1，掃描波數(shù)范圍為10000～4000 cm?1。

1.2.4 近紅外光譜數(shù)據(jù)處理與評(píng)價(jià)方法 近紅外光譜預(yù)處理可以消除尖峰、雜散光、噪聲等干擾。本文采用的預(yù)處理方法包括標(biāo)準(zhǔn)化（Autoscale）、多元散射校正（multiplicative scatter correction，MSC）、標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)變換（standard normal variate，SNV）、去趨勢(shì)化（Detrend）。其中，標(biāo)準(zhǔn)化（Autoscale）可以同時(shí)實(shí)現(xiàn)數(shù)據(jù)的中心化和標(biāo)準(zhǔn)化，主要解決各變量之間因單位不同所引起的權(quán)重不同的問題[20]；標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)變換（SNV）可以對(duì)由樣品不均勻?qū)е碌纳⑸渌鸬恼`差進(jìn)行校正；多元散射校正（MSC）作用與標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)變換（SNV）類似[21]；去趨勢(shì)化（Detrend）可以將分析集中在數(shù)據(jù)趨勢(shì)本身的波動(dòng)上，消除獲取數(shù)據(jù)時(shí)產(chǎn)生的偏移對(duì)后續(xù)計(jì)算的影響。

在現(xiàn)代近紅外光譜技術(shù)中，偏最小二乘法（partial least squares，PLS）是一種被廣泛應(yīng)用的線性建模方法，此方法通過提取光譜數(shù)據(jù)的特征向量，實(shí)現(xiàn)光譜數(shù)據(jù)的壓縮和降維[22]。模型根據(jù)校正決定系數(shù)（calibration determination coefficient，Rc2）、預(yù)測(cè)決定系數(shù)（prediction determination coefficient，Rp2）、校正均方根誤差（root mean square error of calibration，RMSEC）、預(yù)測(cè)均方根誤差（root mean square error of prediction，RMSEP）和相對(duì)分析誤差 （relative percent deviation，RPD），對(duì)模型的預(yù)測(cè)性能進(jìn)行評(píng)價(jià)。當(dāng)模型的Rc2、Rp2>0.9且RMSEC與RMSEP較小時(shí)，可以認(rèn)為該模型的準(zhǔn)確度較高、性能穩(wěn)定。RPD一般用于評(píng)價(jià)模型的預(yù)測(cè)能力，RPD≥1.4表示模型可行，RPD<1.4則說明該模型不可用于實(shí)際樣品定量檢測(cè)[23]。其中，決定系數(shù)、均方根誤差和剩余預(yù)測(cè)偏差的計(jì)算公式如式（1）、（2）、（3）所示[23]。

式中：yi為樣本實(shí)測(cè)值；ya為樣本實(shí)測(cè)均值；yp為樣本預(yù)測(cè)值；SD為預(yù)測(cè)集酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌含量的標(biāo)準(zhǔn)差。

1.2.5 “一步法”建模與模型評(píng)價(jià)

1.2.5.1 一級(jí)模型 傳統(tǒng)的微生物預(yù)測(cè)建模一般使用兩步法，即分別構(gòu)建一級(jí)模型和二級(jí)模型，在數(shù)據(jù)分析時(shí)會(huì)產(chǎn)生較大的誤差。“一步法”是以微生物生長(zhǎng)數(shù)據(jù)的整體優(yōu)化分析為基礎(chǔ)，同時(shí)構(gòu)建一級(jí)模型和二級(jí)模型，誤差較兩步法更小，對(duì)微生物的生長(zhǎng)預(yù)測(cè)也更為準(zhǔn)確。因此，“一步法”在預(yù)測(cè)微生物學(xué)建模中更有優(yōu)勢(shì)[24]。

酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌在橙汁中的生長(zhǎng)曲線呈現(xiàn)滯后期、指數(shù)期和穩(wěn)定期三個(gè)階段，因此，選取Huang模型[25?26]和No-lag phase模型[27?28]作為一級(jí)模型來描述酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌在橙汁中的生長(zhǎng)，Huang模型的方程見式（4）、（5）和（6），No-lag phase模型的方程見式（7）。

