富硒壺瓶碎米薺對青魚幼魚生長、生理生化、硒代謝、抗氧化及先天免疫的影響

張 辰 賈小巍 錢鵬丞 陳艷婷 吳成龍 * 葉金云 *

(1. 湖州師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院, 水生動物繁育與營養(yǎng)國家地方聯(lián)合工程實驗室, 湖州 313000; 2. 湖州師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院,浙江省水生生物資源養(yǎng)護(hù)與開發(fā)技術(shù)研究重點實驗室, 湖州師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院, 湖州 313000)

硒(Se)是魚類生長所必需的微量營養(yǎng)元素之一, 對維持機(jī)體生長和代謝方面起著重要的作用。在自然界中, 硒主要以有機(jī)硒(硒代蛋氨酸、硒代半胱氨酸等)和無機(jī)硒(亞硒酸鈉)兩種形式存在[1]。研究發(fā)現(xiàn), 硒進(jìn)入體內(nèi), 經(jīng)小腸消化后以簡單擴(kuò)散和主動運輸?shù)姆绞奖粰C(jī)體吸收[2], 在體內(nèi)合成含硒蛋白, 進(jìn)而參與提高機(jī)體抗氧化能力和免疫能力[3]。目前在中華絨螯蟹(Eriocheir sinensis)、斜帶石斑魚(Epinephelus coioides)和尖吻鱸(Lates calcarifer)等水產(chǎn)動物中已有大量關(guān)于硒的研究報道[4—6], 主要集中在硒源選擇、生長性能、代謝能力及機(jī)體免疫力等方面, 通過亞硒酸鈉和酵母硒、硒代蛋氨酸等比較發(fā)現(xiàn), 動物機(jī)體對有機(jī)硒源有更好的利用效率[7,8], 但是目前國內(nèi)外對于植物有機(jī)硒源的開發(fā)和利用等相關(guān)研究較少。

壺瓶碎米薺(Cardamine hupingshanensis)是十字花科碎米薺屬[9], 主要分布于湖南和湖北, 具有超富硒能力[10], 是一種新型的有機(jī)硒源。壺瓶碎米薺各組織均含硒, 其中葉片含硒量高達(dá)1427 mg/kg[11],且作為一種來源于植物的硒, 其來源更為廣泛, 更為易得。在壺瓶碎米薺機(jī)體中, 硒的活性物質(zhì)主要為硒代半胱氨酸[11], 直接或間接參與硒蛋白的合成,如谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)、硫氧還蛋白還原酶(TXNRD)和脫碘酶(DIO)等, 進(jìn)而在機(jī)體內(nèi)發(fā)揮其抗氧化和抗應(yīng)激等生理學(xué)功能[4,12]。飲食中硒的缺乏會導(dǎo)致硒蛋白的表達(dá)量減少, 脂質(zhì)過氧化反應(yīng)增加, 進(jìn)而對機(jī)體造成損傷[13], 而過量硒也會對機(jī)體產(chǎn)生毒副作用, 導(dǎo)致機(jī)體肝損傷和生理功能下降, 免疫能力降低甚至死亡[14]。因此, 研究飼料中添加富硒壺瓶碎米薺對水產(chǎn)動物生長及其生理指標(biāo)的影響并探究其相關(guān)機(jī)制具有較大的理論和應(yīng)用價值。

青魚(Mylopharyngodon piceus)作為我國主要淡水經(jīng)濟(jì)養(yǎng)殖品種之一, 2020年養(yǎng)殖年產(chǎn)量已達(dá)到69×107kg[15]。目前對于青魚的營養(yǎng)需求已在糖、蛋白質(zhì)、氨基酸、維生素和礦物質(zhì)等方面有較多的研究[16—18], 但是關(guān)于富硒壺瓶碎米薺對于青魚生長、代謝和免疫調(diào)控影響方面仍未見報道。近年來, 隨著青魚養(yǎng)殖行業(yè)的快速發(fā)展, 其對優(yōu)質(zhì)配合飼料的開發(fā)尤為迫切。本實驗旨在探究添加富硒壺瓶碎米薺對青魚幼魚生長、血清生理生化、肝臟硒代謝、抗氧化能力及先天免疫指標(biāo)的影響, 為其在青魚幼魚配合飼料中的科學(xué)利用奠定了理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗設(shè)計

