基于Cytb基因的穿山甲科物種鑒定研究

王 辰,楊婭富,李 立,逯金瑤,李嘉昊,李 波,3*

(1.東北林業(yè)大學野生動物與自然保護地學院,黑龍江哈爾濱 150040；2.湖南省生物多樣性保護中心,湖南長沙 410000；3.國家林業(yè)和草原局野生動植物檢測中心,黑龍江哈爾濱 150040)

穿山甲是哺乳綱(Mammalia)鱗甲目(Pholidota)穿山甲科(Manidae)動物的統(tǒng)稱?，F(xiàn)存3屬8種：穿山甲屬(Manis)的中華穿山甲(M.pentadactyla)、印度穿山甲(M.crassicaudata)、馬來穿山甲(M.javanica)和菲律賓穿山甲(M.culionensis)；地穿山甲屬(Smutsia)的南非穿山甲(S.temminckii)和大穿山甲(S.gigantea)；長尾穿山甲屬(Phataginus)的樹穿山甲(P.tricuspis)和長尾穿山甲(P.tetradactyla),分布于亞洲和非洲的熱帶和亞熱帶地區(qū)[1-6]。

穿山甲因有食用和藥用價值而遭到人類的亂捕濫獵，加之生境被破壞及外來物種入侵等因素,其野生種群數(shù)量急劇下降,甚至面臨滅絕[7-8]。2016年10月,CIETS締約國大會通過“所有8種穿山甲物種由附錄II 提升至附錄 I”的提案[9-10]。由此,為打擊穿山甲的非法貿(mào)易需要選擇合適的分子標記、構(gòu)建標準的物種鑒定方法。

線粒體基因組作為“擴展條形碼”[11],常用于物種鑒定和系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系評估[12-13]。該技術(shù)成本較為昂貴,不適合在穿山甲非法貿(mào)易頻發(fā)的東南亞和非洲國家推廣使用。線粒體細胞色素b(Cytochrome b,Cytb)基因進化速率適中、含有豐富的遺傳信息、結(jié)構(gòu)清晰,被廣泛地應用于物種鑒定[14]。目前,基于Cytb基因的穿山甲物種鑒定多是利用脊椎動物或哺乳動物通用引物,所擴增的序列長度長短不一[15-18]。研究表明，利用穿山甲科特異引物可以有效排除非目標物種的干擾[15],Cytb基因序列長度變化可能影響鑒定結(jié)果的判讀[19]。由此,筆者依據(jù)Cytb基因設(shè)計了穿山甲科物種鑒定的特異引物,并評估4種長度的Cytb基因序列對穿山甲物種鑒定的影響。

1 材料與方法

1.1 材料收集191份穿山甲樣品。其中,174份為已知馬來穿山甲樣本,包括128份肌肉樣,18份皮膚樣,12份糞便樣,7份毛發(fā)樣,9份鱗片樣,剩余17份樣本為未知穿山甲樣本,其中包括1份疑似穿山甲鱗片粉末(表1)。利用智人(Homosapiens,n=3)、貉(Nyctereutesprocyonoides,n=3)、朱頂雀(Acanthisflammea,n=3)、東北兔 (Lepusmandshuricus,n=1)、牛(Bostaurus,n=1)、虎(Pantheratigris,n=1)、家豬(Susscrofadomestica,n=1)的DNA作為非穿山甲物種對照樣本。上述樣本均來自國家林業(yè)和草原局野生動植物檢測中心樣本庫。樣品采集后于-20 ℃冰箱內(nèi)保存。同時,從NCBI上下載135條序列穿山甲物種(表1)和部分非穿山甲物種的Cytb基因同源序列用于引物設(shè)計和序列綜合分析。

1.2 方法

1.2.1DNA提取。穿山甲鱗片用75%乙醇清洗表面,經(jīng)滅菌去離子水清洗、風干后剪取其表面殘留的皮膚組織或毛發(fā),或鉆取鱗片粉末。將皮膚、毛發(fā)及鱗片粉末分別裝入1.5 mL離心管。將肌肉樣剪碎后置于1.5 mL離心管。使用AxyPrepTM Multisource Genomic DNA Miniprep Kit試劑盒(愛思進)提取肌肉、毛發(fā)、皮膚及鱗片的總DNA。另外,稱取180～220 mg的糞便使用QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit試劑盒(愛思進)提取總DNA。DNA提取步驟均參考試劑盒說明書,DNA原液存放于-20 ℃冰箱。

