不同環(huán)境樣本類型對蚌類環(huán)境DNA監(jiān)測的差異研究

雷 姚 周春花, 歐陽珊, 吳小平,

(1. 南昌大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 南昌 330031; 2. 鄱陽湖環(huán)境與資源利用教育部重點實驗室, 南昌 330031; 3. 江西省流域生態(tài)演變與生物多樣性重點實驗室, 南昌 330031)

淡水生態(tài)系統(tǒng)為人類的文明發(fā)展提供了寶貴資源, 然而卻存在生物多樣性喪失和調(diào)查研究不足的現(xiàn)狀[1]。物種是生物多樣性的重要組成成分, 進行種質(zhì)資源調(diào)查和監(jiān)測是保護生物多樣性的重要基石[2], 在全球生物多樣性喪失日益嚴(yán)重的背景下,對生物多樣性現(xiàn)狀全面了解的需求尤為緊迫[3]。長江是我國淡水資源的寶庫, 但多年來受人類活動影響, 長江生物多樣性持續(xù)下降, 水生態(tài)保護形勢嚴(yán)峻[4]。農(nóng)業(yè)農(nóng)村部于2020年1月1日頒布的《長江流域重點水域禁捕和建立補償制度實施方案》提出長江要開始為期10年的全面禁漁, 且越來越多的大江大河開始加大禁漁力度、擴大禁漁區(qū)的范圍。在禁漁條件下, 許多傳統(tǒng)的監(jiān)測水生生物的方法難以適應(yīng)新的監(jiān)測要求, 因此創(chuàng)新水生生物資源監(jiān)測方法是重要的科學(xué)問題。

蚌類是大型底棲動物, 是生態(tài)系統(tǒng)中最重要的生物類群之一。一方面, 它們被如底層魚類的小型動物和一些鳥類所食用; 另一方面, 它們通過濾食水體中的營養(yǎng)物質(zhì)、有機物和浮游生物從而達到凈化水體的效果。蚌類在食物網(wǎng)中扮演著重要的角色, 棲息于湖泊或河流的淡水雙殼類消失將會導(dǎo)致一系列的生態(tài)問題[1]。最近幾十年來, 全世界范圍內(nèi)蚌類種群密度和種類豐富程度等呈現(xiàn)明顯的下降趨勢, 部分種群自我恢復(fù)的能力遠低于其物種數(shù)量減少的速度, 導(dǎo)致一些物種瀕臨滅絕或已滅絕[2]。蚌類作為最易受威脅的淡水生物類群之一, 自20世紀(jì)90年代以來, 其種群呈明顯的衰退趨勢[3]。蚌類的分布具有明顯的地域特征, 北美蚌類特有種多集中于美國, 而亞洲蚌類最豐富的國家則是中國, 且集中分布在長江中下游地區(qū)[4]。鄱陽湖是我國最大的淡水湖泊, 有著豐富的蚌類資源, 由于人類活動如挖沙、水體污染和過度捕撈等對蚌類的生存造成了威脅, 也影響了湖泊的正常生態(tài)功能[5]。鄱陽湖的蚌類資源最早由Heude[6]進行過采集和形態(tài)鑒定, 之后林振濤[7]、張璽等[8]和劉月英等[9]陸續(xù)對鄱陽湖蚌類進行了區(qū)系調(diào)查, 吳小平等[10]和歐陽珊等[11]也分析了鄱陽湖蚌類的分布及資源現(xiàn)狀。2009年的調(diào)查數(shù)據(jù)顯示鄱陽湖有蚌類42種, 其中包括中國特有種32種[12]。2016—2017系統(tǒng)調(diào)查鄱陽湖大型底棲動物數(shù)據(jù)表明鄱陽湖有蚌類24種[13]。通過與歷史數(shù)據(jù)比較, 發(fā)現(xiàn)鄱陽湖的蚌類物種豐富度和優(yōu)勢物種均顯著減少。

