SOX4基因表達(dá)特征的泛癌分析*

李子木，閆 虹，董囡囡，康媛媛

(1.中國人民解放軍北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院口腔內(nèi)科,沈陽 110013；2.中國醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院急診黏膜科，沈陽 110001)

SRY-related HMG-box(SOX)作為一類常見的轉(zhuǎn)錄因子家族，參與調(diào)控胚胎的發(fā)育和分化、神經(jīng)系統(tǒng)的形成和血管發(fā)育等過程[1-2]。SOX4是SOX家族C亞族的重要成員之一，定位于人類Y染色體6p22.3,編碼蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量為47×103[3-4]。研究表明，SOX4在多種腫瘤中存在異常表達(dá)，并與腫瘤患者的預(yù)后密切關(guān)聯(lián)[5-6]。VERVOORT等[7]研究報(bào)道，SOX4在肺癌、膀胱癌、卵巢癌、前列腺癌、直腸癌、肝癌及胰腸癌中均高表達(dá)。沉默SOX4基因可以抑制黑色素瘤和其他腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移能力[8-9]。在乳腺癌中，SOX4能夠促進(jìn)上皮間充質(zhì)化的過程[2]；但在膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中，SOX4通過激活p53-p21信號(hào)通路和下調(diào)磷酸化Akt1，發(fā)揮抑癌作用[10]。異常表達(dá)的SOX4在不同類型的惡性腫瘤中會(huì)對(duì)腫瘤生物學(xué)行為產(chǎn)生不同的影響。盡管基于細(xì)胞試驗(yàn)或動(dòng)物研究的證據(jù)支持SOX4與腫瘤之間的聯(lián)系，但目前罕見關(guān)于SOX4泛癌研究的報(bào)道。因此，本研究通過分析癌癥基因組圖譜(TCGA)和基因表達(dá)綜合數(shù)據(jù)庫(GEO)，揭示SOX4基因在各種腫瘤中的表達(dá)情況，與疾病的預(yù)后作相關(guān)性分析，并在3種常見腫瘤細(xì)胞中進(jìn)行驗(yàn)證，進(jìn)一步闡明SOX4基因的突變情況及與免疫浸潤的關(guān)系。本研究有助于深入了解SOX4異常表達(dá)的病因及其調(diào)控機(jī)制，為SOX4的靶向治療提供依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

TCGA(http://can-cergenome.nil.gov)數(shù)據(jù)庫收集了腫瘤患者臨床的基本信息，包括基本資料、臨床分期、病理分期和生存情況等。下載腫瘤mRNA-seq數(shù)據(jù)及臨床相關(guān)數(shù)據(jù)。乳腺癌細(xì)胞(MCF-7)、乳腺上皮細(xì)胞(MCF-10A)、口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞(SCC-4)、人類永生化表皮細(xì)胞(HaCat)、人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞(A549)、人正常肺上皮細(xì)胞(BEAS-2B)均購于中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清購于美國Gibco公司，1640培養(yǎng)基購于美國Corning公司。Trizol購于美國Gibco公司,逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和定量聚合酶鏈反應(yīng)(qPCR)試劑盒均購于日本TaKaRa公司,引物由上海吉瑪生物有限公司設(shè)計(jì)并合成，BCA試劑盒購于上海碧云天生物科技有限公司,SOX4單克隆抗體、單克隆抗體均購于英國Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1基因表達(dá)

利用TIMER2(http://timer.cistrome.org)工具，采用Exploration部分的Gene_DE模塊，挖掘TCGA數(shù)據(jù)庫中SOX4在腫瘤組織中的表達(dá)情況。利用GEPIA2中“Expression DIY”部分的“Stage Plot”模塊進(jìn)一步探索SOX4的表達(dá)與腫瘤臨床病理分期之間的相關(guān)性，SOX4的表達(dá)水平采用Log2(TPM+1)量表表示；利用UALCAN(http://ualcan.path.uab.edu/index.html)網(wǎng)站中“CPTAC analysis”模塊，挖掘TCGA數(shù)據(jù)庫中SOX4蛋白表達(dá)的水平。