式中， Ymax為細(xì)菌最大生長(zhǎng)濃度（lg CFU/mL）；Y為t時(shí)刻細(xì)菌的濃度（lg CFU/mL）；Y0為初始階段細(xì)菌的生長(zhǎng)濃度（lg CFU/mL）； μmax為細(xì)菌最大生長(zhǎng)速率（h?1）；t為時(shí)間（h）；h0為細(xì)菌所處的狀態(tài)；A、α、m為系數(shù)。

1.2.5.2 二級(jí)模型 分別采用Full temperature range Ratkowsky平方根模型[29]和Suboptimal Ratkowsky平方根模型[30]作為二級(jí)模型來評(píng)價(jià)橙汁中酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌生長(zhǎng)速率受溫度的影響。其中Full temperature range Ratkowsky平方根模型的方程見式（8），Suboptimal Ratkowsky平方根模型的方程見式（9）。

式中，μmax為 細(xì)菌最大生長(zhǎng)速率（h?1）；T0為細(xì)菌最低生長(zhǎng)溫度（℃）；Tmax為細(xì)菌最高生長(zhǎng)溫度（℃）；a、為系數(shù)，Ratkowsky 平方根估測(cè)的T0只是理論意義上的最低存活溫度，一般來說會(huì)低于細(xì)菌在實(shí)際生長(zhǎng)環(huán)境中的最低生長(zhǎng)溫度。

1.2.5.3 評(píng)價(jià)方法 通過均方誤差（mean square error，MSE）、均方根誤差（root mean square error，RMSE）、赤池信息準(zhǔn)則（akaike information criterion，AIC值）[31]評(píng)價(jià)模型的適用性及擬合度，其計(jì)算公式如式（10）、（11）、（12）所示。

式中，n為實(shí)測(cè)值的數(shù)量；RSS為殘差平方和；p為模型參數(shù)數(shù)量。

選取2組恒定溫度（4、20、40 ℃）條件下的生長(zhǎng)數(shù)據(jù)來構(gòu)建和驗(yàn)證模型及參數(shù)的準(zhǔn)確性，并采用準(zhǔn)確因子（accuracy factor，Af）和偏差因子（bias factor，Bf）來評(píng)價(jià)模型的可靠性[32]。Af和Bf按式（13）、（14）計(jì)算。

式中：N實(shí)測(cè)為 菌落數(shù)的實(shí)測(cè)值（CFU/mL）；N預(yù)測(cè)為菌落數(shù)的預(yù)測(cè)值（CFU/mL）；n為實(shí)驗(yàn)次數(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

本研究采用Matlab R2016a和WPS office Excel分析軟件處理近紅外光譜數(shù)據(jù)；采用預(yù)測(cè)微生物學(xué)專用軟件IPMPGlobalFit對(duì)橙汁中酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌的生長(zhǎng)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合處理，并用OriginPro軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 近紅外定量模型的建立

三個(gè)溫度（4、20、40 ℃）的橙汁樣品原始透射光譜如圖1所示。在4000～10000 cm?1波長(zhǎng)范圍內(nèi)，不同溫度的橙汁樣品表現(xiàn)出基本相同的光譜形態(tài)，趨勢(shì)基本一致。近紅外光譜反映的是含氫基團(tuán)X-H（X=C、N、O）振動(dòng)的倍頻吸收與合頻吸收[33]，游離OH基團(tuán)吸收峰在3590～3650 cm?1處。由圖1知，在波長(zhǎng)8000和10000 cm?1附近有明顯的吸收峰，且峰值處透光率不同，8500～9000 cm?1有明顯的伸縮振動(dòng)，避開了水分子吸收峰的干擾。

圖1 三個(gè)溫度下橙汁樣品的透射近紅外光譜圖Fig.1 Transmission near-infrared spectra of orange juice samples at three temperatures