本實驗以酪蛋白、明膠為蛋白質(zhì)源, 菜籽油為脂肪源, 在基礎(chǔ)飼料(無硒添加)組分別添加0.5、1.0和2.0 g/kg富硒壺瓶碎米薺(硒的實際含量為0.04、0.43、0.75和1.57 mg/kg), 制備成4種等氮等能的飼料, 分別以飼料1(Se 1; 對照)、飼料2(Se 2)、飼料3(Se 3)、飼料4(Se 4)表示, 實驗飼料配方及營養(yǎng)組成如表 1所示。所需原料粉碎過60目篩,按表 1進(jìn)行配比, 用雙螺桿擠條機(jī)加工并制成直徑為2.00 mm的顆粒, 置于37℃烘箱風(fēng)干, 后存于-20℃冰箱中保存。

表1 試驗飼料組成及營養(yǎng)水平Tab. 1 Composition and nutrient levels of experimental diets

1.2 實驗魚飼養(yǎng)與管理

本實驗用青魚幼魚購自浙江菱湖興旺水產(chǎn)苗種場, 正式實驗前在循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中暫養(yǎng)2周, 期間投喂未添加硒的基礎(chǔ)飼料。選取體質(zhì)健康且初始體重為(5.51±0.02) g青魚幼魚共360尾, 隨機(jī)分到12個水循環(huán)養(yǎng)殖缸, 共4個實驗組, 每組3個重復(fù), 每個重復(fù)30尾魚, 養(yǎng)殖周期60d。養(yǎng)殖期間飼料日投喂量為魚體總重的3%, 分別在8:00、12:00和17:00進(jìn)行投喂。養(yǎng)殖缸隔天換水、吸污1次用于保持水質(zhì), 養(yǎng)殖期間水溫為26.5—28.5℃, 自然光照,溶氧＞ 5.8 mg/L。

1.3 實驗樣品采集

待養(yǎng)殖實驗結(jié)束后, 統(tǒng)計每缸尾數(shù)和終末重量。用MS222麻醉后, 每缸隨機(jī)選取5尾進(jìn)行體成分分析, 同時選取15尾測量終末體重和體長, 用于分析生長指標(biāo)。通過尾部靜脈采血的方式采取血液, 2500 r/min離心15min, 取血清存于-80℃超低溫冰箱待測生理生化相關(guān)指標(biāo)。于冰上快速剖取青魚肝臟等內(nèi)臟組織, 稱重后存于凍存管中置液氮速凍, 存于-80℃超低溫冰箱用于測定其他指標(biāo)。

1.4 實驗飼料和魚體成分分析

實驗飼料水分采用105℃恒溫烘干法測定, 魚體水分采用冷凍干燥法測定(科瑞斯特 Alpha2-4 LSC Basic); 粗灰分均采用馬弗爐550℃灼燒法測定;粗脂肪均采用索氏抽提法測定; 粗蛋白均采用杜馬斯全自動快速定氮儀(艾力蒙塔 Rapid N exceed; 德國)測定。

1.5 生長性能指標(biāo)計算公式

增重率(Weight gain rate, WGR, %)=(魚體終末重量-魚體初始重量)/魚體初始重量×100

特定生長率(Specific growth rate, SGR, %/d)=(ln魚體終末重量-ln魚體初始重量)/養(yǎng)殖天數(shù)×100

飼料系數(shù)(Feed conversion ratio, FCR)= 魚攝入飼料量/(魚體終末重量-魚體初始重量)

肝體比(Hepatosomatic index, HSI)=魚肝臟重量/魚體終末重量×100

肥滿度(Condition factor, CF, g/cm3)= 魚體終末重量/魚體終末體長3×100

1.6 血清生化及肝臟抗氧化酶活性指標(biāo)的檢測

血清葡萄糖(GLU)濃度采用上海榮盛生物藥業(yè)有限公司所生產(chǎn)的試劑盒測定, 甘油三酯(TG)和總膽固醇(TCH)濃度采用浙江東甌診斷產(chǎn)品所生產(chǎn)的試劑盒測定, 高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)濃度采用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒測定, 白蛋白(ALB)、低密度脂蛋白(LDL-C)濃度和谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、堿性磷酸酶(ALP)活性均采用寧波普瑞柏生物技術(shù)股份有限公司所生產(chǎn)的試劑盒進(jìn)行檢測。

肝臟中超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT) 、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)和谷胱甘肽還原酶(GR)等相關(guān)酶活性及肝臟丙二醛(MDA)水平、總抗氧化能力(T-AOC)和還原型谷胱甘肽(GSH)含量均是采用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒進(jìn)行測定。

