基因編輯快速改良玉米開花期研究

邢瑞霞，朱金潔，祁顯濤，謝傳曉，劉昌林，江海洋

(1.安徽農業(yè)大學生命科學學院，安徽合肥 230036；2.中國農業(yè)科學院作物科學研究所，北京 100081)

玉米是在全球廣泛種植的主要糧食作物之一，也是重要的飼料作物和重要的工業(yè)原料。高產、穩(wěn)產、優(yōu)質、適宜的生育期、適應機械化一直都是國內外玉米育種的主要目標。生育期作為玉米重要的農藝性狀，其改良工作也一直是玉米育種工作的研究熱點。玉米起源于熱帶的墨西哥西南部，由大芻草馴化而來，對光周期敏感，并需要在短日照條件才能開花[1]，利用基因編輯技術減少玉米植株對光周期的敏感性及改良玉米的開花期在農業(yè)生產上有著重要意義。適當縮短生育期不僅能夠擴大其種植范圍，提高復種指數，而且可以有效降低遭遇抽雄揚花期的高溫危害、灌漿后期早霜危害、成熟期雨季穗發(fā)芽以及晚期病蟲害等的概率。

ZmCCT10(Zm00001eb418700)位于玉米的10號染色體，屬于玉米中的CCT家族，與水稻光周期反應調節(jié)因子Ghd7同源，同源性在36%左右，其編碼的蛋白質含有保守的CCT結構域，作為轉錄因子微量調節(jié)開花開關基因ZCN8的表達，進而影響玉米生育期[2-5]。筆者以基因編輯ZmCCT10基因玉米T6代純合突變體系以及親本KN5585自交系為試驗材料，在短日照(海南)、長日照(北京)地區(qū)進行種植，通過對植株開花期及其他農藝性狀的觀察，研究ZmCCT10突變對于生育期的影響，以期為進一步探索通過改良開花期進而達到穩(wěn)產、增產的目的提供了新方法。

1 材料與方法

1.1 供試材料ZmCCT10基因來自玉米本身的內源基因，通過基因測序獲得轉化受體KN5585的CDS序列后，進行sgRNA的設計，構建CRISPR/Cas9敲除載體，通過農桿菌轉化后獲得轉基因材料，經過多代自交獲得不含有轉基因元件的基因編輯材料，繁殖至T6代ZmCCT10-1IT及ZmCCT10-1IA株系；親本對照自交系KN5585，由未米生物科技(江蘇)有限公司提供。

1.2 Cas9基因編輯敲除載體構建以KN5585為背景材料，其基因序列與B73略有差別。通過測序獲得ZmCCT10的CDS序列后，在http://crispr.hzau.edu.cn/cgi-bin/CRISPR2/CRISPR?tdsourcetag=s_pctim_aiomsg網站中設計sgRNA，為保證編輯效率，一般選擇5′G—NGG3′的sgRNA，再利用https://www.gramene.org/網站進行BLAST后選取特異性較高的sgRNA，構建可以通過胚熒光篩選的單sgRNA-Cas9敲除的基因編輯載體。

基因編輯基礎載體CPB-Cas9(已連入Ubiquitin啟動子驅動的Cas9表達盒)由中國農業(yè)科學院謝傳曉課題組提供，加入熒光篩選系統(tǒng)快速辨別籽粒陰陽性。熒光篩選系統(tǒng)采用胚特異性啟動子ZmESP啟動RFP熒光蛋白。

1.3 轉化鑒定與基因型鑒定將構建好的基因編輯敲除載體送至未米生物科技(江蘇)有限公司進行農桿菌轉化，獲得轉基因材料。收獲的種子經過熒光篩選后，挑選陽性籽粒進行種植，進行ZmCCT10靶基因突變鑒定獲得轉基因材料，并將突變的材料進行自交，從收獲的籽粒中選擇選陰性籽粒進行種植，直至獲得純合無轉基因元件的突變體材料。