為了比較不同的預(yù)處理方法對(duì)三個(gè)溫度橙汁樣品中酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌預(yù)測(cè)模型性能的影響，將三個(gè)溫度的橙汁樣品所測(cè)得的光譜數(shù)據(jù)合并處理。三個(gè)溫度橙汁樣品在光譜掃描和微生物實(shí)驗(yàn)的過程中存在少數(shù)樣品測(cè)量結(jié)果異常，本研究采用主成分分析法（Principal components analysis，PCA）對(duì)三個(gè)溫度橙汁樣品光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行進(jìn)行異常值剔除，以提高模型準(zhǔn)確度。

按照校正集與驗(yàn)證集之比近似為3:1的比例多次運(yùn)行Matlab自帶的隨機(jī)算法以獲取較好的分集結(jié)果，其中60個(gè)樣本組成校正集，另外20個(gè)樣本組成驗(yàn)證集。如表1所示，三個(gè)溫度的橙汁樣品校正集的酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌含量最小值為2.259 lg CFU/mL，最大值為5.449 lg CFU/mL，平均值為4.233 lg CFU/mL，標(biāo)準(zhǔn)差為0.479 lg CFU/mL。

表1 三個(gè)溫度的橙汁樣品校正集與驗(yàn)證集的酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌含量Table 1 Content of Alicyclobacillus acidoterrestris in the calibration set and validation set of orange juice samples at three temperatures

采用Autoscale、MSC、SNV、Detrend光譜預(yù)處理后分別建立PLS預(yù)測(cè)模型，為后續(xù)生長(zhǎng)擬合提供參考。其中三個(gè)溫度的橙汁樣品中酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌含量的PLS模型預(yù)測(cè)效果如表2所示。

表2 三個(gè)溫度的橙汁樣品中酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌PLS模型的預(yù)測(cè)結(jié)果Table 2 Results of PLS model for Alicyclobacillus acidoterrestris in orange juice samples at three temperatures

由表2和圖2可以看出，預(yù)處理方法不同，對(duì)原始光譜的影響效果也有所不同，選擇合適的預(yù)處理方法才能夠改善模型的性能。與橙汁樣品原始光譜建模效果相比，由MSC和SNV預(yù)處理后模型的Rc2值優(yōu)于原始光譜建模，但是由MSC和SNV預(yù)處理后模型的Rp2和RPD值均不如原始光譜建模，預(yù)測(cè)效果不佳。但用Autoscale和Detrend處理后的光譜所建立的模型Rp2值均優(yōu)于原始光譜模型，模型RPD均在1.5～2.0之間，預(yù)測(cè)結(jié)果較好。綜合比較得出Autoscale預(yù)處理方法建立的模型預(yù)測(cè)性能相對(duì)較佳。

圖2 Autoscale-PLS模型估計(jì)的酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌含量測(cè)量值和預(yù)測(cè)值的散點(diǎn)圖Fig.2 Scatter plots of measured values and predicted values of Alicyclobacillus acidoterrestris contents estimated by Autoscale-PLS model