1.7 組織總RNA提取及cDNA反轉(zhuǎn)

利用Monzol試劑(Monad, 上海)提取青魚肝臟組織總RNA, 超微量分光光度計(Thermo, Nano-Drop2000)測定其濃度和純度。利用MonScriptTM反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Monad, 上海), 按照其操作說明進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA, 后存于-20℃冰箱中備用待測。

1.8 引物設(shè)計及熒光定量PCR

本實驗所需相關(guān)基因引物如表 2所示, 均采用Primer Premier 5軟件設(shè)計, 由生工生物工程(上海)股份有限公司合成, 其中β-actin為內(nèi)參基因。反應(yīng)體系在熒光定量PCR儀(Biorad cfx96, bio-rad,美國)進(jìn)行, 具體實驗方法及體系參考Wu等[17], 實驗結(jié)果的分析統(tǒng)計采用相對熒光定量法(2-ΔΔCt法)分析[19]。

表2 實時定量PCR引物Tab. 2 Primers for real-time quantitative PCR

1.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計及分析

實驗數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示, 采用SPSS25.0軟件進(jìn)行單因素方差分析(One-WayANOVA), 差異顯著時, 采用Duncan氏法進(jìn)行多重比較,P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 富硒壺瓶碎米薺對青魚幼魚生長性能和體組成的影響

如表 3所示, 青魚幼魚的增重率和特定生長率隨著飼料中富硒壺瓶碎米薺添加量的增加均呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢, 當(dāng)飼料中添加0.5和1.0 g/kg富硒壺瓶碎米薺時, 青魚幼魚的增重率和特定生長率均顯著高于對照組和過量組(2.0 g/kg), 同時飼料系數(shù)顯著低于對照組和過量組(2.0 g/kg;P＜0.05)。飼料中富硒壺瓶碎米薺的添加量對青魚幼魚的肝體比、肥滿度和成活率無顯著性影響(P＞0.05)。青魚魚體的水分和粗灰分不受飼料中富硒壺瓶碎米薺添加的影響, 各組間無顯著性差異(P＞0.05)。隨著飼料中富硒壺瓶碎米薺添加量的增加, 青魚魚體的粗脂肪含量呈先升高后降低的趨勢, 并在飼料其添加量為0.5 g/kg時達(dá)到最高值, 顯著高于對照組(P＜0.05)。當(dāng)飼料中富硒壺瓶碎米薺添加量為1.0 g/kg時, 青魚魚體粗蛋白含量較其他組顯著升高, 達(dá)到最高值(P＜0.05)。

2.2 富硒壺瓶碎米薺對青魚幼魚血清生理生化指標(biāo)的影響

如表 4所示, 飼料中富硒壺瓶碎米薺添加量對GLU含量和AST活性影響均呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢。與對照組相比, 飼料中添加0.5—1.0 g/kg的富硒壺瓶碎米薺可以顯著下調(diào)血清中GLU的含量,提高ALB含量, 而飼料中添加量為1.0—2.0 g/kg時,血清中的AST活性顯著下降(P＜0.05)。血清中TG、TCH和HDL-C含量呈先上升后下降的趨勢,當(dāng)飼料中富硒壺瓶碎米薺添加量為0.5 g/kg時, 血清中TG和HDL-C含量較對照組顯著上升, 而較對照組和過量組(2.0 g/kg), 飼料中添加1.0 g/kg富硒壺瓶碎米薺可顯著升高血清中TCH的含量(P＜0.05)。但是血清中ALT和ALP活性各組間無顯著性差異(P＞0.05)。

表4 飼料中富硒壺瓶碎米薺添加量對青魚幼魚血清生化指標(biāo)的影響(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差, n=3)Tab. 4 Effect of dietary selenium-rich Cardamine hupingshanensis on serum biochemical indices of juvenile black carp (mean±SD, n=3)