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng)

MCF-7、MCF-10A、SCC-4、HaCat接種于6孔板，在含有10%胎牛血清、1%青鏈霉素的DMEM混合培養(yǎng)基中，置于5%CO2、37 ℃的加濕細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。A549、BEAS-2B接種于6孔板中，在含有10%胎牛血清、1%青鏈霉素的1640混合培養(yǎng)基中，置于5%CO2、37 ℃的加濕細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。培養(yǎng)基每3天換液1次。

1.2.3定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-qPCR)

收集6種細(xì)胞，利用Trizol試劑提取細(xì)胞RNA，通過逆轉(zhuǎn)錄，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)為對(duì)照，進(jìn)行qPCR擴(kuò)增。逆轉(zhuǎn)錄體系如下：5×PrimeScript RT Master Mix(Perfect Real Time)4 μL，RNA 1 μg,RNase Free dH2O添加至20 μL。逆轉(zhuǎn)錄條件：37 ℃，15 min；85 ℃，5 s，4 ℃進(jìn)行保存。PCR體系如下：SYBR Premix Ex TaqⅡ(Tli RNaseH Plus，2×)10 μL，上游引物0.4 μL，下游引物0.4 μL，ROX染料 0.2 μL，cDNA溶液 2 μL，RNase Free dH2O添加至20 μL。SOX4：上游引物CACTCCTCCTCTTCCTCCTC，下游引物GCCGACGAC GAACTGAAG。GAPDH：上游引物GAAGGTGAAGGTCGGAGTC，下游引物GAAGATGGTGATGGGATTTC。PCR條件如下：95 ℃，5 s；60 ℃，34 s，共40個(gè)循環(huán)，60 ℃，1 min；95 ℃，0.15 s。以2-ΔΔCT表示相對(duì)定量結(jié)果，應(yīng)用Graphpad prism 5軟件對(duì)RT-qPCR結(jié)果進(jìn)行分析。

1.2.4蛋白質(zhì)印跡法(Western blotting)

收集6種細(xì)胞，利用BCA試劑盒提取細(xì)胞蛋白。經(jīng)10%十二烷基硫酸鈉(SDS)、5%聚丙烯酰胺(PAGE)凝膠電泳后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。5%脫脂奶粉封閉1 h后，加入鼠抗人SOX4單克隆抗體4 ℃過夜。加入二抗兔抗鼠免疫球蛋白G(IgG)37 ℃下孵育1 h，堿性磷酸酶顯色，增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光(ECL)，掃描并拍照。采用凝膠成像分析軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行半定量分析。

1.2.5生存分析

利用GEPIA2網(wǎng)站“Survival Analysis”模塊獲取TCGA數(shù)據(jù)庫中不同SOX4對(duì)腫瘤患者總生存期(OS)和無病生存期(DFS)的影響，結(jié)果以單基因生存分析圖表示(Kaplan-Meier曲線)。設(shè)定“臨界值-高(50%)”“臨界值-低(50%)”作為拆分高表達(dá)組和低表達(dá)組的表達(dá)閾值，探索SOX4與腫瘤患者生存因素之間的表達(dá)模式。

1.2.6基因突變分析

通過cBioPortal網(wǎng)站(https://www.cbioportal.org)“Query”部分選擇TCGA泛癌圖譜分析，挖掘SOX4在TCGA數(shù)據(jù)庫中的變異情況，包括突變頻率、突變類型和拷貝數(shù)變化。點(diǎn)擊“Mutation”模塊，顯示SOX4基因突變位點(diǎn)信息。

1.2.7免疫浸潤分析

利用TIMER2工具“Immune”模塊挖掘TCGA數(shù)據(jù)庫腫瘤中SOX4的表達(dá)與免疫浸潤之間的相關(guān)性。選擇Treg、單核細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞(CAF)為研究對(duì)象，應(yīng)用QUANTISEQ、CIBERSORT、MCPCOUNTER、XCELL等不同算法進(jìn)行免疫浸潤評(píng)估。