雖然傳統(tǒng)的調(diào)查方法在調(diào)查蚌類多樣性方面發(fā)揮著不可替代的作用, 但也存在如所需時間長、依賴專家經(jīng)驗、環(huán)境破壞性大、稀有物種調(diào)查不易、與禁漁政策相違背等諸多問題[14]。環(huán)境DNA宏條形碼(Environmental DNA metabarcoding,eDNA metabarcoding)技術(shù)直接從環(huán)境樣本(如水、沉積物和土壤等)中提取DNA并使用針對目標(biāo)物種的通用引物進行擴增, 利用PCR和高通量測序(High-throughput sequencing, HTS)等技術(shù), 可在較短時間內(nèi)實現(xiàn)對多個目標(biāo)物種的鑒定[15]。Prié等[16]利用環(huán)境DNA宏條形碼評估了西古北界淡水雙殼類兩個科的生物多樣性。Klymus等[17]利用環(huán)境DNA宏條形碼方法檢測了美國東南部的蚌科和珍珠蚌科。陳金萍等[18]篩選出的宏條形碼引物被證明在蚌類多樣性研究中的有效性。

環(huán)境DNA調(diào)查信息豐富, 可以補充其他生物多樣性監(jiān)測方法的不足, 不同環(huán)境樣本類型會影響物種可檢測性和群落結(jié)構(gòu)[19]。Jennifer等[20]將水體樣本與沉積物樣本檢出的魚類物種數(shù)與傳統(tǒng)魚類調(diào)查方法進行了比較, 結(jié)果表明與沉積物相比, 水體樣本中提取的環(huán)境DNA所反映的物種數(shù)量較多, 且更能反映魚類群落的特征。Sakata等[21]通過對不同環(huán)境樣本類型進行比較發(fā)現(xiàn), 水體樣本和沉積物樣本檢出的魚類物種數(shù)量相當(dāng), 但其物種組成之間差異顯著。Kusanke等[22]通過檢測水體樣本和沉積物樣本中的瀕危物種Misgurnus fossilis, 發(fā)現(xiàn)目標(biāo)生物在沉積物中的環(huán)境DNA濃度高于水體, 這表明對于M. fossilis這種一生大部分時間都隱藏在沉積物中的物種而言, 采集沉積物樣本更適合。錢瑭毅等[23]通過采集表層水、中層水和底層水來分析在越冬洄游時中國對蝦(Fenneropenaeus chinensis)的分布情況, 結(jié)果表明, 在自然水體中, 中國對蝦的環(huán)境DNA呈現(xiàn)出底層濃度高于表層濃度的垂直分布規(guī)律。Moyer等[24]為了確定環(huán)境DNA檢測時的有效水層, 以Hemichromis letourneuxi為目標(biāo)生物, 結(jié)果表明在進行環(huán)境DNA檢測的最佳水層為表層水, 底層水次之。目前, 環(huán)境DNA宏條形碼在蚌類的研究中多采集表層水[16,17], 不同的環(huán)境樣本類型對蚌類多樣性及群落結(jié)構(gòu)的差異研究還很少見。蚌類營底棲生活, 因此我們提出假設(shè): 環(huán)境DNA宏條形碼在蚌類多樣性的研究中, 沉積物樣本檢測的效果會優(yōu)于水體樣本, 底層水的效果會優(yōu)于表層水。

本研究結(jié)合傳統(tǒng)蚌類調(diào)查方法, 探索使用環(huán)境DNA宏條形碼技術(shù)時, 不同環(huán)境樣本類型如何影響蚌類物種的可檢測性, 并對不同環(huán)境樣本類型得到的蚌類多樣性及群落結(jié)構(gòu)差異進行探究。旨在探討環(huán)境DNA宏條形碼技術(shù)應(yīng)用于蚌類多樣性及群落結(jié)構(gòu)的研究是否可行, 并為后續(xù)蚌類環(huán)境DNA監(jiān)測時的取樣策略的選擇提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣本采集