待T6代ZmCCT10-1IT及ZmCCT10-1IA株系成長到3葉期，采用CTAB法提取其葉片DNA后進行Cas9 PCR檢測、Bar PCR檢測及Bar試紙條檢測，確定ZmCCT10-1IT及ZmCCT10-1IA為無轉基因元件株系，再進行靶基因檢測，PCR產物送至生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序，利用SnapGene及DNAMAN進行序列比對確定其基因型。所需檢測引物序列見表1，檢測程序見表2。

表1 檢測所用引物序列Table 1 Primer sequence used for detection

表2 檢測PCR擴增反應程序Table 2 Procedure for PCR reaction

1.4 純合材料表型調查方法將穩(wěn)定且純合的無轉基因ZmCCT10-1IT、ZmCCT10-1IA株系以及親本對照KN5585種植在短日照的海南樂東黎族自治縣、長日照的北京南口中國農業(yè)科學院試驗基地2個地區(qū)，經緯度分別為109.17°E，18.7°N和116.2°E，40.2°N，并調查花期和植株農藝性狀，具體調查指標及方法見表3，探究ZmCCT10基因對于玉米生育期的影響。

表3 表型調查指標及方法Table 3 Phenotypic survey indicators and methods

1.5 數據統(tǒng)計數據取樣本量的平均值，經過Excel整理及初步分析后，用SigmaPlot 14.0進行統(tǒng)計分析，數據差異顯著采用經典T檢驗計算，**表示P<0.01極顯著差異，*表示P<0.05顯著差異，P>0.05表示無顯著差異。

2 結果與分析

2.1 Cas9基因編輯敲除載體圖譜U6啟動單sgRNA的熒光敲除載體圖譜如圖1所示，命名為CPB-Cas9-ZmCCT10。用E35S啟動子Bar的表達，可在真核生物中檢測是否含有該載體；UBI強啟動子啟動作為編輯器的Cas9，保證Cas9蛋白的高表達；胚特異性啟動子ZmESP啟動RFP表達，陽性籽粒可在波長為520 nm的綠色激發(fā)光下配以LUV-50A紅色眼鏡進行觀察，陽性籽粒會發(fā)出明亮的紅光，陰性籽粒則不發(fā)光；U6-2啟動sgRNA。

圖1 CPB-Cas9-ZmCCT10載體圖譜Fig.1 Vector of CPB-Cas9-ZmCCT10

2.2 無轉基因元件鑒定以及基因型鑒定將構建好的載體送至未米生物科技(江蘇)有限公司進行轉化，T0獲得42個植株，經過轉基因元件Bar和Cas9檢測后，獲得23株陽性植株，占比54.76%，獲得5種轉化事件，挑選其中2種移碼突變材料繼續(xù)進行生育期研究。根據其突變類型將這2種株系分別命名為ZmCCT10-1IT株系及ZmCCT10-1IA株系。在后代中，分離出無轉基因元件且含有目標突變的純合突變單株，自交繁種。選用T6代遺傳穩(wěn)定的無轉基因元件材料。

將所需檢測植株進行轉基因元件檢測以及靶基因檢測，圖2a為Bar檢測及試紙條檢測結果，以載體轉化的農桿菌作為陽性對照，野生型作為陰性對照，水作為空白對照，對目標植株進行Bar檢測，陽性植株檢測出符合大小的目的條帶，陰性植株及陰性對照、空白對照均未檢測出條帶，鑒于Bar檢測容易出現污染，同時使用Bar試紙條進行蛋白水平的檢測，2種檢測結果一致；圖2b為Cas9檢測結果，對照同Bar檢測，陽性植株檢測出符合大小的目的條帶，陰性植株及陰性對照、空白對照均未檢測出條帶；圖2c為靶基因檢測結果，以載體質粒作為陰性對照、水作為空白對照以及野生型作為陽性對照，2種突變體株系均檢測符合大小的目的條帶。