表1 穿山甲科試驗樣本及GenBank來源序列信息Table 1 Experimental samples and sequence information downloaded from GenBank for pangolin

1.2.2引物設(shè)計。利用Primer PREMIER 6.0軟件基于馬來穿山甲Cytb全序列設(shè)計穿山甲科特異PCR引物。引物搜尋參數(shù)包括：熔解溫度(Tm)為60 ℃、引物長度(Length)為18～30 bp、擴增產(chǎn)物長度(amplication length)為70～200 bp,余下參數(shù)為默認值。使用MEGA 5.0中的BLAST程序篩選滿足設(shè)計原則的引物,參考的非穿山甲物種的同源序列包括：兔形目的穴兔(Oryctolaguscuniculus,HQ596486、KT626640)、食肉目的土狼(Canislatrans,KT447695～KT447698)和家犬(CanislupusfamiliarisGU249573、MH714782～MH714784、KJ660981、KJ660982)、翼手目的蝙蝠(Ardopsnichollsi,KJ024748～KJ024751)、偶蹄目的牛(Bostaurus,KT626620)、貧齒目的犰狳(Dasypusnovemcinctus,KU253494、KT626619、KT626620)和靈長目的智人(Homosapiens,JN034134 ～JN034136)。

1.2.3PCR擴增和測序。利用3對引物：L14724/H15149[26]、mcb398/mcb869[27]、DCW-F1/DCW-R1分別擴增穿山甲科自有樣本(表1)Cytb基因部分序列。反應體系均為50 μL：5 μL DNA模板,0.5 μL上、下引物,25 μL DNA 聚合酶(Transgen,北京),19 μL滅菌去離子水。PCR在PE9700型DNA擴增儀(PE,美國)進行。L14724/H15149反應條件為：預變性95 ℃/5 min(變性95 ℃/30 s,退火56 ℃/30 s,延伸72 ℃ 1 min),循環(huán)40次,延伸72 ℃ 5 min；mcb398/mcb869反應條件為：預變性94 ℃ 5 min(變性94 ℃ 1 min,退火52 ℃ 30 s,延伸72 ℃ 30 s),循環(huán)35次,延伸72 ℃ 10 min； DCW-F1/DCW-R1反應條件為：預變性94 ℃ 5 min,(變性94 ℃ 1 min,退火53 ℃ 30 s,延伸72 ℃ 30 s),循環(huán)35次,延伸72 ℃ 10 min。擴增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測后送至北京擎科生物技術(shù)有限公司哈爾濱分公司利用ABI3730XL DNA測序儀進行雙向測序。同時將DNA濃度 ≥25 ng/μL的樣本送至深圳華大基因科技有限公司,通過鳥槍法構(gòu)建文庫,使用Illu mina HiSeq2500測序儀進行高通量測序。

1.2.4引物有效性測試。引物特異性測試使用NCBI/Primer-BLAST程序驗證引物DCW-F1/DCW-R1與GenBank 數(shù)據(jù)庫中非目標物種的結(jié)合情況。然后使用7個非穿山甲物種的DNA樣品進行實證試驗。最后開展混合樣品試驗,將上述7個物種的DNA樣本按濃度均勻混合,再分別與3種不同類型(肌肉、糞便和鱗片)的穿山甲物種DNA抽提液混合,濃度比為1∶1,分別進行PCR擴增及測序。

引物靈敏度測試在肌肉、毛發(fā)、組織、鱗片粉及糞便樣品中各取2個樣品,將DNA抽提液用滅菌去離子水從10 ng/μL依次稀釋至1.0、0.1 ng/μL和10、1 pg/μL,使用“1.2.3”中的方法進行PCR擴增及電泳檢測。上述引物的有效性測試中單次的PCR中均包含陽性對照(已知馬來穿山甲DNA)和陰性對照(滅菌去離子水)。