本研究分別于2021年1月19—21日(冬季)和4月28—30日(春季)在鄱陽湖采集環(huán)境水樣和沉積物樣本并進行蚌類傳統(tǒng)方法的采集, 共設(shè)置采樣點17個,其中環(huán)境DNA采樣點6個, 17個采樣點均進行傳統(tǒng)方法的采集(圖 1)。在每個環(huán)境DNA采樣點分別采集表層水(水面下約0.5 m)和底層水(湖底上方約1 m)各1 L于滅菌廣口瓶中, 冰上保存并盡快運回實驗室過濾, 且表層水和底層水在每個采樣點均做3次重復(fù)。使用彼得森采泥器(面積為1/16 m2)采集沉積物, 取0.5 g沉積物于50 mL樣品瓶中, 低溫保存直至樣本處理。使用邊長為0.6 m的自制蚌耙在17個傳統(tǒng)方法采樣點, 將蚌耙拉繩的一端固定于船尾, 勻速拖拉50 m, 打撈約30 m2內(nèi)的蚌類。使用稀釋的商業(yè)漂白劑溶液(＞0.1%次氯酸鈉溶液)對采樣步驟中使用的所有設(shè)備進行滅菌以防污染。使用多參數(shù)水質(zhì)儀(YSI650-MDS)記錄各采樣點的溶解氧(DO)、水溫(WT)、酸堿度(pH)和葉綠素a(Chl.a)等環(huán)境參數(shù)。使用透明度盤進行透明度(SD)的測定。使用采泥器進行水深(WD)的估算。每個樣點采集水樣1 L, 交于江西省九江市星子縣環(huán)境監(jiān)測站測定總氮(TN)和總磷(TP)。

圖1 鄱陽湖采樣圖Fig. 1 Sampling map of Poyang Lake

1.2 樣品處理

水樣采集后于當(dāng)天6h之內(nèi)用0.45 μm的混合纖維素濾膜(天津津騰/JINTENG, 中國)對水樣進行真空泵抽濾, 以達富集環(huán)境DNA的目的, 將各個樣品的濾膜置于1.5 mL離心管中于-20℃冰箱冷凍保存。抽濾過程中所需設(shè)備及器材進行無菌處理, 并使用超純水作為陰性對照。將沉積物樣本從-80℃冰箱拿出置于4℃消解, 將消解好的沉積物稱量0.25 g于1.5 mL離心管中, 簡短離心使其達到水泥分離的狀態(tài)。標(biāo)本鑒定主要依據(jù)《中國經(jīng)濟動物志: 淡水軟體動物》[9]。在實驗室對每個樣點的蚌類物種進行計數(shù)和稱重。測量完的活體標(biāo)本用95%的乙醇固定保存用于后續(xù)的分子實驗。

1.3 環(huán)境DNA提取與擴增

使用試劑盒DNeasy?Blood & Tissue Kit(Qiagen, Venlo, the Netherlands)并按照說明書進行濾膜DNA提取。使用試劑盒DNeasy?PowerSoil?Pro Kit Handbook(Qiagen, Venlo, the Netherlands)并按照說明書進行沉積物DNA提取。最后使用Qubit(Thermo Fisher Scientific, 中國)測定DNA濃度和質(zhì)量。

使用蚌類的通用引物16SPp-F: 5′-TGAGCGTG CTAAGGTAGC-3′和16SPp-R: 5′-GCGGGGTC TTTTYGTCT-3′[18], 對環(huán)境樣本(水體樣本和沉積物樣本)的16S rRNA區(qū)域進行PCR擴增, 每個樣本做3個重復(fù)擴增, 擴增片段長度約為147 bp。PCR反應(yīng)采用20 μL體系, 其中包含: 5×FastPfu Buffer 4 μL,2.5 mmol/L dNTPs 2 μL, Forward Primer(5 μmol/L)0.8 μL, Reverse Primer(5 μmol/L)0.8 μL, FastPfu Polymerase 0.4 μL, Template DNA 10 ng, 補ddH2O至20 μL。PCR反應(yīng)程序: 95℃預(yù)變性5min, 29個循環(huán)包括: 95℃變性30s, 55℃退火30s, 72℃延伸45s;最后72℃延伸10min, 4℃保存。使用ddH2O為模板設(shè)置PCR陰性對照, PCR陰性對照擴增結(jié)果未見異常。PCR擴增后所得產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測后, 送至上海凌恩生物科技有限公司進行高通量測序。