2.3 富硒壺瓶碎米薺對青魚幼魚肝臟硒代謝指標(biāo)的影響

如圖 1所示,SCLY和SPS1基因表達(dá)量均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢, 富硒壺瓶碎米薺添加量為0.5—1.0 g/kg時無顯著性差異(P＞0.05), 但較對照組顯著升高(P＜0.05)。SEP15、SEPT2、SEPH和SEPP基因表達(dá)量均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。SEP15基因表達(dá)量隨著飼料中富硒壺瓶碎米薺添加量的增加呈先上升后下降趨勢, 并在1.0 g/kg達(dá)到最高(P＜0.05)。SEPT2基因表達(dá)量在富硒壺瓶碎米薺添加量為1.0 g/kg時較對照組顯著升高(P＜0.05),達(dá)到最高值。SEPH基因表達(dá)量在富硒壺瓶碎米薺添加量為1.0 g/kg達(dá)到最高值, 與2.0 g/kg間無顯著性差異(P＞0.05), 較對照組顯著升高(P＜0.05)。與對照組相比, 富硒壺瓶碎米薺添加組能夠顯著提高SEPP基因表達(dá)量(P＜0.05), 并在其添加量為1.0 g/kg時達(dá)到最高, 而1.0 g/kg與2.0 g/kg組間無顯著性差異(P＞0.05)。

圖1 飼料中富硒壺瓶碎米薺添加量對青魚幼魚肝臟硒代謝相關(guān)基因表達(dá)量的影響Fig. 1 Effect of dietary selenium-rich Cardamine hupingshanensis on gene expression levels related to selenium metabolism in the liver of juvenile black carp

2.4 富硒壺瓶碎米薺對青魚幼魚肝臟抗氧化指標(biāo)的影響

如表 5所示, 飼料中富硒壺瓶碎米薺缺乏和過量對青魚幼魚肝臟中SOD、CAT活性和T-AOC、GSH含量均有顯著的抑制作用(P＜0.05), 當(dāng)飼料中富硒壺瓶碎米薺添加量為0.5 g/kg時SOD、CAT活性和T-AOC、GSH含量達(dá)到最大值。肝臟中GR活性隨著飼料中富硒壺瓶碎米薺添加量的增加呈先上升后下降的趨勢, 在其添加量為1.0 g/kg時達(dá)到最高。肝臟GSH-PX活性隨著飼料中富硒壺瓶碎米薺添加量的增加持續(xù)上升, 且各組間差異顯著(P＜0.05)。肝臟中MDA的水平隨著飼料中富硒壺瓶碎米薺的添加量呈先下降后上升的趨勢, 在其添加量為0.5 g/kg時達(dá)到最低值, 較其他組顯著降低(P＜0.05)。而飼料中富硒壺瓶碎米薺的添加對魚體肝臟GST活性無顯著性影響(P＞0.05)。

表5 飼料中富硒壺瓶碎米薺添加量對青魚幼魚肝臟抗氧化能力的影響(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差, n=3)Tab. 5 Effect of dietary selenium-rich Cardamine hupingshanensis on antioxidant capacities in the liver of juvenile black carp (mean±SD,n=3)

如圖 2所示, 與對照組相比, 飼料中添加富硒壺瓶碎米薺能夠顯著上調(diào)青魚肝臟中Nrf2基因表達(dá)量(P＜0.05), 在其添加量為2.0 g/kg時達(dá)到最高, 但0.5、1.0和2.0 g/kg三組間無顯著性差異(P＞0.05)。而keap1a和keap1b基因表達(dá)量隨飼料中富硒壺瓶碎米薺添加量增加均呈現(xiàn)先下降后升高的趨勢, 并都在1.0 g/kg時達(dá)到最低值(P＜0.05)。盡管1.0 g/kg組keap1a表達(dá)量與2.0 g/kg組間無顯著性差異, 但1.0 g/kg組keap1b表達(dá)量顯著低于對照組和過量組(2.0 g/kg;P＜0.05)。

圖2 飼料中富硒壺瓶碎米薺添加量對青魚幼魚肝臟Nrf2/Keap1相關(guān)基因表達(dá)量的影響Fig. 2 Effect of dietary selenium-rich Cardamine hupingshanensis on gene expression levels related to Nrf2/Keap1 in the liver of juvenile black carp

