應用指紋圖譜區(qū)分降香黃檀中油梨和糠梨

魏建華，李冠斯，黃學泓，許如蘇

(汕頭海關(guān)技術(shù)中心，廣東汕頭 515031)

紅木作為一類珍貴的木材資源，它不是樹木分類學上某個樹種的名稱，而是來源于明清時代的宮廷、王府及不同地區(qū)的生產(chǎn)者和經(jīng)銷商，經(jīng)長期自然形成的經(jīng)過歸類的木材商品名。由于其具有特征性顏色與良好物理力學性能而備受人們青睞，在不同時代不同地區(qū)紅木都有著不同的內(nèi)涵[1]。由于紅木類資源非常短缺，隨著國民經(jīng)濟的快速增長，人們對木質(zhì)材料的追求不論質(zhì)還是量都越來越高，所以紅木價格很高，其中不同種類的紅木價格差別又極大。由于紅木造假利潤空間極大，于是以次充好、以假亂真的現(xiàn)象較為普遍[2-3]。

蝶形花科黃檀屬降香紫檀(Dalbergiaodorifera)，由于分布在我國海南島，所以也稱海南黃花梨，樹種的立地條件、氣候條件等區(qū)別，造就了降香黃檀分油梨和糠梨2種，兩者顏色、紋理和密度外形有所差別。由于木材名稱一般是以屬為基礎(chǔ)，把特征相似、性質(zhì)相近、用途相同的種歸類，沒有辦法將同屬降香黃檀的兩類區(qū)分出來。傳統(tǒng)木材鑒定以木材解剖學為依據(jù)，如我國現(xiàn)行的國家標準GB/T 18107—2017《紅木》[4]，通過木材的一些微觀解剖結(jié)構(gòu)如生長輪類型、心材材色、軸向薄壁組織形態(tài)、結(jié)構(gòu)、香氣等進行鑒別，傳統(tǒng)木材鑒定往往對紅木鑒定到“屬”，鑒定到“種”就很困難，而油梨和糠梨是降香黃檀樹種以下的分類。傳統(tǒng)木材鑒定主要是以簡便實用的宏觀特征(如密度、材色、重量、結(jié)構(gòu)和紋理)為依據(jù)來確定，輔以必要的木材解剖特征與觀察記載相比較，從而實現(xiàn)對木材的鑒定[5-6]。但是市場上由于油梨和糠梨質(zhì)地和消費者的偏好，導致兩者價格差別很大。紅木專家有根據(jù)兩者產(chǎn)地、顏色、紋理和密度外形的差別進行區(qū)別的經(jīng)驗，但是有一定的主觀不確定性，尤其對于不易區(qū)分出的又像油梨又像糠梨，不具有客觀統(tǒng)一的標準[7-8]。該研究嘗試直接對降香黃梨木材提取物進行高效液相分析，將試驗分析與化學計量法兩者結(jié)合分析，依據(jù)油梨和糠梨所含有的化學成分的區(qū)別，采用高效液相法結(jié)合指紋圖譜分析，以期較準確區(qū)分降香黃梨木中的油梨和糠梨[9]。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑Agilent 1200型高效液相色譜儀(美國)，DAD檢測器，四元梯度泵；Millipore Advantage A10超純水系統(tǒng)(美國)；梅特勒-托利多AL204-IC電子分析天平(瑞士)；CBL photoelectron TECHNOLOGY Model C9860A型超聲波清洗器。乙腈、甲酸為色譜純；液相用水為超純水；其余試劑均為分析純。

1.2 試驗材料降香黃檀紅木樣品是原汕頭出入境檢驗檢疫局多年來積累紅木標本；通過汕頭出入境檢驗檢疫局木材鑒定人員的鑒定，結(jié)合報檢的原產(chǎn)地資料，正確定名的樹種樣品，請木材鑒定人員根據(jù)國家標準GB/T 18107—2017《紅木》的鑒定定名；隨機抽取正確定名的樹種其中一樣品送原廣東出入境檢驗檢疫局技術(shù)中心國家木制品檢測重點實驗室鑒定，并出具鑒定證書作為定名的復核方式。降香黃檀拉丁文名為D.odoriferaT.C.Chen，屬于黃檀屬，香枝木類，產(chǎn)地為中國，該研究使用的樣品分別為糠梨9個、油梨7個。