1.4 高通量測序與質(zhì)控

選擇Illumina Miseq平臺進行高通量測序。對下機數(shù)據(jù)進行篩選和過濾后得到有效序列。使用QIIME軟件將有效序列聚類為可操作分類單元(Operational taxonomic unit, OTU), 獲得OTU代表序列。OTU代表序列使用本地和公共數(shù)據(jù)庫相結(jié)合的方式進行物種注釋分析。本地數(shù)據(jù)庫由鄱陽湖歷史記錄蚌類37種(物種信息見附錄1)的線粒體全基因組序列或16S rRNA序列構(gòu)成, 選擇Nt數(shù)據(jù)庫(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)作為公共數(shù)據(jù)。物種注釋標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)Valdivia-Carrillo等[25], 以97%—100%確定為種; 94%—97%確定為屬; 91%—94%確定為科; 88%—91%確定為目; ＜88%確定為綱。

1.5 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)分析主要有: 物種組成分析、多樣性分析和相關(guān)性Heatmap分析。

物種組成分析物種組成分析選用相似水平為97%的OTU樣本表。其中, 相對序列豐度計算了不同的蚌類物種在各采樣點的reads之和。蚌類生物量計算了每個采樣點約30 m2斷面內(nèi)活體蚌類的重量之和。

Alpha多樣性分析Alpha多樣性選取Chao1指數(shù)、物種豐富度指數(shù)、香農(nóng)指數(shù)和辛普森指數(shù)進行分析。其中, Chao1指數(shù)和Richness指數(shù)用于群落豐富度的估算。Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)則用于估算群落多樣性。Chao1指數(shù)由Chao(1984)最早提出, Chao1值越大, 代表群落物種越豐富。

式中,SChao1= 估計的OTU數(shù);Sobs=實際觀測到的OTU數(shù);n1=只含有一條序列的OTU數(shù)目;n2=只含有兩條序列的OTU數(shù)目。

物種豐富度指數(shù)(Species richness)是指群落中豐度大于0的物種數(shù)之和。Species richness指數(shù)值越大, 說明群落物種種類越豐富。

式中,S為物種豐富度指數(shù);n為個體數(shù)(豐度)大于0的物種類型總數(shù)。

香農(nóng)指數(shù)(Shannon index)是用來估算樣本中生物多樣性的指數(shù)之一。Shannon值越大, 說明群落多樣性越高。

式中,Sobs= 實際觀測到的OTU數(shù);ni=第i個OTU所含的序列數(shù);N=所有的序列數(shù)。

辛普森指數(shù)(Simpson index)是用于估算樣本中生物多樣性的指數(shù)之一。Simpson指數(shù)值越大, 說明群落多樣性越低。

式中,Sobs= 實際觀測到的OTU數(shù);ni=第i個OTU所含的序列數(shù);N=所有的序列數(shù)。

Beta多樣性分析Beta多樣性主要通過非度量多維尺度分析(Non-metric multidimensional scaling, NMDS)對群落結(jié)構(gòu)進行研究。以脅迫系數(shù)(stress)來衡量NMDS結(jié)果的優(yōu)劣, stress值越小越好,當(dāng)stress＜0.05時為擬合極好, stress＜0.1時為擬合較好, stress＜0.2時為擬合一般, stress＞0.3為擬合較差。選用相似性分析(Analysis of Similarities, ANOSIM)來驗證組內(nèi)差異是否顯著小于組間(兩組或多組)差異, 從而判斷分組是否有意義。

相關(guān)性Heatmap分析相關(guān)性Heatmap分析是以熱圖的形式呈現(xiàn)出物種與環(huán)境因子之間的相關(guān)性, 可觀察物種與環(huán)境因子之間相關(guān)性的正負程度。*為P＜0.05, **為P＜0.01, ***為P＜0.001, 不同的顏色代表不同的R值, 熱圖最右側(cè)的色卡是不同R值的顏色分區(qū)。