1.2.8富集分析

一種價(jià)值觀要真正發(fā)揮作用，必須融入社會(huì)生活，與社會(huì)生活緊密聯(lián)系起來，讓人們在實(shí)踐中感知它、領(lǐng)悟它，增強(qiáng)認(rèn)同感和歸屬感。志愿服務(wù)活動(dòng)，是人人可為、人人能為的重要載體，有利于增強(qiáng)社會(huì)主義核心價(jià)值觀的吸引力、感染力，提高人們對(duì)主流價(jià)值觀的認(rèn)同感。

利用STRING(https://string-db.org)數(shù)據(jù)庫篩選出50個(gè)有實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證、與SOX4相結(jié)合的蛋白。本研究中輸入“SOX4”，物種選擇“人類”，證據(jù)類型選擇“experiments”，置信度選擇“l(fā)ow confidence(0.150)”，最大數(shù)相互作用選擇“50”。利用GEPIA2數(shù)據(jù)庫“Expression Analysis”部分的“Similar Genes Detection”模塊篩選前100個(gè)與SOX4相關(guān)靶向基因，利用Jvenn(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn)網(wǎng)站對(duì)50個(gè)SOX4結(jié)合蛋白、前100個(gè)與SOX4相關(guān)靶向基因進(jìn)行交叉分析。此外，DAVID網(wǎng)站(https://david.ncifcrf.gov)和“ggplot2”(https://cran.r-project.org/web/packages/ggplot2/index.html)R軟件包用于KEGG通路分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用R4.0.3統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。采用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)進(jìn)行兩組間比較，兩組以上比較使用Kruskal-Wallis秩和檢驗(yàn)。采用Kaplan-Meier法進(jìn)行生存分析。采用Pearson相關(guān)性分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 基因和蛋白表達(dá)情況

與正常組織比較，SOX4在膀胱尿路上皮癌(BLCA)、乳腺浸潤癌(BRCA)、膽管癌(CHOL)、結(jié)腸癌(COAD)、食管癌(ESCA)、多形性膠質(zhì)細(xì)胞瘤(GBM)、頭頸鱗狀細(xì)胞癌(HNSC)、腎乳頭狀細(xì)胞癌(KIRP)、肝細(xì)胞肝癌(LIHC)、肺腺癌(LUAD)、肺鱗癌(LUSC)、嗜鉻細(xì)胞瘤和副神經(jīng)節(jié)瘤(PCPG)、前列腺癌(PRAD)、直腸腺癌(READ)、胃癌(STAD)、甲狀腺癌(THCA)和子宮內(nèi)膜癌(UCEC)中的表達(dá)明顯升高，而在腎透明細(xì)胞癌(KIRC)、腎嫌色細(xì)胞癌(KICH)組織中的表達(dá)明顯降低，見圖1。CPTAC數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果顯示，SOX4蛋白在乳腺癌、UCEC和LUAD中的表達(dá)水平明顯升高，見圖2。利用GEPIA2數(shù)據(jù)庫，分析不同腫瘤組織中SOX4蛋白表達(dá)水平與腫瘤患者臨床病理分期之間的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)SOX4蛋白表達(dá)與ESCA、LIHC、胰腺癌(PAAD)、皮膚黑色素瘤(SKCM)和THCA的病理分期密切相關(guān)，見圖3。RT-qPCR和Western blotting結(jié)果見圖4，3種腫瘤細(xì)胞中SOX4 mRNA和SOX4蛋白表達(dá)水平均上調(diào)(P<0.05)，這與網(wǎng)站中獲得的結(jié)論一致。

