放養(yǎng)密度對IPRA養(yǎng)殖太湖魴鲌生長、抗氧化酶及腸道微生物群落的影響

李 倩 孫麗慧 姜建湖 陳建明 郭建林 高令梅 張海琪

(農(nóng)業(yè)部淡水漁業(yè)健康養(yǎng)殖重點實驗室, 浙江省淡水水產(chǎn)研究所, 湖州 313000)

池塘內(nèi)循環(huán)流水養(yǎng)殖(In-pond Raceway aquaculture, IPRA)于20世紀(jì)90年代由美國奧本大學(xué)開發(fā)[1], 于2013年引進(jìn)我國, 已在我國較多地區(qū)得到推廣。該系統(tǒng)通過現(xiàn)代土建工程對池塘進(jìn)行改造, 利用占池塘面積5%左右的水面作為養(yǎng)殖區(qū), 其余95%的水面作為凈化區(qū), 實現(xiàn)池塘高密度養(yǎng)殖和水體循環(huán)利用。和傳統(tǒng)養(yǎng)殖模式相比, IPRA具有水體利用率高、產(chǎn)量高、管理方便等優(yōu)點[2]。截至2019年, 全國已建成IPRA養(yǎng)殖系統(tǒng)2000條以上, 浙江省于2015年引進(jìn)該模式并進(jìn)行示范推廣, 全省跑道保有量超900條, 總體規(guī)模位居全國第二[3,4]。目前, 已有較多學(xué)者報道了有關(guān)IPRA在養(yǎng)殖模式、水環(huán)境變化、品質(zhì)影響[5—8]等方面的研究。

養(yǎng)殖密度是影響集約化養(yǎng)殖產(chǎn)量、收益和生態(tài)效益的重要因素, 養(yǎng)殖密度過低會降低資源利用率也不利于魚類群體行為的形成[9]。養(yǎng)殖密度過高會影響?zhàn)B殖對象的生長、造成應(yīng)激反應(yīng), 增大養(yǎng)殖風(fēng)險[10]。目前, 已有研究報道了IPRA養(yǎng)殖大口黑鱸(Micropterus salmoides)[3]、羅非魚(Oreochromis niloticus)[11]、團(tuán)頭魴(Megalobrama amblycephala)[12]和草魚(Ctenopharyngodon idella)[13]等品種的適宜密度。太湖魴鲌以翹嘴鲌為母本、三角魴為父本,經(jīng)群體選育和異源雌核發(fā)育技術(shù), 通過遠(yuǎn)緣雜交獲得的國家水產(chǎn)新品種(GS-02-001-2017), 具有食性雜、飼料轉(zhuǎn)化率高、肌間刺少等優(yōu)點[14], 適合池塘內(nèi)循環(huán)流水養(yǎng)殖。目前, 有關(guān)太湖魴鲌的研究主要涉及腸道微生物、基因克隆、肌肉品質(zhì)和飼料營養(yǎng)等方面[15—18], 但有關(guān)IPRA系統(tǒng)養(yǎng)殖太湖魴鲌的最佳密度尚有待于確定。本研究以太湖魴鲌幼魚為研究對象, 探討了放養(yǎng)密度對太湖魴鲌生長、抗氧化酶和腸道微生物群落的影響, 旨在進(jìn)一步探討IPRA養(yǎng)殖模式下太湖魴鲌的合理放養(yǎng)密度, 為太湖魴鲌IPRA養(yǎng)殖提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗魚為本所自行繁育的太湖魴鲌冬片魚種,平均初始體重為(5.58±0.45) g。試驗跑道位于浙江省淡水水產(chǎn)研究所八里店綜合試驗基地, 長22 m,寬5 m, 高 2.0 m, 實際水深1.7 m。試驗設(shè)置3個放養(yǎng)密度, SD1組放養(yǎng)密度為0.5 kg/m3, SD2組放養(yǎng)密度為1.0 kg/m3, SD3組放養(yǎng)密度為1.5 kg/m3。每天早晚各投飼1次, 投飼量為魚體質(zhì)量的2%—5%, 放養(yǎng)時間為2019年4月17日, 試驗期180d。