2 結(jié)果

2.1 鄱陽湖蚌類物種組成分析

本研究基于Illumina PE250測序?qū)?6個樣本進行高通量測序, 經(jīng)質(zhì)控和過濾, 共得到有效序列22320294條, 平均序列長度115 bp, 在97%的相似水平下進行OTU聚類, 共得到33686個OTU。本研究共注釋到蚌類33種, 其中30種是鄱陽湖記錄種(表 1)。從季節(jié)來看, 冬季注釋到蚌類28種, 春季注釋到蚌類32種。從環(huán)境樣本來看, 表層水注釋到蚌類32種,底層水注釋到蚌類32種, 沉積物注釋到蚌類28種。傳統(tǒng)方法在17個采樣點共采集蚌類18種, 其中冬季采集到17種, 春季采集到11種?；诃h(huán)境DNA宏條形碼技術(shù)能檢測出傳統(tǒng)方法采集到的所有蚌類物種, 其中, 表層水除劍狀矛蚌未檢測到外, 其余傳統(tǒng)方法采集到的蚌類物種均可檢測到; 底層水能檢測到傳統(tǒng)方法采集到的所有物種; 沉積物中除劍狀矛蚌、卵形尖嵴蚌、舟行無齒蚌和豬耳弓背蚌未檢測到外, 其余傳統(tǒng)方法采集到的蚌類物種均可檢測到。本次測序結(jié)果相對序列豐度最高的為橄欖蟶蚌(1754829), 其次為圓頂珠蚌(579313)。傳統(tǒng)方法采集到的蚌類生物量最高的為洞穴麗蚌(84.29 g/m2),其次為扭狀矛蚌(65.26 g/m2; 表 2)。從環(huán)境DNA宏條形碼中獲得的相對序列豐度與蚌類生物量之間不存在正相關(guān)關(guān)系。

表1 環(huán)境DNA方法檢出的蚌類與傳統(tǒng)方法采集的蚌類Tab. 1 Mussels detected by environmental DNA methods and collected by traditional methods

表2 環(huán)境DNA相對序列豐度與傳統(tǒng)方法蚌類生物量對比Tab. 2 Relative sequence abundance of environmental DNA species compared with biomass of mussels by traditional methods

蚌類動物線粒體的遺傳方法是雙單親遺傳, 存在母系和父系來源的序列。本研究使用的引物能分辯母系和父系來源的序列。有的物種只可分辨父系來源的序列如洞穴麗蚌, 有的物種只可分辨母系來源的序列有: 高頂鱗皮蚌、蚶形無齒蚌、中國尖嵴蚌、龍骨蟶蚌、角月麗蚌、褶紋冠蚌、尖鋤蚌、天津尖麗蚌、矛形楔蚌、環(huán)帶尖麗蚌、短褶矛蚌、光滑無齒蚌、卵形尖嵴蚌、舟形無齒蚌和三角小蟶蚌。有的物種可分辨母系和父系來源的序列。在能分辯母系和父系來源的序列物種中, 有的父系reads多, 有的母系reads多(表 3)。

表3 環(huán)境DNA方法鑒定的蚌類F型和M型reads數(shù)Tab. 3 Number of F-type and M-type reads identified by environmental DNA method

2.2 鄱陽湖蚌類物種Alpha多樣性分析

基于環(huán)境DNA宏條形碼的鄱陽湖蚌類Alpha多樣性從季節(jié)上看, 雖然春季的Chao1指數(shù)和Richness指數(shù)均高于冬季, 但春季和冬季Alpha多樣性水平無顯著性差異(P=0.282; 圖 2)。從環(huán)境樣本類型來看, 表層水的Chao1指數(shù)和Richness指數(shù)顯著高于沉積物的, 底層水的Chao1指數(shù)和Richness豐富度指數(shù)極顯著高于沉積物的。底層水的Shannon多樣性指數(shù)和Simpson指數(shù)和沉積物的均有顯著性差異。表層水和底層水多樣性水平?jīng)]有差異(圖 3)。

圖3 不同環(huán)境樣本類型Alpha多樣性水平差異檢驗箱線圖Fig. 3 Box plot of Alpha diversity level difference test for different environmental sample types