如圖 3所示, 隨著飼料中富硒壺瓶碎米薺添加量的增加, 肝臟中Cu/Zn-SOD和Mn-SOD基因表達(dá)量均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。盡管Cu/Zn-SOD基因表達(dá)量各組間無顯著性差異(P＞0.05), 但富硒壺瓶碎米薺添加量為0.5—1.0 g/kg時, 肝臟中Mn-SOD基因表達(dá)量較對照組顯著升高(P＜0.05)。CAT基因表達(dá)量在2.0 g/kg時達(dá)到最高值, 顯著高于其他組(P＜0.05)。與對照組相比,GST-M和GST-A基因表達(dá)量在富硒壺瓶碎米薺添加量為0.5 g/kg時達(dá)到最低值, 隨后升高。GST -M在各組間差異不顯著(P＞0.05),GST-A基因表達(dá)量在0.5 g/kg顯著低于其他各組(P＜0.05)。GPX1和GPX4基因表達(dá)量均在飼料中富硒壺瓶碎米薺添加量為1.0 g/kg時達(dá)到最大值, 較對照組顯著升高(P＜0.05)。GPX1基因表達(dá)量在0.5、1.0和2.0 g/kg三組間無顯著性差異(P＞0.05), 但1.0 g/kg組GPX4基因表達(dá)量顯著高于0.5和2.0 g/kg組(P＜0.05)。同時, 肝臟中GR基因表達(dá)量也呈先上升后下降的趨勢, 且各組間無顯著性差異(P＞0.05)。

圖3 飼料中富硒壺瓶碎米薺添加量對青魚幼魚肝臟抗氧化能力相關(guān)基因表達(dá)量的影響Fig. 3 Effect of dietary selenium-rich Cardamine hupingshanensis on gene antioxidant expression levels related in the liver of juvenile black carp

2.5 富硒壺瓶碎米薺對青魚幼魚肝臟先天免疫指標(biāo)的影響

如圖 4所示, 隨著飼料中富硒壺瓶碎米薺的添加, 肝臟中Leap2a、Leap2b、HEPC、LYZ和C3基因表達(dá)量均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。其中,Leap2a基因表達(dá)量在富硒壺瓶碎米薺添加量為0、0.5、和1.0 g/kg組間無顯著性差異(P＞0.05), 但均顯著高于過量組(2.0 g/kg;P＜0.05)。而Leap2b基因表達(dá)量在其添加量為1.0 g/kg組顯著高于對照組(P＜0.05)。盡管HEPC基因表達(dá)量在富硒壺瓶碎米薺添加量為1.0和2.0 g/kg組間無顯著性差異(P＞0.05),但均顯著高于對照組和0.5 g/kg組 (P＜0.05)。富硒壺瓶碎米薺添加量為0.5 g/kg組LYZ基因表達(dá)量顯著高于對照組和過量組(2.0 g/kg;P＜0.05), 但與1.0 g/kg組間無顯著性差異(P＞0.05)。飼料中添加富硒壺瓶碎米薺能夠顯著提高C3基因表達(dá)量(P＜0.05), 同時1.0 g/kg組C3基因表達(dá)量顯著高于0.5 g/kg和過量組(2.0 g/kg;P＜0.05)。

圖4 飼料中富硒壺瓶碎米薺添加量對青魚幼魚肝臟先天免疫相關(guān)基因表達(dá)量的影響Fig. 4 Effect of dietary selenium-rich Cardamine hupingshanensis on gene expression levels related to innate immunity in the liver of juvenile black carp

3 討論

3.1 富硒壺瓶碎米薺對青魚幼魚生長性能和體組成的影響

作為動物體生長所必需的一種微量元素[20], 適量硒對維持生物體正常生理功能起著重要的作用[21],其補充量與生長參數(shù)密切相關(guān)[22]。本研究發(fā)現(xiàn), 飼料中富硒壺瓶碎米薺添加量為0.5—1.0 g/kg(硒實際添加量為0.43—0.75 mg/kg)時能夠顯著升高青魚幼魚的增重率和特定生長率, 并顯著降低飼料系數(shù)(P＜0.05), 這與在草魚(Ctenopharyngodon idella; 硒需求量為0.546—0.604 mg/kg)的研究結(jié)果基本一致, 高于黃顙魚(Pelteobagrus fulvidraco; 硒需求量為0.20 mg/kg)的需求量[21,23,24]。在真鯛(Pagrusmajor)的研究中發(fā)現(xiàn), 飼料中添加適量硒, 可顯著提高魚體粗蛋白的含量, 增加魚體蛋白質(zhì)沉積[25], 與本實驗結(jié)果相似。這可能是由于硒是5′脫碘酶的組成成分, 催化甲狀腺素(T4)脫碘生成有活性的三碘甲狀腺原氨酸(T3), T3水平的升高會刺激機(jī)體生長激素的分泌, 進(jìn)而促進(jìn)了魚體的生長, 提高蛋白質(zhì)沉積速率[26], 但在青魚中需進(jìn)一步驗證。本實驗結(jié)果顯示, 飼料中添加0.5 g/kg富硒壺瓶碎米薺會顯著提高魚體粗脂肪的含量, 這與黃顙魚研究結(jié)果一致, 可能是由于低劑量的硒可能促進(jìn)魚體粗脂肪的沉積, 對魚體脂肪代謝有一定影響[24]。而在草魚的研究中發(fā)現(xiàn), 飼料中添加0.41—4.31 mg/kg硒時, 可以顯著下降其魚體粗脂肪含量, 在白鱘中也發(fā)現(xiàn)類似結(jié)果[27,40]。鱸的研究表明, 飼料中硒的添加對魚體粗脂肪含量無顯著性影響[28], 這可能是由于物種不同導(dǎo)致結(jié)果產(chǎn)生差異。同時本研究也發(fā)現(xiàn), 當(dāng)飼料中富硒壺瓶碎米薺添加量為2.0 g/kg時, 魚體的生長性能顯著降低(P＜0.05)。這表明過量的富硒壺瓶碎米薺會對魚體的生長產(chǎn)生抑制作用[29]。綜上所述, 飼料中添加適量富硒壺瓶碎米薺可以提高魚體的增重率, 增加魚體蛋白沉積, 而過量的富硒壺瓶碎米薺則抑制魚體生長。