1.2 方法

生長性能測定分別于養(yǎng)殖第90、第120、第150和第180天, 每個密度組隨機(jī)選取30尾魚, 測量其體重、體長, 解剖后取內(nèi)臟和肝臟, 稱重, 計算各組太湖魴鲌的特定生長率(SGR)、肥滿度(CF)、肝體比(HSI)、臟體比(VSI)和成活率(SR)。各指標(biāo)按下式計算:

式中,W1和W2分別為時間t1與t2時的體重(g);W肝臟表示肝臟重(g);W內(nèi)臟表示內(nèi)臟重(g);L表示體長(cm);N0表示初始魚尾數(shù),Nt為養(yǎng)殖t時間時成活的尾數(shù)。

血清酶活測定各實驗組隨機(jī)選取3尾魚,MS-222麻醉后尾靜脈采血, 在4℃, 2500 r/min 離心20min制備血清, 保存于-80℃冰箱中備用。分別測定血清總超氧化物歧化酶(T-SOD)、過氧化氫酶(CAT)、總抗氧化能力(T-AOC)和酚氧化酶(PO)活力。

肝臟組織酶活測定各實驗組隨機(jī)選取3尾魚, 解剖后取肝臟, 用預(yù)冷的0.9%生理鹽水快速沖洗, 準(zhǔn)確稱取肝臟組織, 按重量(g)∶體積(mL)=1∶9的比例加入9倍體積的生理鹽水, 在冰浴條件下機(jī)械勻漿, 在 4℃下2500 r/min低溫離心15min, 取上清液, -80℃冰箱保存?zhèn)溆?。檢測指標(biāo)為T-SOD、CAT、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)和丙二醛(MDA),以上試劑盒由南京建成生物工程研究所提供。

腸道微生物群落組成分析在試驗結(jié)束后,每個密度組隨機(jī)挑選太湖魴鲌5尾, 解剖后取全腸,剔除腸道表面的脂肪組織, 滅菌去離子水沖洗, 用無菌剪刀剪開腸道, 然后用滅菌的解剖刀輕刮腸道內(nèi)溶物, 樣本混合后保存在無菌離心管, -80℃保存,每個實驗組3個重復(fù)。細(xì)菌總DNA的提取參照Bacterial DNA Kit試劑盒(Omega, 美國)的說明步驟。16S rRNA基因測序以V3和V4區(qū)為目標(biāo)設(shè)計引物,引物序列為338F (5′-ACTCCTACGGGAGGCA GCAG-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTC TAAT-3′)。PCR采用TransGen AP221-02, 反應(yīng)體系20 μL: 5×FastPfu緩沖液4 μL、2.5 mmol/L dNTPs 2 μL、5 μmol/L上下游引物各0.8 μL、FastPfu聚合酶0.4 μL、BSA 0.2 μL、DNA模板10 ng, 補(bǔ)雙蒸水至20 μL。PCR反應(yīng)條件: 95℃ 3min; 95℃ 30s,55℃ 30s, 72℃ 45s, 27個循環(huán); 72℃延伸10min。PCR反應(yīng)在PCR反應(yīng)儀9700 (Applied Biosystems?GeneAmp?, CA, 美國)上進(jìn)行。PCR產(chǎn)物經(jīng)Beads純化后委托上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司(上海,中國)進(jìn)行高通量測序。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行差異顯著性分析,利用方差分析(ANOVA)中Duncan多重比較檢驗顯著性, 當(dāng)P＜0.05時差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 放養(yǎng)密度對太湖魴鲌生長的影響

