液體活檢在肺癌診療中的研究進展*

李如清，王 平 綜述，傅雨綺，黃新恩 審校

(南京醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院/江蘇省腫瘤醫(yī)院/江蘇省腫瘤防治研究所，南京 210009)

最新數(shù)據(jù)表明，肺癌全球發(fā)病率為11.4%，致死率為18.0%，已成為惡性腫瘤致死的首要原因[1]。目前，早期發(fā)現(xiàn)和診斷肺癌主要依靠傳統(tǒng)腫瘤標志物、低劑量計算機斷層掃描(CT)掃描和組織活檢。然而，傳統(tǒng)腫瘤標志物、影像學在診斷準確性和敏感性方面欠佳[2]。而組織活檢雖然是肺癌診斷的“金標準”，但是仍具有缺點，如活檢取樣的可及性、活檢組織不足、存在活檢并發(fā)癥、腫瘤異質(zhì)性導致的生物標志物檢測結(jié)果不可靠等[3]。因此，需要尋找一種可靠的方法來輔助篩查和診斷早期肺癌。近年來，液體活檢逐漸興起。本文綜述了液體活檢主要檢測對象，及其在肺癌篩查和早期診斷、預測治療敏感性和耐藥性、評價治療效果、預測預后和在腫瘤殘余病灶中的潛在臨床應用價值，以及臨床常規(guī)實施前仍需克服的障礙。

1 液體活檢

液體活檢是指通過分子生物學的方法，對外周血或其他體液中的多種癌癥來源成分進行檢測分析，從而獲取腫瘤相關(guān)信息。液體活檢的檢測對象主要是循環(huán)腫瘤細胞(CTCs)、循環(huán)腫瘤DNA(ctDNA)、循環(huán)游離DNA(cfDNA)、長鏈非編碼RNA(lncRNA)、外泌體等。液體活檢的主要缺點是樣本中生物標志物數(shù)量少[4]。因此，需要高敏感度的檢測技術(shù)。當前，液體活檢的檢測技術(shù)主要為聚合酶鏈反應(PCR)、數(shù)字PCR(dPCR)和子代測序(NGS)。PCR針對一個預定義基因中的1～3個位點，無法跨多個基因進行復合，也無法檢測更復雜的基因組改變，如融合基因。dPCR是一種可以在單分子水平上識別和量化不同突變的新方法，已經(jīng)開發(fā)了不同的平臺類型，包括固體、珠狀、乳化、擴增和磁性PCR等。而NGS是一種高通量測序方法，可以同時檢測基因組的可變區(qū)域和體細胞突變，包括單核苷酸變異、拷貝數(shù)變異、基因融合等[4-5]。隨著檢測技術(shù)的逐漸成熟，液體活檢正在被用于肺癌的各個階段，包括篩查及早期診斷腫瘤、預測治療敏感度和耐藥性、評價治療效果、預測預后、監(jiān)測殘余病灶等[6]。

2 液體活檢主要檢測對象

2.1 CTCs

CTCs是指原發(fā)灶或轉(zhuǎn)移灶脫落進入外周血的腫瘤細胞，這些腫瘤細胞可能經(jīng)歷了上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，有更強的侵襲性，易發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移。CTCs富集和分析方法基于其物理和生物學特性，如大小、密度、極性、電荷、上皮細胞黏附分子和細胞角蛋白的表達、白細胞特異標志物CD45的表達等[7]。目前富集和分析CTCs的方法包括CellSearch、基于形態(tài)學富集的膜過濾技術(shù)(ISET)和上皮細胞免疫斑點技術(shù)(EPISPOT)等[8]。國家藥品監(jiān)督管理局已審批通過首個專門針對非小細胞肺癌(NSCLC)CTCs檢測的試劑盒：葉酸陽性富集試劑盒。有學者認為，CTCs的表型特征可用于基因表達譜的分析，例如研究腫瘤異質(zhì)性或識別特定的靶基因改變，以及評估治療相關(guān)標志物(免疫治療的程序性細胞死亡配體1)[9]。CTCs檢測在肺癌患者的診治及預后等方面發(fā)揮著重要作用，進一步研究其特征和性質(zhì)具有重要價值。