3.2 富硒壺瓶碎米薺對青魚幼魚血清生理生化指標(biāo)的影響

動物機(jī)體血清生理生化指標(biāo)的變化與飼料中營養(yǎng)物質(zhì)的含量有關(guān)[30]。在正常狀態(tài)下, 機(jī)體血糖處于動態(tài)平衡狀態(tài), 隨著外界因素的改變發(fā)生變化[31]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn), 飼料中添加0.5—1.0 g/kg富硒壺瓶碎米薺時, 青魚幼魚血清中GLU的含量顯著下降(P＜0.05)。血清中TG和TCH含量可以反映出脂肪在血液中的轉(zhuǎn)運能力。本實驗發(fā)現(xiàn), 隨著飼料中富硒壺瓶碎米薺添加量的增加, 血清中TG和TCH呈先上升后下降的趨勢, 說明血清中脂肪代謝在一定范圍內(nèi)受到抑制, 但未對機(jī)體造成明顯損傷, 這與虹鱒(Oncorhynchus mykiss)研究結(jié)果相似[32]。HDL-C能夠?qū)⑦^多的膽固醇轉(zhuǎn)運至肝臟進(jìn)行清除, 而LDLC則是將膽固醇和甘油三酯由肝臟運送至各個組織進(jìn)行利用[33]。與大口黑鱸(Micropterus salmoides)和卵形鯧鲹(Trachinotus ovatus)的研究結(jié)果類似, 適量富硒壺瓶碎米薺(0.5 g/kg)能夠改善血清中脂肪的轉(zhuǎn)運和代謝, 而過量富硒壺瓶碎米薺(2.0 g/kg)會阻礙血清中脂肪的轉(zhuǎn)運[34,35]。作為血清中最主要的蛋白質(zhì), ALB與機(jī)體免疫能力、肝臟和腎臟的健康狀況有關(guān), 其含量降低可能表明機(jī)體肝臟受到損傷[36,37]。而AST和ALT主要存在于肝臟、腎臟、心臟和其他器官, 因此血清中AST和ALT活性的增加可能與肝損傷或肝功能障礙有關(guān)[38]。在草魚的研究中發(fā)現(xiàn),納米硒對草魚肝臟和其他組織器官具有一定的保護(hù)作用, 隨著飼料中硒添加量的增加, 血清中的AST和ALT的活性呈下降趨勢[39]。在本實驗中, 與對照組相比, 添加0.5—1.0 g/kg富硒壺瓶碎米薺時, 可顯著提高ALB的含量, AST在其添加量為1.0 g/kg時達(dá)到最低(P＜0.05), 而富硒壺瓶碎米薺添加量對ALT無顯著性影響(P＞0.05), 表明添加適量富硒壺瓶碎米薺可提高魚體免疫能力, 防止肝臟受損。作為由肝膽向外排出的酶, ALP是一種磷酸單酯水解酶, 其含量與機(jī)體先天免疫有關(guān)[40]。本實驗發(fā)現(xiàn), 隨著富硒壺瓶碎米薺添加量的增加, 血清中ALP呈先上升后下降的趨勢, 說明飼料中添加富硒壺瓶碎米薺能夠通過提高ALP分泌量進(jìn)而提高魚體的先天免疫能力。