不同放養(yǎng)密度組太湖魴鲌的生長參數(shù)見表 1。在養(yǎng)殖120d前, SD1和SD2組太湖魴鲌的體重顯著大于SD3組(P＜0.05), SD1和SD2組之間無顯著差異(P＞0.05)。養(yǎng)殖150—180d, 太湖魴鲌的體重隨著養(yǎng)殖密度的增加顯著降低(P＜0.05)。不同放養(yǎng)密度組太湖魴鲌的CF、HSI和VSI在養(yǎng)殖120d前無顯著差異(P＞0.05)。養(yǎng)殖150—180d, SD2和SD3組的CF和VSI顯著低于SD1組(P＜0.05), 而SD2和SD3組之間無顯著差異(P＞0.05)。養(yǎng)殖150d前無發(fā)病和死亡現(xiàn)象, 太湖魴鲌的存活率均為100%, 養(yǎng)殖后期存活率隨著放養(yǎng)密度增加有所降低。

表1 不同放養(yǎng)密度組太湖魴鲌的生長參數(shù)(平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤, n=30)Tab. 1 Growth parameters of hybrid strain at different stocking densities (mean±SE, n=30)

如圖 1所示, 養(yǎng)殖90—120d, SD1和SD2組SGR顯著大于SD3組(P＜0.05), SD1和SD2組之間無顯著差異(P＞0.05)。養(yǎng)殖150—180d, 各實驗組的SGR隨著放養(yǎng)密度的增加顯著降低, 即SD3＜SD2＜SD1(P＜0.05)。

圖1 各密度組太湖魴鲌SGR曲線Fig. 1 The SGR curve of hybrid strain of different stocking densities

2.2 放養(yǎng)密度對太湖魴鲌血清抗氧化酶的影響

如表 2所示, 養(yǎng)殖90d時, 血清中各抗氧化酶的活力隨著放養(yǎng)密度的增加而升高, SD3組顯著高于SD1組(P＜0.05)。養(yǎng)殖120d, SD2和SD3組抗氧化酶的活力無顯著差異(P＞0.05)。養(yǎng)殖150—180d,血清中各抗氧化酶的活力隨著放養(yǎng)密度的增加有所降低, SD3組抗氧化酶的活力顯著低于SD1組(P＜0.05)。

表2 各實驗組太湖魴鲌血清抗氧化酶活力(平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤,n=3)Tab. 2 Antioxidant enzyme activities in serum of hybrid strain at different stocking densities (mean±SE, n=3)

2.3 放養(yǎng)密度對太湖魴鲌肝臟抗氧化酶的影響

如表 3所示, 養(yǎng)殖90d, 不同密度組肝臟中TSOD和CAT的活力無顯著差異(P＞0.05), 養(yǎng)殖120d,隨著放養(yǎng)密度的增加, 肝臟中抗氧化酶的活力有所升高, SD2和SD3組顯著高于SD1組(P＜0.05)。養(yǎng)殖150—180d, 肝臟中抗氧化酶的活力隨著放養(yǎng)密度的增加有所上升, 其中GSH-Px的活力隨著放養(yǎng)密度的增加顯著升高(P＜0.05)。在養(yǎng)殖前120d, 丙二醛(MDA)水平隨著放養(yǎng)密度的升高有所降低, 養(yǎng)殖150d, MDA水平隨著放養(yǎng)密度的升高有所上升,各組間無顯著差異(P＞0.05)。養(yǎng)殖180d, SD2和SD3組的MDA含量顯著高于SD1組(P＜0.05)。

表3 各實驗組太湖魴鲌肝臟抗氧化酶活力(平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤,n=3)Tab. 3 Antioxidant enzyme activities in liver of hybrid strain at different stocking densities (mean±SE, n=3)