2.2 ctDNA

ctDNA是指人體血液循環(huán)系統(tǒng)中具有腫瘤相關(guān)特征(包括單核苷酸突變、拷貝數(shù)異常和甲基化等)、來自腫瘤基因組的DNA片段。目前，dPCR技術(shù)及突變阻滯擴增系統(tǒng)PCR(ARMS-PCR)技術(shù)可用于檢測已知突變的ctDNA，而標記擴增深度測序(TAm-Seq)技術(shù)和癌癥個體化深度測序分析(CAPPSeq)技術(shù)可用于檢測突變位點未知的ctDNA[10]。盡管可以通過多種不同的液體活檢對象獲得癌癥相關(guān)基因信息，但ctDNA是目前唯一被正式批準用于NSCLC患者臨床的樣本來源，用于EGFR突變檢測[4，11]。ctDNA有望在眾多臨床應用中發(fā)揮作用，包括早期癌癥篩查、對癌癥進行基因分型、檢測微小殘留病灶、監(jiān)測治療反應和分析耐藥性等[12]。ctDNA作為一種高效益、高敏感度的工具，具有潛在臨床應用價值。

2.3 外泌體

外泌體是一種直徑為50～150 nm的膜結(jié)合顆粒，可以從血漿、尿液、支氣管肺泡灌洗液、腹腔積液等多種體液中檢測到。外泌體表面表達多種蛋白質(zhì)，并包含核酸和脂質(zhì)在內(nèi)的多種生物活性物質(zhì)。這些物質(zhì)參與了外泌體的抗原提呈、膜轉(zhuǎn)運和融合等過程。外泌體具有良好的穩(wěn)定性、生物相容性、生物屏障通透性、長血循環(huán)能力、低毒性、低免疫原性等優(yōu)點，可以促進細胞增殖和轉(zhuǎn)移，影響血管生成，在肺癌發(fā)生過程中調(diào)節(jié)抗腫瘤免疫反應，調(diào)節(jié)肺癌治療中的耐藥性，被認為是肺癌液體活檢的重要組成部分。此外，通過工程化外泌體輸送治療藥物是肺癌精確和個性化治療的一種新方法[13-14]。

2.4 lncRNA

lncRNA是長度>200個核苷酸且不具有蛋白質(zhì)編碼功能的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。根據(jù)lncRNA編碼序列與蛋白質(zhì)編碼基因的相對位置，可分為以下5類：正義lncRNA、反義lncRNA、雙向lncRNA、內(nèi)含子lncRNA、基因間lncRNA。lncRNA具有以下特點：(1)具有信使RNA相似結(jié)構(gòu)，經(jīng)過剪切也具有啟動子和多聚腺苷酸尾的結(jié)構(gòu)；(2)具有較強的組織和細胞特異性，較低的序列保守性；(3)組織分化過程中具有明顯的時空表達特性；(4)在腫瘤與其他疾病中有特征性表達方式[15]。lncRNA可以在轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后和翻譯水平起作用，可能參與多種生物學過程，例如DNA損傷修復、細胞存活、細胞信號轉(zhuǎn)導、細胞生長和分化等[16]。由于lncRNA的這些特性，其被認為與癌癥的關(guān)系緊密。