1.3 數(shù)據(jù)分析利用MegAlign將獲得的二代測序結(jié)果轉(zhuǎn)成Fasta格式,參考NCBI上的同源序列使用MEGA5.2[28]手工校對；利用SeqMan軟件拼接一代測序獲得的Cytb基因序列,并結(jié)合測序峰圖手工校對。利用DNASP V.6.0.70計算該研究所得序列的單倍型。使用MEGA5.2軟件中的clustalW對序列排序并校正,計算基于Kimura-2-Parameter雙參數(shù)(K2P)模型[29]的各穿山甲的種內(nèi)和種間遺傳距離,用boot-strap test 作1 000次置信度分析。使用GenBank數(shù)據(jù)庫中的BLAST工具,對所有序列進行比對,并進行同源性分析比對,以確定種屬。通過PhyloSuite V.1.2.2[30]基于最大似然法(mL)和貝葉斯法(BI)重建系統(tǒng)發(fā)育樹。利用ModelFinder(選取BIC標準,模型分別選擇IQ-TREE和Mrbayes)得到最佳分區(qū)方案和核苷酸替換模型。應用IQ-TREE和Mrbayes分別重建 mL和BI系統(tǒng)發(fā)育樹(兔形目的穴兔同源序列為外群)。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物有效性設(shè)計得到的引物 DCW-F1：5′- CCTATTCGCATACGCAATC-3′；DCW-R1：5′- AAGGATAGAGGCTACTTGTC-3′。該引物經(jīng)NCBI/Primer-BLAST程序檢索,與中華穿山甲同源序列的結(jié)合率為90.91% ～100%,其余7種穿山甲同源序列的結(jié)合率 ≥95%。實證試驗表明，該引物未擴增出任何非目標物種條帶。所有混合樣品的擴增子測序圖譜均為單一的可識別峰圖,所得序列與混合前試驗所得序列一致。1份疑似穿山甲鱗片粉末經(jīng)引物mcb398/mcb869擴增,測序圖譜為難以識別的混合峰圖；而經(jīng)引物DCW-F1/DCW-R1擴增,得到單一、可識別測序峰圖。這些結(jié)果都說明該引物具有較高的特異性。靈敏度測試電泳結(jié)果：肌肉樣DNA稀釋至10 pg/μL時有可見的電泳條帶；毛發(fā)和鱗片樣DNA可稀釋至0.1 ng/μL,皮膚和糞便樣DNA可稀釋至1 ng/μL(圖1)。這表明該PCR系統(tǒng)的靈敏度足以檢測這5種不同類型的樣品。

2.2 序列分析該研究自測4組Cytb基因序列的單倍型數(shù)量隨著序列長度變短而減少。具體是：106條MJ-L(1 140 bp)中存在70個單倍型,160條MJ-M(762 bp)中存在69個單倍型,160條MJ-S(421 bp)中存在28個單倍型,60條MJ-DCW(211 bp)中存在19個單倍型。

4組序列中所有已知穿山甲樣本序列與馬來穿山甲同源序列的相似度均大于99%。除MJ-M中樣品PA-M-1、MJ-DCW中樣品MP-DCW-1與中華穿山甲同源序列的相似度略小于95%(94.88%、93.27%)；MJ-DCW中部分樣本與樹穿山甲同源序列的相似度略大于95%(95.73%),其余樣品與對應的穿山甲同源序列的相似度均大于98%(表2)。其中，前3組序列(1 140、762、421 bp)與已知4種穿山甲同源序列的相似度值變化很小,但最短的MJ-DCW中除馬來穿山甲外,其余3種穿山甲同源序列的相似度有變小的趨勢。

MJ-L、MJ-M、MJ-DCW中種內(nèi)遺傳距離最大值和最小值分別來自樹穿山甲(0.113 6、0.117 4、0.149 4)和馬來穿山甲(0、0、0.004 8)； MJ-S中種內(nèi)遺傳距離最大值和最小值分別來自樹穿山甲(0.123 9)和中華穿山甲、馬來穿山甲(0)(表3)。南非穿山甲和大穿山甲的前3組序列中,種間遺傳距離最小值是種內(nèi)遺傳距離最大值的10倍以上；印度穿山甲和長尾穿山甲的前3組序列中,該值為5～10倍；馬來穿山甲的MJ-DCW和樹穿山甲的MJ-S、MJ-DCW中種間遺傳距離最小值小于種內(nèi)遺傳距離最大值；其余種穿山甲的種間遺傳距離最小值是種內(nèi)遺傳距離最大值的1～5倍(圖2)。其中馬來穿山甲、大穿山甲和樹穿山甲的前3組序列中種內(nèi)遺傳距離無明顯變化,MJ-DCW中明顯變大,其余種穿山甲的4組序列變化很小；印度穿山甲/大穿山甲、印度穿山甲/長尾穿山甲、中華穿山甲/馬來穿山甲、中華穿山甲/長尾穿山甲、馬來穿山甲/長尾穿山甲、馬來穿山甲/大穿山甲前3組序列的種間遺傳距離變化很小,MJ-DCW中明顯變??；南非穿山甲和長尾穿山甲中,MJ-S顯著大于MJ-L、MJ-M；其余種穿山甲4組序列的種間遺傳距離變化很小。