3.3 富硒壺瓶碎米薺對青魚幼魚肝臟硒代謝指標(biāo)的影響

硒在壺瓶碎米薺中的存在形式主要為硒代半胱氨酸, 而硒代半胱氨酸在機(jī)體內(nèi)被SCLY催化分解, 生成硒化物和丙氨酸, 硒化物和三磷酸腺苷(ATP)在SPS1的催化下生成硒磷酸, 直接參與合成相應(yīng)的硒蛋白[41,42]。在動物機(jī)體內(nèi), 硒蛋白具有調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激、免疫功能和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激等多種作用,對促進(jìn)機(jī)體硒代謝具有重要意義[43]。硒蛋白代謝的主要部位是肝臟, SEPP在肝臟中合成, 將硒轉(zhuǎn)運至其他組織中[44]。當(dāng)SEPP基因被敲除后, 各組織硒供應(yīng)會受到不同程度的影響, 因此SEPP主要用于維持機(jī)體硒的平衡[45]。SEP15是一種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)駐留蛋白, 在維持氧化還原穩(wěn)態(tài)和促進(jìn)糖蛋白正確折疊中具有重要作用[46]。SEPT也存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中, 在維持機(jī)體鈣離子穩(wěn)態(tài)和促進(jìn)機(jī)體抗氧化方面其重要作用[47]。SEPH位于細(xì)胞核中, 參與機(jī)體氧化還原的調(diào)節(jié), 調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖, 是防止細(xì)胞不受控制地增殖的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑[48]。 在本研究中, 富硒壺瓶碎米薺添加量為0.5和1.0 g/kg時青魚肝臟中SCLY、SPS1、SEP15、SEPT2、SEPH和SEPP基因表達(dá)量均高于對照組。由此可見, 飼料中添加0.5—1.0 g/kg富硒壺瓶碎米薺時能夠促進(jìn)SCLY和SPS1催化分解硒代半胱氨酸, 生成硒磷酸, 促進(jìn)SEPP的合成, 保證機(jī)體硒含量的穩(wěn)態(tài)。同時飼料中添加適量的富硒壺瓶碎米薺也能夠通過提高SEP15、SEPT2、SEPH等硒蛋白基因表達(dá)量, 進(jìn)而維持機(jī)體的氧化還原穩(wěn)態(tài), 發(fā)揮對機(jī)體的保護(hù)作用[44—46]。

3.4 富硒壺瓶碎米薺對青魚幼魚肝臟抗氧化能力的影響

飼料中營養(yǎng)物質(zhì)的均衡, 對維持機(jī)體穩(wěn)態(tài)具有重要作用[18]。在氧化應(yīng)激條件下, 機(jī)體產(chǎn)生大量活性氧(ROS), 高水平的ROS會導(dǎo)致細(xì)胞的凋亡, 從而對組織造成損傷[49], 此時抗氧化防御系統(tǒng)包括SOD、CAT和GSH-PX等對保護(hù)機(jī)體至關(guān)重要[50]。硒是預(yù)防氧化應(yīng)激的重要微量元素[51], 其作為GSH-PX的活性中心, GSH-PX可分解機(jī)體內(nèi)過量的過氧化氫, 提高機(jī)體抗氧化能力[52,53]。本研究發(fā)現(xiàn), 富硒壺瓶碎米薺添加量為0.5 g/kg時, 肝臟中SOD和CAT活性達(dá)到最高, 而GSH-PX的活性較對照組持續(xù)上升(P＜0.05), 二者呈正相關(guān)關(guān)系, 這與虹鱒、尖吻鱸和尼羅羅非魚(Oreochromis niloticus)的研究結(jié)果一致[54—56]。在草魚的研究中發(fā)現(xiàn), 飼料中添加0.9 mg/kg硒可以顯著提高肝臟中Nrf2基因表達(dá)量, 表明一定量的膳食硒可以激活機(jī)體內(nèi)Nrf2/keap1信號通路[39], 在動物機(jī)體抗氧化調(diào)控中起重要作用。在本實驗中, 與對照組相比, 富硒壺瓶碎米薺添加量為0.5和1.0 g/kg時青魚肝臟中Nrf2基因表達(dá)量持續(xù)上升, 而keap1基因出現(xiàn)下調(diào), 其下游的抗氧化相關(guān)基因Mn-SOD、CAT、GPX1和GPX4的基因表達(dá)量均升高, 這表明飼料中添加富硒壺瓶碎米薺可以通過Nrf2/keap1信號通路促進(jìn)魚體相關(guān)靶基因的表達(dá), 保護(hù)細(xì)胞膜免受氧化損傷, 保證機(jī)體的正常生長[57,58]。青魚幼魚在富硒壺瓶碎米薺添加量為0.5 g/kg組中GR活性、GSH含量和T-AOC水平較對照組和過量組(2.0 g/kg)顯著升高(P＜0.05)。同時富硒壺瓶碎米薺添加量為0.5 g/kg時MDA水平顯著低于對照組和過量組(2.0 g/kg), 這說明飼料中添加適量的富硒壺瓶碎米薺能夠減緩脂質(zhì)過氧化過程[59]。由此可見, 飼料中添加適量的富硒壺瓶碎米薺能夠通過上調(diào)GR活性并下調(diào)GST活性的途徑來提高GSH含量, 減少脂質(zhì)過氧化物的產(chǎn)生, 降低細(xì)胞損傷程度, 進(jìn)而發(fā)揮其對機(jī)體抗氧化的保護(hù)作用[60, 61]。