2.3 鄱陽湖蚌類物種Beta多樣性分析

基于環(huán)境DNA宏條形碼的鄱陽湖蚌類結(jié)果進行Bray-Curtis NMDS分析表明冬季與春季的蚌類群落相似性的Stress值為0.1509, 進一步地ANOSIM分析顯示:R值＞0, 即組間差異大于組內(nèi)差異, 分組有意義,P＜0.01, 即春季和冬季的環(huán)境DNA宏條形碼注釋到的鄱陽湖蚌類群落結(jié)構(gòu)差異達到極顯著性水平(R=0.252,P=0.001; 圖 4)。從環(huán)境樣本類型來看, Stress值為0.1509, ANOSIM分析中,R值大于0, 整體P值小于0.01, 表明不同環(huán)境樣本類型的整體群落結(jié)構(gòu)組成具有極顯著差異, 進一步的ANOSIM分析表明表層水和底層水的環(huán)境DNA注釋到的鄱陽湖蚌類群落結(jié)構(gòu)差異尚未達到顯著性水平(R=0.002,P=0.398); 表層水和沉積物的蚌類的群落結(jié)構(gòu)有顯著性差異(R=0.148,P=0.032); 底層水和沉積物的蚌類的群落結(jié)構(gòu)差異達到極顯著性水平(R=0.272,P=0.007; 圖 5)。

圖4 冬季和春季注釋到的蚌類群落NMDS排序Fig. 4 NMDS ordination of mussel communities annotated in winter and spring

圖5 表層水、底層水和沉積物注釋到的蚌類群落NMDS排序Fig. 5 NMDS ordination of mussel communities annotated by surface water, bottom water and sediment

2.4 基于環(huán)境DNA宏條形碼技術(shù)的鄱陽湖蚌類群落結(jié)構(gòu)與環(huán)境因子的關(guān)聯(lián)分析

基于環(huán)境DNA宏條形碼技術(shù)檢測到的蚌類物種數(shù)據(jù)進行冗余分析(Redundancy analysis, RDA)顯示環(huán)境因子中水深(WD)、透明度(SD)、水溫(WT)和總氮(TN)均顯著影響排序結(jié)果(表 4)。

表4 環(huán)境因子對蚌類群落結(jié)構(gòu)的差異性檢驗Tab. 4 Difference test of environmental factors on community structure of mussels

各蚌類物種與環(huán)境因子之間的相關(guān)性Heatmap分析表明: 河蟶蚌、扭狀矛蚌、矛形楔蚌、圓頭楔蚌、短褶矛蚌、橄欖蟶蚌、魚尾楔蚌和背角無齒蚌均與溶解氧和總氮呈顯著或極顯著負相關(guān),與水深呈顯著或極顯著正相關(guān)。大多數(shù)的蚌類物種與葉綠素a、透明度和水溫之間呈顯著或極顯著正相關(guān)。蚌類與酸堿度和總磷的相關(guān)性不大(圖 6)。

圖6 蚌類物種與環(huán)境因子的相關(guān)性Heatmap分析Fig. 6 Heatmap analysis of correlation between mussel species and environmental factors

3 討論

3.1 基于環(huán)境DNA高通量測序的鄱陽湖蚌類物種組成

本研究利用環(huán)境DNA宏條形碼技術(shù)在鄱陽湖共注釋到蚌類33種, 而傳統(tǒng)方法共采集蚌類18種,且環(huán)境DNA注釋到的蚌類物種覆蓋了傳統(tǒng)方法采集到的所有物種。這說明環(huán)境DNA宏條形碼技術(shù)在蚌類的監(jiān)測中分辨率高于傳統(tǒng)方法的。這與陳金萍的調(diào)查結(jié)果一致[18]。Prié等[16]在其他雙殼類的研究中也得出類似的結(jié)果。本研究注釋到的33種蚌類中有30種是鄱陽湖歷史記錄種, 還有3種鄱陽湖非記錄種: 扁棱蚌P. tenuis和鴨無齒蚌A. anatina和S. fukudai(該物種主要分布在韓國, 故沒有找到相應(yīng)的中文名字), 原因可能是本地數(shù)據(jù)庫不完整造成的假陽性。如扁棱蚌、鴨無齒蚌和S. fukudai代表的OTU在本地數(shù)據(jù)庫中注釋到的分別是蚶形無齒蚌、扭狀矛蚌和背角無齒蚌, 序列相似度分別為96.43%、95.53%和96.43%; 而在公共數(shù)據(jù)庫中注釋到的分別是扁棱蚌、鴨無齒蚌和S. fukudai, 序列相似度分別為97.32%、97.30%和97.32%。利用環(huán)境DNA宏條形碼技術(shù)進行物種鑒定時, 所獲結(jié)果的可靠性依賴于參考數(shù)據(jù)庫的完整性和質(zhì)量[26,27]。