**:P<0.01；***:P<0.001,與正常組織比較。

***:P<0.001,與正常組織比較。

圖3 SOX4的表達(dá)與不同腫瘤臨床分期之間的關(guān)系

A：RT-qPCR結(jié)果；B：Western blotting結(jié)果；**：P<0.01。

2.2 生存分析

SOX4高表達(dá)與LIHC患者OS預(yù)后不良明顯相關(guān)(P=0.007 3),而SOX4低表達(dá)與KIRC、腦低級(jí)別膠質(zhì)瘤(LGG)、胸腺癌(THYM)患者OS預(yù)后不良明顯相關(guān)(P<0.05)，見圖5A。DFS數(shù)據(jù)分析結(jié)果顯示，SOX4高表達(dá)與ESCA、PAAD患者不良預(yù)后相關(guān)(P<0.05),而SOX4低表達(dá)與UCEC患者不良預(yù)后相關(guān)(P<0.05)，見圖5B。

A：不同腫瘤的OS；B：不同腫瘤的DFS。

2.3 基因突變分析

以SOX4擴(kuò)增為主要變異類型的BLCA患者SOX4基因突變頻率最高(>15%)。在所有的卵巢漿液性囊腺癌、彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤(DLBC)、葡萄膜黑色素瘤、CHOL和LIHC患者中，絕大多數(shù)均為SOX4拷貝數(shù)擴(kuò)增，見圖6。圖7進(jìn)一步顯示，SOX4遺傳變異的類型、位點(diǎn)和病例數(shù)。SOX4錯(cuò)義突變是主要的遺傳變異類型，在1例SKCM和1例COAD患者中檢測到E111K/Q的改變。

圖6 SOX4在腫瘤中的變異類型

圖7 SOX4變異突變位點(diǎn)的變化頻率

2.4 免疫浸潤分析

研究TCGA數(shù)據(jù)庫中腫瘤免疫細(xì)胞的浸潤水平與SOX4基因表達(dá)之間的關(guān)聯(lián)，發(fā)現(xiàn)在HNSC、HNSC-HPV-和THCA中，Treg細(xì)胞的免疫浸潤與SOX4表達(dá)之間呈正相關(guān)。SOX4的表達(dá)與SARC中單核細(xì)胞的浸潤呈負(fù)相關(guān)。在CESC、COAD、HNSC、HNSC-HPV-、KIRC、LUSC和SKCM中，SOX4與內(nèi)皮細(xì)胞的浸潤呈正相關(guān)。同樣，在CESC、COAD、ESCA、HNSC、HNSC-HPV-、KIRC、LUSC、READ和STAD中，SOX4表達(dá)與CAF之間呈正相關(guān)，但與TGCA中CAF的浸潤呈負(fù)相關(guān)。見圖8。

圖8 SOX4表達(dá)與免疫細(xì)胞浸潤的相關(guān)性

2.5 富集分析

圖9 交叉分析結(jié)果

圖10 SOX4相關(guān)基因KEGG通路分析

3 討 論

SOX家族是一個(gè)龐大且功能廣泛的轉(zhuǎn)錄因子家族，包含至少20個(gè)成員，該家族成員的產(chǎn)物都具有一個(gè)HMG基序保守區(qū)[11-12]。SOX4是SOX家族的重要成員之一，現(xiàn)有研究證明SOX4基因可調(diào)節(jié)細(xì)胞信號(hào)通路，影響細(xì)胞增殖、分化和凋亡等過程，并通過轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)促進(jìn)或抑制腫瘤的生長[13]。通過文獻(xiàn)檢索，作者發(fā)現(xiàn)罕有研究從整體腫瘤角度對(duì)SOX4進(jìn)行泛癌分析。因此，本研究基于公共數(shù)據(jù)庫，從基因表達(dá)、變異和功能機(jī)制等方面對(duì)不同腫瘤中的SOX4進(jìn)行了全面挖掘和分析。