2.4 放養(yǎng)密度對太湖魴鲌腸道微生物群落的影響

在門水平, 各密度組太湖魴鲌腸道微生物的優(yōu)勢菌相同, 主要包含變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、藍(lán)細(xì)菌門(Cyanobacteria)和厚壁菌(Firmicutes), 其中, SD3組變形菌門的豐度比SD1和SD2組增加了33.27%(圖 2)。各密度組在屬水平的物種組成見圖 3, SD1和SD2組優(yōu)勢菌相同, 分別為norank_c_Cyanobacteria、分枝桿菌(Mycobacterium)、norank_f_Hados_Sed.Eubac.3, norank_o_PeM15。SD3組的優(yōu)勢菌發(fā)生改變, 以為氣單胞菌(Aeromonas)、假單胞菌(Pseudomonas)和分枝桿菌(Mycobacterium)屬為主要優(yōu)勢菌。對屬水平的物種組成差異性進(jìn)行分析(圖 4), 微鞘藻屬(Microcoleus)、鯨桿菌屬(Cetobacterium)、氣單胞菌屬(Aeromonas)、假單胞菌屬(Pseudomonas)和不動桿菌屬(Acinetobacter)的相對豐度在SD3組顯著高于SD1和SD2組(P＜0.05)。

圖2 各實驗組在門分類水平的細(xì)菌微生物群落組成Fig. 2 The bacterial communities in all of the samples on phylum level

圖3 各實驗組在屬分類水平的細(xì)菌微生物群落組成Fig. 3 The bacterial communities in all of the samples on genus level

圖4 各組在屬水平的差異比較Fig. 4 Comparison between different groups in the level of genus

如表 4所示, Shannon 指數(shù)可以反映群落的多樣性, 其值越大, 群落多樣性越高, Simpson 指數(shù)相反。本試驗結(jié)果表明, 隨著放養(yǎng)密度的增加, 各密度組的Shannon 多樣性指數(shù)顯著降低(P＜0.05),Simpson 指數(shù)顯著升高(P＜0.05)。所有樣品的覆蓋率均達(dá)到99%以上, 表明樣本中的所有微生物都被檢測到, 可以代表樣本的真實情況。

表4 腸道微生物樣本的多樣性指數(shù)(平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤, n=3)Tab. 4 Alpha-diversity indexes of gut microbiota in all of samples(mean±SE, n=3)

3 討論

3.1 放養(yǎng)密度對太湖魴鲌生長性能的影響

本研究結(jié)果表明, 養(yǎng)殖初期, 放養(yǎng)密度未對太湖魴鲌的肥滿度、肝體指數(shù)和臟體指數(shù)產(chǎn)生顯著影響, 這是因為養(yǎng)殖初期魚體較小, 太湖魴鲌對空間、食物的競爭較小, 養(yǎng)殖環(huán)境差異不大, 密度脅迫效應(yīng)尚未對太湖魴鲌形體指標(biāo)產(chǎn)生顯著影響。有學(xué)者研究了放養(yǎng)密度對跑道養(yǎng)殖大口黑鱸生長的影響[19], 結(jié)果表明, 養(yǎng)殖30d時, 中密度組(0.4 kg/m3)的體重和特定生長率顯著高于低密度組和高密度組。當(dāng)養(yǎng)殖時間為90—120d, 低密度組(0.2 kg/m3)生長最快, 增加養(yǎng)殖密度會顯著降低大口黑鱸的生長, 這一結(jié)果和本研究結(jié)果相同。已有研究表明, 不同魚類的養(yǎng)殖密度都有一個閾值, 當(dāng)超出閾值后, 隨著放養(yǎng)密度的增加, 魚類的攝食量、飼料轉(zhuǎn)化率會隨著密度的增加顯著降低, 魚體對水體空間、溶解氧、食物競爭增大, 抑制其生長[20-23]。本研究結(jié)果提示, 當(dāng)養(yǎng)殖時間為120d, 太湖魴鲌幼魚的放養(yǎng)密度為0.5—1.0 kg/m3時, 增加放養(yǎng)密度會提高太湖魴鲌幼魚的生長, 當(dāng)放養(yǎng)密度達(dá)到SD3設(shè)定值時, 太湖魴鲌的SGR和體重隨著放養(yǎng)密度的增加顯著下降, 根據(jù)體重推算, SD2組對應(yīng)的養(yǎng)殖密度為13.82 kg/m3, 因此, 養(yǎng)殖時間為120d時, 建議太湖魴鲌的養(yǎng)殖密度閾值為13.82 kg/m3。當(dāng)養(yǎng)殖時間超過150d, SD1組對應(yīng)的養(yǎng)殖密度為22.14 kg/m3, 增加放養(yǎng)密度會顯著降低太湖魴鲌的特定生長率和體重, 而且當(dāng)養(yǎng)殖至180d, 各密度組太湖魴鲌的存活率有所降低, 因此, 當(dāng)養(yǎng)殖時間超過150d, 建議太湖魴鲌的養(yǎng)殖密度閾值為22.14 kg/m3。