注：A1、A2為毛發(fā)樣；B1、B2為肌肉樣；C1、C2為皮膚樣；D1、D2為鱗片樣；E1、E2為糞便樣。DNA稀釋濃度為10 ng/μL至1 pg/μL；M.DL1200 Maker(1 200、900、700、500、300、100 bp)。Note:A1 and A2 are hair samples, B1 and B2 are muscle samples, C1 and C2 are skin samples, D1 and D2 are scale samples, and E1 and E2 are faecal samples.The diluted concentration of DNA is from 10 ng/μL to 1 pg/μL.M is the DL 1 200 marker (1 200，900，700，500，300，100 bp).圖1 靈敏度測試的瓊脂糖凝膠電泳Fig.1 Agarose gel electrophoresis of sensitivity test

表2 BLAST比對結(jié)果Table 2 BLAST results

4組序列的ML和BI系統(tǒng)發(fā)育樹均顯示出了支持良好的拓撲結(jié)構(gòu)(圖3)。穿山甲物種的分化節(jié)點具有較高的置信度(60% ～100%)(圖3～4)。MJ-L、MJ-M、MJ-S中8種穿山甲可被分為2個大支：中華穿山甲、菲律賓穿山甲、馬來穿山甲和印度穿山甲為一支,南非穿山甲、大穿山甲、長尾穿山甲及樹穿山甲為一支。而MJ-DCW中8種穿山甲的拓撲結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,南非穿山甲和大穿山甲脫離非洲穿山甲分支并入亞洲穿山甲分支(圖4)。這表明隨著序列長度變短,8種穿山甲的分支會逐漸合并。菲律賓穿山甲和MJ個體與已知馬來穿山甲聚為一支,PA-1 和MP-DCW-1與已知中華穿山甲聚為一支,PA-3 和SG-DCW-1、2與已知大穿山甲聚為一支,PA-6、10、11和 MT-DCW-1-7、SJ -2018-72-2、SJ-2018-72-3與已知樹穿山甲聚為一支。另外，有3條序列被證明分類錯誤：原標注為中華穿山甲的JN411577應為馬來穿山甲，原標注為中華穿山甲的NC_016008應為馬來穿山甲，原標注為長尾穿山甲的NC_004027應為樹穿山甲。

表3 4組序列的種間遺傳距離和種內(nèi)遺傳距離Table 3 The intra-d and inter-d based on 4 groups of sequences

注：CR.印度穿山甲,PE.中華穿山甲,JA.馬來穿山甲,GI.大穿山甲,TE.南非穿山甲,PH.長尾穿山甲,TR.樹穿山甲。Note:CR.M.crassicaudata, PE.M.pentadactyla, JA.M.javanica, GI.S.gigantea, TE.S.tem minckii, PH.P.tetradactyla, TR.P.tricuspis.圖2 4組序列種內(nèi)遺傳距離和種間遺傳距離差異分布Fig.2 Distributions of the intra-d and inter-d on 4 groups sequences