3 液體活檢在肺癌診療中的臨床應用

3.1 早期篩查和診斷

JIANG等[16]分析了61例肺癌組患者和57例健康對照組全血中l(wèi)ncRNA XLOC-009167的相對表達水平，發(fā)現(xiàn)肺癌組lncRNA XLOC-009167表達高于健康對照組(P<0.000 1)；與健康對照組比較，肺癌組lncRNA XLOC-009167的曲線下面積(AUC)為0.739 8(敏感度為78.7%，特異度為61.8%)，傳統(tǒng)生物標志物細胞角蛋白19片段抗原(CYFR21-1)、癌胚抗原72-4(CA72-4)和特異性神經(jīng)元烯醇酶(NSE)的AUC分別為0.518 7(敏感度為32.0%，特異度為86.6%)、0.505 6(敏感度為76.0%，特異度為40.0%)、0.570 7(敏感度為66.0%，特異度為56.6%)。結(jié)合3種傳統(tǒng)腫瘤標志物采用logistic回歸模型建立的聯(lián)合診斷模型，AUC為0.551 9(敏感度為44.4%，特異度為55.3%)，說明lncRNA XLOC-009167的診斷性能明顯優(yōu)于聯(lián)合診斷模型和單個傳統(tǒng)生物標志物。研究人員還發(fā)現(xiàn)，lncRNA XLOC-009167的相對表達量在不同培養(yǎng)時間軸、不同溫度下比較均無差異，具有較強的穩(wěn)定性。因此，lncRNA XLOC-009167可能成為一種新的肺癌診斷標志物。MARQUETTE等[17]利用ISET檢測614例慢性阻塞性肺氣腫患者血液標本中的CTCs，發(fā)現(xiàn)CTCs檢測對肺癌的敏感度為26.3%，其中19例參與者在T0時被診斷為肺癌，表明CTCs檢測可以先于影像學發(fā)現(xiàn)早期肺癌的存在。PENG等[18]對192例可手術(shù)的肺部占位性疾病患者行組織活檢與血漿ctDNA檢測，發(fā)現(xiàn)血漿ctDNA檢測肺癌的敏感度為69%，特異度為96%。而當ctDNA與傳統(tǒng)腫瘤標志物聯(lián)合檢測時，敏感度和特異度分別提高到80%和99%，其中64%的癌癥患者處于Ⅰ期，敏感度為63%。這些研究證實了檢測ctDNA有助于篩查和診斷早期肺癌。外泌體的各種生物成分(如miRNA、蛋白質(zhì)等)在肺癌中存在異常表達，具有作為肺癌診斷標志物的潛力。研究人員發(fā)現(xiàn)，從NSCLC患者血漿中分離的外泌體平均蛋白水平明顯高于健康對照組[(11.1±3.8)mg/mLvs.(8.2±2.0)mg/mL，P<0.001]，NSCLC患者外泌體-T、外泌體-G的中位水平明顯高于健康對照組[(27.2±21.1)pg/mLvs.(14.9±5.4)pg/mL、(1.5±0.7)ng/mLvs.(0.9±0.3)ng/mL；P<0.01]，說明外泌體可以用于肺癌的早期診斷[19]。作者推測,液體活檢與傳統(tǒng)腫瘤標志物、影像學等檢查聯(lián)合將提高肺癌早期診斷的敏感度和特異度。

3.2 預測治療敏感度和耐藥性

有研究人員從小細胞肺癌(SCLC)患者化療前采集的7.5mL血液分離出CTCs，并對單個細胞的DNA進行NGS，生成全基因組拷貝數(shù)圖譜，對全基因組拷貝數(shù)改變(CNA)數(shù)據(jù)的生物信息學分析開發(fā)出分類器，該分類器包含2 281個聚集在16個CNA圖譜內(nèi)的位點，能正確預測約83%患者的化療敏感度臨床結(jié)果。可見，CTCs可用于治療前化療敏感度的預測[20]。當前，免疫檢查點抑制劑已成為多種癌癥的標準療法。在一項前瞻性研究中，包括NSCLC在內(nèi)的癌癥患者在抗PD-1免疫治療8周后，檢測到ctDNA與明顯縮短的中位生存期(PFS)和總生存期(OS)相關(guān)(P<0.004)，這為免疫治療開始前評估ctDNA提供了理論依據(jù)[21]。MOHRMANN等[22]發(fā)現(xiàn)，41例肺癌患者腫瘤組織中存在BRAF、KRAS、EGFR突變，通過NGS，同樣可在95%的血漿外泌體NA樣本中檢測到，且外泌體NA的NGS檢測存在任何腫瘤已有的突變。這說明可以利用外泌體NA檢測肺癌中的常見突變，為靶向治療提供指導。癌癥治療時面臨的主要挑戰(zhàn)是耐藥性。研究人員發(fā)現(xiàn)，在NSCLC患者中，攜帶T790M突變的EGFR-TKI耐藥細胞H1975可以通過釋放外泌體miRNA-522-3p，激活PI3K/AKT途徑，將耐藥特性傳遞給EGFR-TKI敏感細胞PC9，促進其對吉非替尼等的耐藥[23]。HUANG等[24]發(fā)現(xiàn)FP方案治療NSCLC患者的組織和細胞中l(wèi)ncRNA AFAP1-AS1過表達,通過競爭性抑制靶點miR-139-5P，上調(diào)miR-139-5P靶點RRM2，激活EGFR/AKT通路，以增強NSCLC細胞增殖和化療耐藥。因此，了解lncRNA、外泌體等在肺癌藥物治療過程中在產(chǎn)生耐藥方面發(fā)揮的作用，有助于輔助肺癌的治療。