將測序后的靶基因序列利用DNAMAN及SnapGene進行比對，確定突變株系的突變類型，如圖3a所示，ZmCCT10-1IT株系在PAM上游第4位發(fā)生了一個加1T的插入；如圖3b所示，ZmCCT10-1IA株系在PAM上游第4位發(fā)生了一個加1A的插入，均引起移碼突變。根據檢測得到的序列，利用DNAMAN軟件對靶基因蛋白進行預測，如圖4a和4b所示，2種移碼突變均能夠引起蛋白的提前終止。

注：a.Bar檢測及試紙條檢測圖;b.Cas9檢測圖。1.陽性對照，載體農桿菌；2.陰性對照，野生型親本KN5585；3.空白對照，ddH2O；4、5.陽性ZmCCT10-1IT株系植株；6、7.陰性ZmCCT10-1IT株系植株；8、9.陽性ZmCCT10-1IA株系植株；10、11.陰性ZmCCT10-1IA株系植株。c.ZmCCT10靶基因檢測膠圖；1.陰性對照，載體質粒；2.空白對照，ddH2O；3.陽性對照，野生型親本KN5585；4、5.ZmCCT10-1IT株系；6、7.ZmCCT10-1IA株系。Note:a.Bar test and strip test chart, b.Cas9 test chart.1.Positive control, vector agrobacterium;2.Negative control, wild type parent KN5585;3.Blank control, ddH2O;4,5.Positive ZmCCT10-1IT strain plants;6,7.Negative ZmCCT10-1IT plant;8,9.Positive ZmCCT10-1IA strain plants;10,11.Negative ZmCCT10-1IA strain plants.c. ZmCCT10 target gene detection gel map; 1. Negative control, vector plasmid; 2. Blank control, ddH2O; 3. Positive control, wild type parent KN5585; 4,5. ZmCCT10-1IT strain; 6,7. ZmCCT10-1IA strain.圖2 轉基因成分檢測Fig.2 Detection of transgene elements

注：a.ZmCCT10-1IT株系與野生型比對結果圖；b.ZmCCT10-1IA株系與野生型對比結果圖；WT為野生型，親本KN5585；紅色框內為sgRNA。Note:a.The comparison result between ZmCCT10-1IT strain and wild type;b.The comparison result between ZmCCT10-1IA strain and wild type;WT is wild type,parent KN5585;the red box shows sgRNA.圖3 靶基因序列比對Fig.3 Comparison of sequence alignment of target gene

2.3 純合突變體株系ZmCCT10-1IT和ZmCCT10-1IA對開花期的影響將陰性純合突變株種植到海南和北京，種植模式為4 m行長,17株，株間距25 cm，行間距60 cm，按每行成活情況觀察各株系抽雄期、散粉期、吐絲期等與開花相關的表型，并進行數據統(tǒng)計與分析。如圖5a、5b、5c所示，在海南短日照地區(qū)，ZmCCT10-1IT株系與野生型相比，抽雄期提前3 d，散粉期提前4 d，吐絲期提前2 d，統(tǒng)計結果表明差異極顯著；ZmCCT10-1IA株系與野生型相比，抽雄期提前1 d，散粉期與野生型一致，吐絲期推遲1 d，抽雄期和吐絲期差異顯著。

如圖5d、5e、5f所示，在北京長日照地區(qū)，ZmCCT10-1IT株系與野生型相比，抽雄期提前2 d，差異極顯著，散粉期提前2 d，差異顯著，吐絲期提前3 d，差異極顯著；ZmCCT10-1IA株系與野生型相比，抽雄期提前1 d，差異顯著，散粉期提前3 d,差異顯著，吐絲期提前5 d，差異呈極顯著。由此可知，無論是在短日照還是在長日照地區(qū)，ZmCCT10基因對于玉米的開花期均有影響，敲除該基因能有效提前花期，且在長日照地區(qū)更為明顯，說明ZmCCT10在長日照條件下充當玉米的開花抑制因子。