3 討論

3.1 引物有效性穿山甲物種鑒定中利用脊椎動物或哺乳動物通用引物包括F-/R-primer[15]、GVL14724/H15149[17-18]、L14724/H15149[20]、mcb398/mcb869[21]、 L15601/H15748[31],它們具有可識別物種范圍廣、適用性好的特點 。但上述通用引物難以鑒別混有其他非穿山甲物種的疑似檢材，部分引物因擴增片段較長，對檢材的質(zhì)量要求偏高。該研究所設(shè)計的穿山甲科特異引物DCW-F1/DCW-R1,通過實證試驗、混合試驗和盲測試驗均得到與目標片段一致的DNA序列,未產(chǎn)生非目標物種條帶。這表明該引物能有效、特異性識別穿山甲科物種。同時,穿山甲的非法貿(mào)易經(jīng)常涉及肌肉、皮膚、鱗片樣本,野外調(diào)查時可以收集非損傷性樣本(如糞便和毛發(fā))。上述涉案和野外調(diào)查收集樣本可能會存在不同程度降解,導致抽提的DNA質(zhì)量不佳[32]。新設(shè)計引物的擴增產(chǎn)物長度僅為211 bp,靈敏度試驗結(jié)果也證明其良好的適用性,可以滿足不同來源的5種類型樣本。

3.2 序列分析與判別標準Cytb基因是研究種間和種內(nèi)遺傳分化程度的良好指標,常用于物種鑒定[33]。Cytb基因序列長度變化可能影響鑒定結(jié)果的判讀[19],因此通常使用2種以上的序列分析方法(如BLAST比對法、遺傳距離法、系統(tǒng)發(fā)育樹法)開展物種鑒定[34]。通常,BLAST比對法中當待測樣本與已知單一物種同源序列相似度高于95%時可以判定為同一物種[35]。該研究只有2份樣本與已知中華穿山甲同源序列的相似度低于該鑒定標準,這可能與已知中華穿山甲Cytb基因序列單倍型數(shù)量偏低有關(guān)。其實脊椎動物物種鑒定中上述判別標準并不是唯一的[36]。鑒于多數(shù)樣本與相應穿山甲物種同源序列相似度均高于98%,建議使用相似度98%作為穿山甲物種判別標準。

穿山甲科物種中除馬來穿山甲的MJ-DCW和樹穿山甲的MJ-S、MJ-DCW外，剩余的種間最小遺傳距離均大于種內(nèi)最大遺傳距離,符合遺傳距離法物種鑒定判別標準[37]。其中,不同種穿山甲、同種穿山甲的不同組序列間的樣本量差異較大,且隨著序列長度變短,序列相似性變大,單倍型數(shù)量逐漸減少,物種間樣本量的不平衡會導致遺傳距離法結(jié)果不穩(wěn)定[38],使得穿山甲種內(nèi)遺傳距離和種間遺傳距離數(shù)值差異較大。此外,樹穿山甲的種內(nèi)遺傳距離均遠大于其他種穿山甲,高于0.05,且在MJ-S、MJ-DCW中種間最小遺傳距離大于種內(nèi)最大遺傳距離,這表明在樹穿山甲中極有可能存在亞種[39-41]或隱蔽物種[18]。

系統(tǒng)發(fā)育樹(BI樹和ML樹)法鑒別物種的判別標準：同一物種的不同個體聚為單系分支[42]。該研究中4組序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹,待測樣品均與已知物種的同源序列分別聚為單系(除馬來穿山甲)。過去菲律賓穿山甲常被認為是馬來穿山甲的亞種,分布區(qū)重疊因海平面上升導致其被地理隔離[3],馬來穿山甲種群具有較高的遺傳多樣性。且該研究中菲律賓穿山甲的樣本量較少,需要進一步增加其Cytb基因單倍型,以確定它們之間的關(guān)系[26]。序列長度發(fā)生改變時系統(tǒng)發(fā)育樹部分分支的置信度值，甚至整個拓撲結(jié)構(gòu)都會產(chǎn)生一定差異[43]。前3組序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹將亞洲穿山甲和非洲穿山甲分為獨立分支,這與線粒體基因組構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹[11]結(jié)構(gòu)相同；而MJ-DCW構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹則與之不同；且4組序列隨著序列長度變小,其各物種分支的置信度有變小的趨勢。 因此,利用系統(tǒng)發(fā)育樹法鑒別物種時要考慮序列長度對結(jié)果判讀的影響。

注：節(jié)點后驗概率/自舉值從上至下依次為MJ-L、MJ-M、MJ-S；不包含外群。Note:The posterior probability/bootstrap value are MJ-L，MJ-M，MJ-S from top to bottom;out groups are not included in the phylogenetic tree.圖3 基于MJ-L構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree based on MJ-L

圖4 基于MJ-DCW構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(不包含外群)Fig.4 Phylogenetic tree based on MJ-DCW (exculded out groups)