本研究統(tǒng)計相對序列豐度高的物種分別為橄欖蟶蚌和圓頂珠蚌等, 而在傳統(tǒng)調(diào)查中生物量高的物種分別為洞穴麗蚌和扭狀矛蚌等(表 2)。雖然相對序列豐度受物種豐度的影響, 在一定程度上相對序列豐度體現(xiàn)了物種在環(huán)境中可能具有的豐度相互關(guān)系[28], 但二者的相關(guān)性不太確定[29,30], 而且環(huán)境中物種DNA的釋放、運輸和降解, 到環(huán)境樣本的采集與提取、目的片段的擴增和高通量測序, 這些因素都會影響相對序列豐度與物種豐度的關(guān)系[31]。橄欖蟶蚌有歷史生物量的記錄, 且橄欖蟶蚌的生物量不高[32]。本研究傳統(tǒng)采樣方法中沒有采集到橄欖蟶蚌活體(只采到空殼), 但是環(huán)境DNA相對序列豐度卻最高, 可能跟以下兩個因素有關(guān)。一是跟傳統(tǒng)方法采樣所用的工具有關(guān), 傳統(tǒng)方法采樣通常用彼得森采泥器或自制蚌耙, 而橄欖蟶蚌的生活習(xí)性不同于其他蚌類, 使用彼得森采泥器或自制蚌耙比較難采到; 二是引物偏好性導(dǎo)致的環(huán)境DNA相對序列豐度高。

本研究中很多的蚌類物種只可分辨母系來源的序列, 是因為數(shù)據(jù)庫中父系數(shù)據(jù)的缺失。蚌類在繁殖期雄性個體將精子排到水中, 而雌性個體的成熟卵細胞則聚集于鰓水管內(nèi), 接著精子通過水流而進入雌蚌鰓水管, 完成卵細胞的受精過程[33]。在能分辯父系和母系來源的序列物種中, 繁殖期正逢采樣期的物種通常父系reads多于母系的, 如背角無齒蚌和圓頂珠蚌[34]; 繁殖期不處在采樣期的物種通常母系reads更多, 如橄欖蟶蚌[35]。

3.2 基于環(huán)境DNA高通量測序的鄱陽湖蚌類多樣性分析

基于環(huán)境DNA宏條形碼的鄱陽湖蚌類Alpha多樣性顯示冬季和春季的蚌類多樣性水平差異不顯著, 傳統(tǒng)方法的研究也表明蚌類多樣性水平季節(jié)差異不顯著[36]。春季注釋到的蚌類物種數(shù)多于冬季,這和多數(shù)蚌類所處的繁殖期恰好是本研究的采樣期有關(guān); 傳統(tǒng)方法的采集顯示冬季采集到的物種數(shù)多于春季, 這與冬季較低的水位有關(guān)。基于Bray-Curtis距離矩陣的Beta多樣性分析顯示鄱陽湖冬季和春季的蚌類群落結(jié)構(gòu)差異顯著, 這可能與這兩個季節(jié)分別注釋到的物種數(shù)不同有關(guān)。

水體樣本注釋到的蚌類物種數(shù)多于沉積物樣本注釋到的物種數(shù), 水體樣本蚌類Alpha多樣性水平顯著高于沉積物樣本的, Beta多樣性分析也顯示水體樣本和沉積物樣本存在顯著性差異。水體中環(huán)境DNA來源廣泛, 釋放進入水體的DNA因沉降作用而在沉積物中積累, 而沉積物又在外力(如垂直流、底棲生物擾動和人為干擾等)作用下再懸浮[37],向周圍釋放環(huán)境DNA, 使得水體中環(huán)境DNA濃度升高, 從而使得水體樣本檢出的物種種類和多樣性值均高于沉積物樣本。表層水和底層水注釋到的蚌類物種數(shù)一樣多, 表層水和底層水Alpha和Beta多樣性均無差異, 這說明蚌類的環(huán)境DNA在水體中無垂直分布差異。表層水和底層水注釋到的蚌類物種數(shù)均分別高于沉積物的, 且表層水和底層水注釋到的蚌類物種分別完全覆蓋沉積物的(表 1)。這些結(jié)果表明在進行蚌類的環(huán)境DNA研究時采水樣比采沉積物效果好, 且表層水和底層水無顯著差異。