1.3 供試品的制備稱取降香黃檀紅木樣品(已經(jīng)通過傳統(tǒng)木材形態(tài)學鑒定，被正確定名的樣品)心材部分木屑0.2 g(精確至0.001 g)，包括典型的油梨和糠梨心材部分，置于50 mL離心管中，加入5 mL甲醇、5 mL高純水，振搖5 min，超聲提取5 min，濾紙過濾，再以0.2 μm的微孔濾膜過濾后備用[9]。

1.4 色譜條件色譜柱為Agilent Eclipse XDB-C18，填料粒徑5 μm，柱長250 mm，柱內(nèi)徑4.6 mm；以水為流動相A，乙腈為流動相B，按照表1進行梯度洗脫；檢測波長290 nm；柱溫30 ℃；流速1.0 mL/min。

表1 梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution procedure

1.5 樣品測定吸取“1.3”所得供試品溶液，注入高效液相色譜儀中進行高效液相色譜檢測，進樣量為20 μL。按照“1.4”色譜條件分析測定，采集103 min色譜數(shù)據(jù)。

1.6 數(shù)據(jù)分析將經(jīng)過高效液相采集的木材圖譜，導入色譜指紋圖譜相似度評價軟件中進行指紋圖譜共有峰、強峰、特征峰確證和相似度分析，通過多個典型的油梨和糠梨降香黃檀紅木樣品，建立對應的油梨和糠梨的對照圖譜，并建立譜庫。

對于每個收集到的降香黃檀樹種的高效液相采集的譜圖，將其導入國家藥典委員會頒布的“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(2012版)”，選取時間窗寬度為0.1～0.2 min，以中位數(shù)生成對照譜圖，經(jīng)過多點校正后自動匹配，生成其指紋圖譜對照譜圖，并計算所比對批次樣品的指紋圖譜與該對照譜圖的相似度。在多批降香黃檀的共有峰中篩選出峰面積較高的且穩(wěn)定出現(xiàn)的峰作為油梨和糠梨的標準指紋圖譜的特征峰，從而建立降香黃檀中油梨和糠梨的標準指紋圖譜。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜指紋圖譜的建立分別測定7批典型的油梨和9批典型的糠梨HPLC指紋圖譜，并進行分析比較，得到由其共有特征峰構(gòu)成的區(qū)別降香黃檀中油梨和糠梨的指紋圖譜，見圖1。

圖1 降香黃檀中油梨和糠梨的標準指紋圖譜Fig.1 Standard fingerprint of oil pear and bran pear in Dalbergia odorifera

分別將7批油梨和9批糠梨樣品指紋圖譜導入國家藥典委員會頒布的“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(2012版)”，選取時間窗寬度為0.2 min，以中位數(shù)生成對照譜圖，經(jīng)過多點校正后自動匹配，分別生成油梨指紋圖譜和糠梨指紋圖譜共有模式，并分別計算與對應共有模式的相似度。油梨共有模式含有共有特征峰17個，保留時間分別為10.194、19.575、24.208、25.627、27.305、28.141、31.900、33.785、38.336、39.618、41.636、45.414、47.237、48.495、54.045、56.92、61.009 min，以12號峰峰面積最大。其中油梨的17個共有峰和糠梨的6個共有峰，經(jīng)驗證其信噪比S/N都大于10，說明峰信號穩(wěn)定，分別在各批次都穩(wěn)定出現(xiàn)，故確定其為共有特征峰。油梨的12號峰和糠梨的2號峰具有非常相近的保留時間，分別為45.414和45.457 min。7批油梨與其對照圖譜相似度分別為0.851、0.909、0.909、0.891、0.871、0.950、0.888，7批樣品的相似度均在0.800以上?？防婀灿心Ｊ胶泄灿刑卣鞣?個，保留時間分別為24.269、45.457、47.308、61.786、65.923、69.918 min，以5號峰峰面積最大；9批糠梨與其對照圖譜相似度分別為0.921、0.898、0.950、0.946、0.985、0.816、0.986、0.835、0.985，9批樣品的相似度均在0.800以上。