3.5 富硒壺瓶碎米薺對青魚幼魚肝臟先天免疫指標(biāo)的影響

抗菌肽廣泛存在于各種生命體中, 是宿主不可或缺的組成部分, 保護(hù)機(jī)體免受細(xì)菌侵害, 為機(jī)體建立起第一道屏障, 其中魚類抗菌肽包括HEPC和Leap2等[62]。Leap2在肝臟中產(chǎn)生, 通過提高其mRNA表達(dá)量進(jìn)而抵御細(xì)菌入侵, 在第一道防線中起重要作用[63]。HEPC通過提高巨噬細(xì)胞的內(nèi)吞作用和蛋白酶水解作用破壞病原體細(xì)胞, 導(dǎo)致病原體死亡[64]。本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn), 在富硒壺瓶碎米薺添加量為1.0 g/kg時, 肝臟中Leap2b和HEPC基因表達(dá)量較對照組均顯著升高(P＜0.05), 因此, 飼料中添加適量的富硒壺瓶碎米薺可以提高青魚對細(xì)菌的抵抗能力, 增強機(jī)體的先天免疫能力。溶菌酶是重要的抗菌酶, 能直接反應(yīng)魚類先天免疫能力的高低[65]。本實驗發(fā)現(xiàn), 肝臟中LYZ基因表達(dá)量呈先升高后降低的趨勢, 在富硒壺瓶碎米薺添加量為0.5 g/kg時達(dá)到最高值, 較對照組和過量組(2.0 g/kg)顯著升高(P＜0.05), 此結(jié)果與尼羅羅非魚、中華絨螯蟹和歐洲鱸(Dicentrarchus labrax)一致[6,66,67]。在大菱鲆(Scophthalmus maximus)的研究中發(fā)現(xiàn), 在銅脅迫下, 隨著飼料中硒添加量的增加, 肝臟中LYZ相對表達(dá)量呈上升趨勢, 說明飼料中硒添加量的增加可以緩解高銅誘導(dǎo)的免疫抑制, 對機(jī)體免疫能力有促進(jìn)作用[68]。補體系統(tǒng)是先天免疫系統(tǒng)的重要組成部分, 通過經(jīng)典途徑、旁路途徑和凝集素途徑對機(jī)體進(jìn)行免疫調(diào)節(jié), 而補體C3則是激活補體系統(tǒng)的關(guān)鍵分子[69]。本實驗結(jié)果表明, 適量的富硒壺瓶碎米薺可以促進(jìn)補體C3的表達(dá), 提高機(jī)體的先天免疫能力, 這與尼羅羅非魚研究結(jié)果一致[26]。綜上所述,飼料中添加適量的富硒壺瓶碎米薺能夠通過上調(diào)Leap2、HEPC、LYZ和補體C3的表達(dá)量進(jìn)而增強青魚幼魚的先天免疫能力。

4 結(jié)論

本實驗結(jié)果顯示飼料中添加0.5—1.0 g/kg富硒壺瓶碎米薺能顯著提高青魚幼魚的生長性能, 提高青魚幼魚肝臟硒代謝、抗氧化及先天免疫能力, 上述結(jié)果也為富硒壺瓶碎米薺在青魚幼魚配合飼料中的科學(xué)使用奠定了基礎(chǔ)。