3.3 基于環(huán)境DNA高通量測序的鄱陽湖蚌類物種與環(huán)境因子的冗余分析

本研究通過關(guān)聯(lián)鄱陽湖蚌類物種信息和環(huán)境因子表明水深(WD)顯著影響排序結(jié)果, 這和陳金萍的結(jié)果一致[18]。這與蚌類喜棲息在淺水區(qū)有關(guān)。過深的水位通過影響光照強度, 降低水體透光性, 從而影響生物的光合作用, 使得浮游生物的生產(chǎn)量降低[38], 使得蚌類食物來源減少。且隨著水深增加, 溶解氧(DO)含量降低[39], 過低的溶解氧會對水生生物產(chǎn)生不利影響[40]; 而在水位過淺時, 蚌類暴露和被捕食的風(fēng)險也將增加[41]。透明度(SD)、水溫(WT)和總氮(TN)也是造成冬季和春季蚌類物種群落結(jié)構(gòu)變化的重要環(huán)境因子。透明度是判斷水體藻類多寡的最直觀的指標(biāo)[42], 蚌類的食物組成與水體藻類組成有緊密關(guān)系[43], 故透明度也是影響蚌類群落結(jié)構(gòu)變化的因子之一, 傳統(tǒng)方法對蚌類研究也得出相同的結(jié)果[12]。適宜的水溫, 不僅可以提高蚌類攝食強度和新陳代謝強度[36], 還有利于浮游植物的生長與繁殖[44]。蚌類對氨的敏感性很高, 尤其是在其幼蟲和幼體階段[45,46]。Galbraith等[47]的結(jié)果表明: 蚌類物種豐富度的長期下降與氮濃度的增加有關(guān), 故總氮(TN)也是顯著影響蚌類物種群落結(jié)構(gòu)的重要因子之一。也有研究報道魚尾楔蚌與水溫成正相關(guān), 與溶解氧呈負相關(guān), 這是因為魚尾楔蚌的呼吸和排泄與水溫息息相關(guān), 在一定水溫范圍內(nèi), 隨著水溫的升高, 魚尾楔蚌的耗氧率和排氨率均增加[48]。水溫作為控制溶解氧分布和變化最重要的環(huán)境因子[49], 水溫的增加會使溶解氧濃度降低[50,51]。

4 結(jié)論

環(huán)境DNA宏條形碼技術(shù)能夠有效地檢測蚌類物種, 提供關(guān)于其物種組成和群落結(jié)構(gòu)的數(shù)據(jù), 能發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)方法中經(jīng)常被低估的稀有物種或很難找到的物種。使用環(huán)境DNA宏條形碼技術(shù)監(jiān)測蚌類資源時采水樣比采沉積物效果好, 且表層水和底層水無顯著差異。完善的參考數(shù)據(jù)庫可增加檢測的可靠性, 同時不過度依賴分類學(xué)專家。但參考數(shù)據(jù)庫的構(gòu)建需要分類學(xué)專家的協(xié)助以確保正確的物種鑒定。在環(huán)境DNA研究的發(fā)展領(lǐng)域中讀數(shù)和生物量之間的關(guān)系, 以及這些關(guān)系如何受到環(huán)境變量、特定環(huán)境DNA來源等的影響還是不清楚。隨著環(huán)境DNA宏條形碼技術(shù)的不斷發(fā)展, 我們預(yù)計它將會越來越多地被用于描述水生生物的多樣性, 為水生生態(tài)系統(tǒng)的保護和管理提供依據(jù)。

致謝:

感謝郭婷、吳陳慧孜、賈晨等在水樣采集工作中提供的幫助; 感謝黃曉晨老師和代雨婷在數(shù)據(jù)分析方面提供的幫助。