本研究首先探討了TCGA數(shù)據(jù)庫中SOX4基因的表達(dá)情況和對(duì)患者預(yù)后的影響。在LGG和THYM患者中，SOX4呈高表達(dá)，但生存分析結(jié)果顯示，SOX4高表達(dá)的患者預(yù)后良好。分析兩者結(jié)果不一致的原因可能有：(1)SOX4高表達(dá)或低表達(dá)組的患者數(shù)量較少，可能需要更大的樣本量來驗(yàn)證上述結(jié)論；(2)需要更深入的分子實(shí)驗(yàn)證據(jù)來確定SOX4的高表達(dá)在上述腫瘤的發(fā)生中起重要作用，否則其可能僅僅是正常組織中抵抗腫瘤變化的結(jié)果。此外，為進(jìn)一步驗(yàn)證SOX4在腫瘤中的致病作用，作者收集了SCC-4、MCF-7及A549，與對(duì)照細(xì)胞進(jìn)行比較。在體外分別從mRNA和蛋白水平檢測了SOX4的變化，發(fā)現(xiàn)mRNA和蛋白表達(dá)水平均明顯升高，這與數(shù)據(jù)庫的結(jié)果相一致。

由于SOX4在多種腫瘤中的表達(dá)存在明顯異常，本研究深入探討了其變異特征，發(fā)現(xiàn)擴(kuò)增是最常見的變異類型。通過軟件篩選前50個(gè)有實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的相關(guān)蛋白，發(fā)現(xiàn)Mex3A、HDAC2、ZNF669、ILF2、KHDRBS1和ZNF260與SOX4相關(guān)。盡管上述蛋白在腫瘤致病中的不同作用已被報(bào)道，但其對(duì)腫瘤的確切致病機(jī)制尚不清楚，這也是未來研究的重點(diǎn)。

腫瘤浸潤性免疫細(xì)胞是復(fù)雜腫瘤微環(huán)境的重要組成部分。依據(jù)細(xì)胞類型，其可能調(diào)節(jié)腫瘤的致病過程[14]。Treg是維持機(jī)體免疫耐受的重要因素之一。早期的研究顯示，在各種共刺激和共抑制受體的作用下，Treg在免疫穩(wěn)態(tài)、自身免疫和抗腫瘤免疫中發(fā)揮重要作用[15]。不同的單核細(xì)胞在分泌抑瘤介質(zhì)、促進(jìn)血管生成、重塑細(xì)胞外基質(zhì)、募集淋巴細(xì)胞及分化為腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞等方面實(shí)現(xiàn)了促瘤和抗瘤免疫功能[16]。CAF可通過多種機(jī)制促進(jìn)腫瘤進(jìn)展，包括可溶性因子和細(xì)胞外基質(zhì)的分泌，血管生成、免疫和代謝的調(diào)節(jié)[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，在某些特定腫瘤中，SOX4表達(dá)與Treg、單核細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和CAF之間存在緊密關(guān)聯(lián)。此外，作者對(duì)所有的SOX4靶向結(jié)合蛋白和SOX4蛋白表達(dá)相關(guān)基因進(jìn)行了富集分析，發(fā)現(xiàn)SOX4與“病毒致癌”密切相關(guān)。SOX4可通過一系列正反饋機(jī)制促進(jìn)病毒的復(fù)制，從而影響腫瘤的進(jìn)程[18]。研究表明，SOX4與“腫瘤MicroRNA”也存在相關(guān)性，例如miRNA-214-5p通過靶向SOX4抑制PRAD細(xì)胞的增殖[19]，miRNA-212通過靶向SOX4在大腸癌中發(fā)揮抑癌作用[20]，miRNA-34a-5p通過靶向SOX4調(diào)節(jié)Wnt/β-連環(huán)蛋白信號(hào)通路進(jìn)而調(diào)節(jié)神經(jīng)母細(xì)胞瘤的進(jìn)展[21]。

綜上所述，SOX4的泛癌分析表明，多個(gè)腫瘤中的SOX4存在表達(dá)異常，SOX4與患者的臨床預(yù)后、基因突變、免疫細(xì)胞浸潤等均有相關(guān)性。本研究結(jié)果為了解SOX4的功能提供了初步依據(jù)，但其具體的生物學(xué)作用和機(jī)制還需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。