農藝性狀是該研究考察的另一大重點。如圖6a、6b、6c所示，在海南短日照地區(qū)，ZmCCT10-1IT株系與野生型相比，株高降低18.6 cm，去雄株高降低15.2 cm，穗位高降低24.3 cm，差異均達極顯著水平；ZmCCT10-1IA株系與野生型相比，株高降低9.4 cm，去雄株高降低10.9 cm，穗位高降低0.8 cm，且均呈極顯著相關。如圖6d、6e、6f所示，在北京長日照地區(qū)，ZmCCT10-1IT株系與野生型相比，株高降低21.7 cm，去雄株高降低21.5 cm，穗位高降低22.8 cm，且差異均呈極顯著；ZmCCT10-1IA株系與野生型相比，株高降低16.3 cm，差異極顯著，去雄株高降低17.0 cm，差異顯著，穗位高降低8.7 cm，差異極顯著。植株整體表型如圖7所示。

注：a.ZmCCT10-1IT株系與野生型比對結果；b.ZmCCT10-1IA株系與野生型對比結果；WT為野生型，親本KN5585；紅色框內為突變后sgRNA結合位置。Note:a.ZmCCT10-1IT strain and wild type comparison result diagram;b.Comparison results of ZmCCT10-1IA strain and wild type;WT is wild type,parent KN5585;the red box shows the binding site of sgRNA after mutation.圖4 預測蛋白比對Fig.4 Comparison of prediction protein

注：WT為野生型；*表示與WT相比差異顯著(P<0.05)，**表示在WT相比差異極顯著(P<0.01)。Note:WT is wild type；* indicates significant difference compared with WT (P<0.05),** indicates extremely significant difference compared with WT(P<0.01).圖5 海南和北京開花期統(tǒng)計分析Fig.5 Statistical analysis of flowering time at Hainan and Beijing

3 結論與討論

注：WT為野生型；*表示與WT相比差異顯著(P<0.05)，**表示與WT相比差異極顯著(P<0.01)。Note:WT is wild type；* indicates significant difference compared with WT(P<0.05),** indicates extremely significant difference compared with WT(P<0.01).圖6 海南和北京植株水平農藝性狀統(tǒng)計分析Fig.6 Statistical analysis of agronomic traits at Hainan and Beijing

圖7 植株比較Fig.7 Plant comparison

開花期的探索一直是人類認識植物、了解植物繁衍生息最直觀的方式之一，是植物從營養(yǎng)生長向生殖生長發(fā)生不可逆轉變的重要標志，同時是決定植物對環(huán)境因素適應性的最重要性狀之一[6-7]。植物開花期的改良一直是擴大生產，提高土地利用率的有效手段。ZmCCT10是水稻光周期反應調節(jié)基因Ghd7的同源基因，受晝夜調控，包含一個CCT蛋白結構域，有研究表明該結構域在玉米的開花調控中起著重要作用[8]。另外，也有研究表明ZmCCT10在長日照的條件下作為開花抑制因子調節(jié)玉米開花[4，9]，在其上游的調控基因ZmCOL3 則可以通過激活 ZmCCT10 的表達來抑制開花時間[8]。在早花玉米中，在 ZmCCT10啟動子中檢測到一個類似 CACTA 的轉座因子，該轉座因子可明顯縮短植株的開花時間[9-10]。另外，與ZmCCT10同源的CCT家族基因ZmCCT9同樣受晝夜調控，負調控成花素基因ZCN8的表達，從而導致植株在長日照下推遲開花[11-12]。2018年有研究表明，利用基因編輯技術敲除ZmCCT9后，可導致玉米在長日照下提早開花，同時能夠增強植株對于高緯度地區(qū)的適應性[11]。有研究表明，ZmMADS69 抑制開花抑制因子 ZmRap2.7 的表達，從而促進ZCN8的表達并導致早期開花[13]。ZMM4基因可有效促進玉米成花轉變，并且過表達ZMM4可以促使轉基因植株比野生型更早開花[14]。

該研究結果表明，在長日照條件下ZmCCT10作為開花抑制因子調節(jié)玉米開花，利用基因編輯技術敲除ZmCCT10后，可有效促使玉米在長日照下提早開花并出現矮化等優(yōu)良性狀，為提高玉米抗倒伏、早熟等方面奠定了基礎。