3.2 放養(yǎng)密度對太湖魴鲌血清抗氧化酶的影響

魚類的血液生化指標(biāo)是反應(yīng)魚體健康狀況的一類重要指標(biāo), 當(dāng)外界環(huán)境變化時, 其血液生化指標(biāo)會隨之改變[24,25]。SOD是清除體內(nèi)氧自由基的重要抗氧化酶, 可將魚體內(nèi)超氧自由基轉(zhuǎn)化為H2O2和O2, 而CAT可以將H2O2分解成無毒的H2O和O2[26,27]。養(yǎng)殖初期T-SOD和CAT水平的升高可能是為了保護(hù)機(jī)體免遭H2O2的傷害。T-AOC作為抗氧化能力的重要酶活, 可以反映機(jī)體的抗氧化能力。本試驗中各密度組的T-AOC活力呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢, 這可能和養(yǎng)殖后期太湖魴鲌已經(jīng)逐漸適應(yīng)養(yǎng)殖環(huán)境有關(guān), 也可能和太湖魴鲌的抗氧化能力受到抑制有關(guān)。當(dāng)養(yǎng)殖對象受到脅迫時, 細(xì)胞中的酚氧化酶原(proPO)可以轉(zhuǎn)化為酚氧化酶(PO)從而發(fā)揮免疫功能[28]。在養(yǎng)殖120d前, 高密度組PO活力的升高可能是太湖魴鲌應(yīng)對高密度脅迫的結(jié)果。但在養(yǎng)殖后期, PO活力隨著放養(yǎng)密度的增加而顯著降低, 這可能是因為受放養(yǎng)密度的脅迫,太湖魴鲌的機(jī)體免疫系統(tǒng)受到抑制, 導(dǎo)致PO的活力顯著降低。

3.3 放養(yǎng)密度對太湖魴鲌肝臟抗氧化酶的影響

肝臟是魚類重要的新陳代謝器官, 參與魚體中抗氧化、糖原合成等重要的生理過程, 已有較多研究報道了環(huán)境因子對魚類肝臟酶活的影響[29-31]。除SOD和CAT外, GSH-PX也可以通過催化GSH的氧化偶聯(lián)而去除H2O2, 可以保護(hù)細(xì)胞免受損傷[32]。本試驗結(jié)果表明, 在養(yǎng)殖初期, 太湖魴鲌肝臟中TSOD和CAT活力在各組間無顯著差異, 這可能是因為養(yǎng)殖初期魚體較小, 放養(yǎng)密度尚未對環(huán)境和魚體肝臟造成顯著負(fù)荷。在養(yǎng)殖120d后, 太湖魴鲌肝臟中抗氧化酶的活力隨著放養(yǎng)密度的增加而升高, 尤其在養(yǎng)殖中后期, SD3組肝臟中抗氧化酶的活力顯著高于SD1組, 說明隨著養(yǎng)殖時間的延長, 受放養(yǎng)密度脅迫, 魚體代謝加快, 太湖魴鲌利用肝臟中抗氧化酶活性升高以清除產(chǎn)生的大量活性氧, 以適應(yīng)密度脅迫帶來的應(yīng)激狀態(tài)。