利用近紅外光譜建立預(yù)測(cè)模型提供便捷、準(zhǔn)確的無損檢測(cè)方法，具有廣泛的應(yīng)用前景。王軍[34]利用近紅外光譜建立的線性判別模型對(duì)蘋果汁中不同嗜酸耐熱菌鑒別，準(zhǔn)確率達(dá)到93.75%，表明傅里葉變換紅外光譜結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)分析可以對(duì)嗜酸耐熱菌不同菌株進(jìn)行快速準(zhǔn)確的鑒別。楊康[35]建立了嗜酸耐熱菌的紅外快速檢測(cè)模式，并且對(duì)嗜酸耐熱菌胞內(nèi)的脂肪酸進(jìn)行紅外分析，研究表明通過紅外光譜特征可以對(duì)嗜酸耐熱菌進(jìn)行快速鑒定和檢測(cè)。Mengshi等[36]研究發(fā)現(xiàn)使用近紅外光譜技術(shù)可以快速判別果汁是否被脂環(huán)酸芽孢桿菌污染。張亮[37]利用近紅外光譜分析技術(shù)研究了鮮榨蘋果汁和濃縮蘋果汁中展青霉素的定性定量檢測(cè)，用矢量歸一法預(yù)處理光譜得到鮮榨蘋果汁中展青霉素檢測(cè)模型的決定系數(shù)為0.921，內(nèi)部交叉檢驗(yàn)的預(yù)測(cè)集決定系數(shù)為0.907，RMSEP為0.264 μg/L；用最大最小歸一化法預(yù)處理光譜得出濃縮蘋果汁中展青霉素檢驗(yàn)?zāi)Ｐ偷臎Q定系數(shù)為0.935，內(nèi)部交叉檢驗(yàn)的預(yù)測(cè)集決定系數(shù)為0.927，RMSEP為0.532 μg/L，研究表明近紅外光譜分析技術(shù)能夠用于鮮榨蘋果汁和濃縮蘋果汁中展青霉素的快速檢測(cè)。

本研究發(fā)現(xiàn)三個(gè)溫度的橙汁樣品中酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌的原始光譜建立的PLS模型Rp2為0.677，RMSEP為0.269 lg CFU/mL，RPD為1.726；4種不同預(yù)處理方法中，Autoscale預(yù)處理光譜后建立的PLS模型的效果相對(duì)較好，Rp2為0.733，RMSEP為0.242 lg CFU/mL，RPD為1.919。說明利用近紅外光譜分析技術(shù)建立模型來預(yù)測(cè)橙汁樣品中酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌的生長(zhǎng)是可行的。

2.2 基于近紅外光譜預(yù)測(cè)菌落數(shù)的生長(zhǎng)模型構(gòu)建

酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌屬于嗜熱菌，在低溫環(huán)境生長(zhǎng)會(huì)受到抑制，所以4 ℃培養(yǎng)初期，橙汁樣品中酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌的數(shù)量增長(zhǎng)不太明顯，僅在培養(yǎng)后期有所增加，但生長(zhǎng)曲線不完整。當(dāng)培養(yǎng)溫度為20、40 ℃時(shí)，橙汁中酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌的生長(zhǎng)比較迅速，其生長(zhǎng)曲線完整，包括遲滯期、對(duì)數(shù)期和穩(wěn)定期三個(gè)階段。

本文使用“一步法”數(shù)值分析方法對(duì)傅里葉近紅外光譜儀預(yù)測(cè)的橙汁中酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌菌落數(shù)進(jìn)行分析擬合，即一級(jí)模型和二級(jí)模型組合直接構(gòu)建生長(zhǎng)模型。主要使用4種一級(jí)和二級(jí)模型組合后的混合模型，分別為Huang-Full temperature range Ratkowsky模型（命名縮寫為Huang-full模型）、No-lag phase-Suboptimal Ratkowsky模型（命名縮寫為Nosub模型）、No-lag phase-Full temperature range Ratkowsky模型（命名縮寫為No-full模型）、Huang-Suboptimal Ratkowsky 模型（命名縮寫為Huang-sub模型），對(duì)4、20、40 ℃條件下光譜預(yù)測(cè)菌落數(shù)的生長(zhǎng)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析時(shí)，數(shù)值分析迅速收斂。結(jié)果如表3～表6 所示。

表3 Huang-Full temperature range Ratkowsky模型參數(shù)Table 3 Parameters of Huang-Full temperature range Ratkowsky model