2.2 數(shù)據(jù)標準化并設(shè)置區(qū)別油梨和糠梨的判斷指標數(shù)據(jù)標準化的目的是避免了保留時間數(shù)據(jù)漂移和色譜檢測儀器造成的峰面積不一致問題，以便于使用多元分析法進行分類。樣品指紋圖譜進行標準化處理，首先需要確定基峰，其次樣品指紋圖譜中共有特征峰的保留時間和峰面積與基峰的保留時間和峰面積的比值為相對保留時間和相對峰面積。

以油梨和糠梨共有峰保留時間是(45.414±0.500)min作為參照峰，分別列出油梨樣品17個共有峰和糠梨樣品的6個共有峰，并分別列出所述7批油梨和9批糠梨保留的油梨樣品和糠梨樣品對應各自參照峰的相對峰面積，通過大量試驗，反復比對，找到區(qū)別油梨和糠梨的特征，參見表2。

油梨和糠梨都包含保留時間是45.414 min的峰，而且峰面積都很大，兩者的主要區(qū)別表現(xiàn)為最大峰和特征峰的不同：①最大峰，油梨的峰面積最大峰保留時間為45.414 min，糠梨的峰面積最大峰保留時間為65.923 min。②特征峰，3個特征峰的保留時間分別為19.575、27.305、39.618 min，油梨同時含有這3個特征峰；糠梨僅含有其中1個或者2個峰，不同時包含。

為了盡量消除各種其他的原因?qū)е赂咝б合嗌V方法獲得的指紋圖譜保留時間漂移帶來的影響，該研究設(shè)置區(qū)別油梨和糠梨的判斷指標，設(shè)定為保留時間(45.414±0.500)min、面積最大的特征峰作為參照峰，5個特征峰采用與參照峰的相對保留時間表示，分別是0.431、0.601、0.872、1.000、1.452，根據(jù)這5個特征峰的有無以及最大峰面積，區(qū)分油梨和糠梨。對于降香黃檀樣品，判斷其是油梨或者糠梨標準：①油梨，至少同時具有4個特征峰，相對保留時間分別是0.431、0.601、0.872、1.000，并且面積最大的峰是相對保留時間為1.000的特征峰梨；②糠梨，至少同時具有2個特征峰，相對保留時間分別是1.000和1.452，面積最大的峰是相對保留時間為1.452的特征峰，且不同時包含相對保留時間分別是0.431、0.601、0.872這3峰。

表2 7批油梨和9批糠梨的區(qū)別特征Table 2 Differences between 7 batches of oil pears and 9 batches of bran pears

2.3 方法學考察

2.3.1精密度試驗。取油梨同一供試品溶液，依據(jù)“1.4”色譜條件、“1.5”樣品測定方法，連續(xù)進樣5次。將其指紋色譜圖導入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(2012版)，與生成的對照指紋圖譜對比，各圖譜的相似度均大于0.984。以12號峰為參照峰，計算出1～17號共有指紋峰的相對保留時間的RSD均小于3.0%，且相對峰面積的RSD均小于0.5%，表明儀器穩(wěn)定、精密度良好。

2.3.2重現(xiàn)性試驗。取同一批油梨木屑，精密稱取5份，按“1.3”供試品制備方法平行制備5份供試品溶液，分別依據(jù)“1.4”色譜條件、“1.5”樣品測定方法進樣，同法進行檢測。將其指紋色譜圖導入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(2012版)，與生成的對照指紋圖譜相比，5份樣品的相似度均大于0.990。以12號峰為參照峰，計算出1～17號共有指紋峰的相對保留時間的RSD均小于2.0%，由于天然紅木樣品的不均一性，4號峰相對峰面積的RSD為0.9%，其他共有峰相對峰面積的RSD均小于0.5%，表明該方法共有峰保留時間重現(xiàn)性良好。