MDA是生物體內(nèi)脂質(zhì)過氧化物的終產(chǎn)物, 毒性積累過高會引起細(xì)胞損傷。養(yǎng)殖前120d, 太湖魴鲌肝臟中MDA的含量隨著放養(yǎng)密度的升高而降低,說明在養(yǎng)殖中前期, 肝臟中抗氧化酶的水平可以清除隨著放養(yǎng)密度的升高而引發(fā)的脂質(zhì)過氧化物, 導(dǎo)致MDA含量降低。但在養(yǎng)殖后期, MDA含量隨著放養(yǎng)密度的升高而增加, 且在養(yǎng)殖180d時, SD3組和SD2組的MDA水平顯著高于SD1組。這表明隨著太湖魴鲌幼魚的生長, 密度和環(huán)境脅迫逐漸顯現(xiàn),雖然太湖魴鲌肝臟中的抗氧化酶水平有所升高, 但已不足以清除過多的脂質(zhì)過氧化物, 導(dǎo)致其肝臟中MDA水平積累, 這和頜魴幼魚的研究結(jié)果相似[33]。因此, 在養(yǎng)殖后期, 要注意高密度組太湖魴鲌肝臟細(xì)胞中MDA積累過高引起的細(xì)胞損傷。

3.4 放養(yǎng)密度對太湖魴鲌腸道微生物群落的影響

腸道微生物是腸道的重要組成部分, 在養(yǎng)殖對象的發(fā)育、消化、機(jī)體代謝方面發(fā)揮重要作用[34,35]。有報道表明, 變形菌門中的許多物種被認(rèn)為是水產(chǎn)動物的有害菌, 變形菌門的增加是疾病的潛在診斷標(biāo)志[36]。本研究結(jié)果表明, SD3組變形菌門的豐度顯著增加, 且來自變形菌門的不動桿菌屬、氣單胞菌屬及假單胞菌屬在高密度組顯著增加, 這和團(tuán)頭魴[37]的研究結(jié)果一致。不動桿菌屬、氣單胞菌屬、假單胞菌屬等是常見的病原菌, 雖然在本試驗條件下未出現(xiàn)魚體發(fā)病情況, 但病原菌數(shù)量增加可能會影響腸道健康、增加患病風(fēng)險。隨著放養(yǎng)密度的增加, SD3組腸道菌群多樣性顯著降低, 這一結(jié)果和課題組前期的研究結(jié)果一致[15]。微生物群落多樣性是維持群落穩(wěn)定的重要因素, 腸道微生態(tài)系統(tǒng)的平衡對于水產(chǎn)動物腸道健康的維持十分關(guān)鍵[38]。在本研究中, SD3組太湖魴鲌腸道微生物群落多樣性顯著降低, 且氣單胞菌屬、假單胞菌屬及弧菌屬等病原菌屬顯著增加, 表明受養(yǎng)殖密度脅迫,高密度養(yǎng)殖組微生物群落結(jié)構(gòu)發(fā)生顯著變化, 群落多樣性顯著降低, 群落均一性較差, 而微生物群落失衡對魚體會產(chǎn)生不利的影響, 因此, 要注意高密度養(yǎng)殖模式下太湖魴鲌的腸道健康。

4 結(jié)論

綜上所述, 當(dāng)養(yǎng)殖時間小于120d時, SD1和SD2組太湖魴鲌的生長性能、抗氧化酶等無顯著差異, 建議IPRA模式下太湖魴鲌幼魚的放養(yǎng)密度以1.0 kg/m3為宜; 當(dāng)養(yǎng)殖時間為150—180d時, 太湖魴鲌的體重和SGR隨著放養(yǎng)密度的增加顯著降低,建議放養(yǎng)密度不超過0.5 kg/m3。腸道微生物群落分析結(jié)果表明, 隨著放養(yǎng)密度的增加, 太湖魴鲌腸道微生物群落組成發(fā)生改變, 多樣性顯著降低, 養(yǎng)殖后期, 應(yīng)注意高密度養(yǎng)殖組太湖魴鲌的腸道健康。