根據(jù)表3、表5可知，由Huang-full模型和No-full模型擬合的橙汁中酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌的最低生長(zhǎng)溫度均為10.30 ℃，最高生長(zhǎng)溫度分別為58.40和59.20 ℃。兩種模型估計(jì)的最大生長(zhǎng)濃度分別為5.41和5.47 lg CFU/mL。據(jù)表4、表6可知，由No-sub模型和Huang-sub模型擬合的橙汁中酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌的最低生長(zhǎng)溫度分別是11.20和10.70 ℃。兩種模型估計(jì)的最大生長(zhǎng)濃度分別為5.35和5.33 lg CFU/mL。據(jù)研究可知，酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌嗜酸、耐熱，是一種好氧型的革蘭氏陽(yáng)性菌，生長(zhǎng)pH范圍在2.5～6.0之間，生長(zhǎng)溫度在25～60 ℃之間[38]。楊康[35]經(jīng)過試驗(yàn)得到標(biāo)準(zhǔn)嗜酸耐熱菌的生長(zhǎng)溫度為28～60 ℃；分離嗜酸耐熱菌的生長(zhǎng)溫度為24～60 ℃，并且通過建立嗜酸耐熱菌的生長(zhǎng)模型，從標(biāo)準(zhǔn)菌株的生物量模型中預(yù)測(cè)出標(biāo)準(zhǔn)嗜酸耐熱菌的的最大生物量約為660 mg/L。馮鑫等[39]通過探索各種營(yíng)養(yǎng)因子對(duì)酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌生長(zhǎng)的影響，得出當(dāng)培養(yǎng)液不含葡萄糖時(shí)，酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌的菌體總數(shù)可達(dá)7.06 lg CFU/mL；當(dāng)培養(yǎng)基中葡萄糖濃度增加到2 g/L時(shí)，酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌的菌體總數(shù)為7.66 lg CFU/mL。唐翠娥等[6]通過研究橙汁中主要營(yíng)養(yǎng)成分對(duì)脂環(huán)酸芽孢桿菌生長(zhǎng)的影響，發(fā)現(xiàn)當(dāng)橙汁濃度為100%時(shí)，脂環(huán)酸芽孢桿菌的生長(zhǎng)濃度約為4.18 lg CFU/mL。本研究中，Huang-full模型和Nofull模型擬合出的酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌最高生長(zhǎng)溫度和文獻(xiàn)接近，且4種模型得到的最低生長(zhǎng)溫度均較低。

表4 No-lag phase-Suboptimal Ratkowsky模型參數(shù)Table 4 Parameters of No-lag phase-Suboptimal Ratkowsky model

表5 No-lag phase-Full temperature range Ratkowsky模型參數(shù)Table 5 Parameters of No-lag phase-Full temperature range Ratkowsky model

表6 Huang-Suboptimal Ratkowsky模型參數(shù)Table 6 Parameters of Huang-Suboptimal Ratkowsky model

參數(shù)MSE、RMSE、AIC是評(píng)價(jià)模型擬合精度的重要指標(biāo)，通常值越小，模型擬合的精度越高。可以看出，Huang-sub模型和No-full模型的RMSE、MSE、AIC相近，無顯著差異，可以認(rèn)為這2種模型可以較好的擬合近紅外預(yù)測(cè)橙汁中酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌的生長(zhǎng)曲線。結(jié)果表明除No-sub模型，其他3種模型均能很好地?cái)M合酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌的生長(zhǎng)，且Huang-full模型的3種指標(biāo)相較更小，所以擬合的精度最高。因此相較于其它模型，Huang-full模型更適合描述溫度對(duì)橙汁樣品中酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌生長(zhǎng)的影響。將近紅外光譜獲得預(yù)測(cè)菌落數(shù)構(gòu)建的四種生長(zhǎng)模型與平板計(jì)數(shù)法構(gòu)建的生長(zhǎng)模型分別進(jìn)行相關(guān)性分析，可以看出Huang-full模型構(gòu)建的相關(guān)性最高，r為0.963；No-sub模型構(gòu)建的相關(guān)性最低，r為0.907。總的來說，4種模型的相關(guān)系數(shù)均大于0.900，且Huang-full模型的擬合效果最優(yōu)。因此，可以判斷基于近紅外光譜預(yù)測(cè)菌落數(shù)建立的生長(zhǎng)模型，可以代替基于平板計(jì)數(shù)構(gòu)建橙汁中酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌的生長(zhǎng)模型。