2.3.3穩(wěn)定性試驗。取油梨同一份供試品溶液(C3)，依據(jù)“1.4”色譜條件、“1.5”樣品測定方法，分別于0、3、6、9、15、24 h進樣檢測。將其指紋色譜圖導入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(2012版)，與生成的對照指紋圖譜相比，6份樣品的相似度均大于0.980。以12號峰為參照峰，計算出1～17號共有指紋峰的相對保留時間的RSD均小于1.5%，且相對峰面積的RSD均小于0.3%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

3 小結(jié)與討論

對紅木的鑒定不能照搬中藥材質(zhì)量控制、道地性和真?zhèn)舞b別的指紋圖譜方法，紅木樹種鑒定的相似度判斷指標和相對保留時間、相對峰面積的標準偏差判斷指標比一般的中藥材等一年生的植物的范圍要寬一些才有實用意義。其保留時間的含義是對應樣品所含的化學成分，峰面積含義是該化學成分的量，為了盡可能地減少各種條件造成的高效液相保留時間的漂移對指紋圖譜的影響，所以在此研究相對保留時間和相對峰面積。

該研究提供一種應用指紋圖譜區(qū)別降香黃檀中油梨和糠梨的方法。具體如下：將降香黃檀的供試品溶液進行高效液相色譜檢測，獲得指紋圖譜；其中將保留時間(45.414±0.500)min且面積最大的特征峰作為參照峰；若指紋圖譜至少包含相對保留時間分別是0.431、0.601、0.872、1.000的4個峰，并且其中相對保留時間為1.000的特征峰是指紋圖譜中峰面積最大的特征峰，那么降香黃檀為油梨；若指紋圖譜至少包含相對保留時間為1.000和1.452這2個峰，且相對保留時間為1.452的特征峰是指紋圖譜中峰面積最大的特征峰，相對保留時間分別是0.431、0.601、0.872的這3個特征峰并不同時在該指紋圖譜中出現(xiàn)，那么降香黃檀為糠梨。對于已知降香黃檀的紅木，可以利用指紋圖譜相似度軟件分析相似度，結(jié)合共有特征峰相對保留時間的標準偏差進行油梨和糠梨的進一步分類判斷。

作為指紋圖譜研究的重要參數(shù)色譜條件中波長的選擇，主要是考慮2個方面：一方面，能較多地檢測出木材浸提物中的化學物質(zhì)，以便于呈現(xiàn)其整體特征，又不能太多，否則色譜峰數(shù)量太多對后續(xù)的統(tǒng)計分析帶來的工作量太大；另一方面，對于降香黃檀的指紋圖譜研究，其目的在于油梨和糠梨的區(qū)分，而不是研究其所含化學成分，所以需要采用一致的紫外波長，即選擇一個能兼顧多種紅木樹種或者摻偽樹種指紋圖譜的研究，以便于比較。沈明月等[10]采用波長為290 nm研究了4種紅木的HPLC指紋圖譜，該研究參照文獻，采用同樣的波長。從該研究的結(jié)果來看，采用該波長能夠滿足降香黃檀中油梨和糠梨的區(qū)分。

對于木材識別，由最早的樹木分類科、屬系統(tǒng)根據(jù)宏觀的顏色、氣味、氣干密度等特征，發(fā)展到根據(jù)微觀的木材解剖學角度的顯微結(jié)構(gòu)識別。降香黃檀中由于稀缺程度，木質(zhì)特點，油梨和糠梨的價格相差懸殊。HPLC標準指紋圖譜技術(shù)具有人為因素較小、分辨率高、特異性強、快速準確的特點，作為一種輔助傳統(tǒng)方法的木材識別方法，可以鑒定到降香黃檀這個樹種內(nèi)部的分類，對于木材交易市場、木材經(jīng)銷商、消費者、公安機關(guān)、海關(guān)和科研機構(gòu)等具有很強的應用價值。