根據(jù)近紅外預(yù)測(cè)的橙汁在4、20、40 ℃條件下貯藏過程中酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌的菌落數(shù)，分別利用Huang-full模型、No-sub模型、No-full模型和Huang-sub模型擬合得到生長(zhǎng)曲線（如圖3所示）。隨著培養(yǎng)溫度的升高，菌群從遲滯期進(jìn)入對(duì)數(shù)期的時(shí)間縮短，對(duì)數(shù)期內(nèi)菌群的生長(zhǎng)速率也隨著溫度的升高而增大。

圖3 4種模型在不同溫度條件下擬合的近紅外光譜預(yù)測(cè)橙汁中酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌的生長(zhǎng)曲線Fig.3 Growth curves of Alicyclobacillus acidoterrestris in orange juice predicted by NIR spectra under different temperature conditions by four models

對(duì)近紅外光譜獲得預(yù)測(cè)菌落數(shù)構(gòu)建的模型進(jìn)行驗(yàn)證，驗(yàn)證結(jié)果見表7。計(jì)算得出4種模型在各恒定溫度（4、20、40 ℃）條件下，近紅外光譜預(yù)測(cè)得到的橙汁中酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌菌落數(shù)的Af和Bf值。由表7可知，所建立的模型Af在1.014～1.103之間，Bf在0.971～1.074之間，且都較接近1.000，說明本實(shí)驗(yàn)所建立的模型可靠性和穩(wěn)定性較高。因此，4種模型在3個(gè)貯藏溫度下都具有較好的擬合效果，可以較好地預(yù)測(cè)橙汁中酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌在不同貯藏溫度下菌落總數(shù)的變化。說明近紅外光譜技術(shù)能夠較為準(zhǔn)確的預(yù)測(cè)橙汁中酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌的菌落總數(shù)，且基于預(yù)測(cè)菌落數(shù)構(gòu)建的模型較為穩(wěn)定。

表7 4種模型在不同溫度條件下的驗(yàn)證結(jié)果Table 7 Validation results of four models under different temperature conditions

3 結(jié)論

研究基于橙汁中酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌在4、20、40 ℃這3個(gè)溫度下的近紅外光譜和平板菌落計(jì)數(shù)法獲得的微生物信息，采用“一步法”對(duì)近紅外光譜預(yù)測(cè)的橙汁中酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌的生長(zhǎng)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，分別建立了Huang-full模型、No-sub模型、No-full模型和Huang-sub模型。結(jié)果表明，4種預(yù)測(cè)模型的MSE值介于0.0046～0.0300 lg CFU/mL之間；RMSE值介于為0.068～0.173 lg CFU/mL之間；AIC值介于?66.383～?53.944之間，且Huang-full模型的3種指標(biāo)相較更小，所以是描述橙汁中酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌生長(zhǎng)的最適模型，在不同溫度條件下擬合度都較好。將近紅外光譜獲得預(yù)測(cè)菌落數(shù)構(gòu)建的4種生長(zhǎng)模型與平板計(jì)數(shù)法構(gòu)建的生長(zhǎng)模型分別進(jìn)行相關(guān)性分析，其相關(guān)系數(shù)均大于0.900，且Huangfull模型的擬合效果最優(yōu)。因此，可以證明基于近紅外光譜預(yù)測(cè)菌落數(shù)建立的生長(zhǎng)模型，可以代替基于平板計(jì)數(shù)構(gòu)建橙汁中酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌的生長(zhǎng)模型。所構(gòu)建的模型通過Af和Bf值進(jìn)行驗(yàn)證，證實(shí)模型均具有良好的可靠性。研究結(jié)果為有效監(jiān)控橙汁中酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌污染提供一定的參考，但在實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用中，橙子品種、生產(chǎn)工藝波動(dòng)等因素均有可能引起橙汁中的各成分的含量波動(dòng)，若含量波動(dòng)超出所建立的近紅外模型范圍，則會(huì)影響模型的預(yù)測(cè)精度。