3.3 評價療效

ABBOSH等[25]發(fā)現(xiàn)，在14例確診的NSCLC復發(fā)患者中，有13例(93%)在臨床復發(fā)前或臨床復發(fā)時通過ctDNA檢測到≥2個單核苷酸變異，在影像學診斷腫瘤復發(fā)前7 d檢測出NSCLC復發(fā)。最近，研究人員使用Clariom D人類芯片技術(shù)，在NSCLC患者的樣本中，發(fā)現(xiàn)3種lncRNAs(SCARNA7、MALAT1和NONHSAT017369)與EGFR突變明顯相關(guān)(陽性預測值和陰性預測值均大于80%)。32例EGFR-TKI治療后影像學評估達到部分緩解(PR)和疾病穩(wěn)定(SD)的患者中，27例顯示血漿MALAT1水平下降(P<0.05)，23例顯示SCARNA7水平降低(P<0.05),疾病進展(PD)患者中沒有觀察到類似的趨勢。研究表明，檢測EGFR-TKI治療前、后血漿中SCARNA7和MALAT1的水平變化，對EGFR-TKI的療效有較高的預測價值[26]。有研究人員收集了5例PR和4例PD患者，發(fā)現(xiàn)在晚期NSCLC中共120個外泌體miRNA與健康個體存在差異(P<0.05)，肺癌組miRNA320家族中3個miRNA(miRNA-320b、miRNA-320c、miRNA-320d)上調(diào)。此外，通過比較PR組治療前、后miRNA譜變化，找到311個差異表達miRNA(111個上調(diào)和200個下調(diào))，尤其是下調(diào)的miR-25b-5p(P<0.05)。因此，miR-320家族和miR-25b-5p可作為免疫治療療效的預測標志物[27]，提示液體活檢可以用于肺癌療效的評價。

3.4 預測預后

一項回顧性生存分析納入了347例Ⅰ～ⅢA期NSCLC患者，發(fā)現(xiàn)術(shù)前CTCs水平是NSCLC患者的獨立預后因素(HR=5.489，P<0.001)。以術(shù)前CTCs水平為基礎，基于多變量COX回歸模型的nomogram數(shù)據(jù)一致性指數(shù)為0.82，顯示CTCs在NSCLC復發(fā)轉(zhuǎn)移的預測方面具有較高價值[28]。鄭志剛等[29]發(fā)現(xiàn)，lncRNA MEG3在92例SCLC組織中的表達(2.071±0.97)明顯低于40例癌旁組織(4.082±0.860)和50例正常肺組織(4.209±0.820)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001);lncRNA MEG3低表達者較高表達者差異有統(tǒng)計學意義(中位PFS 8個月vs.21個月，中位OS 32個月vs.21個月，P<0.001)。由此，lncRNA MEG3可作為潛在的CLC預后評估標志物。MOHRMANN等[22]還發(fā)現(xiàn)，低外泌體NA突變等位基因頻率(MAF)患者有更長的中位PFS(11.8個月vs.5.9個月，P=0.006)和治療失敗時間(7.4個月vs.2.3個月，P=0.009)，與PR和SD達6個月相關(guān)(P=0.006)，這些數(shù)據(jù)說明低外泌體NA是延長生存的獨立預后因素。與癌旁組織比較，NSCLC癌組織中miR217表達降低，E2F3 mRNA表達升高(P<0.005)；miR217高表達、E2F3 mRNA低表達的患者術(shù)后5年OS均高于miR217低表達、E2F3 mRNA高表達患者(P<0.005)。E2F3 mRNA高表達(HR=1.440,95%CI=1.129～2.503)是NSCLC患者預后不良獨立危險因素，miR217高表達(HR=0.715,95%CI=0.425～0.902)是獨立保護因素(P<0.005)[30]。由此認為，臨床可以通過液體活檢來預測患者的預后。

3.5 在微小殘留病灶(MRD)中的作用

癌癥患者接受治療后，即使影像學上顯示病灶徹底清除，仍可能有極少量未被檢測到的殘存的腫瘤病灶。MRD的激活促進了腫瘤復發(fā)與轉(zhuǎn)移。目前，針對MRD的檢測主要依靠液體活檢。WALDECK等[31]利用NGS檢測術(shù)后12周采集的16份血漿樣本，發(fā)現(xiàn)4例ctDNA陽性患者均(100%)經(jīng)歷了后期疾病復發(fā)，12例陰性患者中有9例(67%)在隨訪期間無疾病復發(fā)。MRD檢測能夠?qū)SCLC復發(fā)風險進行有效分層，并對患者術(shù)后12～15個月的復發(fā)狀態(tài)進行準確預測[32]。MRD陰性與有利的PFS(HR=0.094,95%CI為0.01～0.061,P=0.013)和OS明顯相關(guān)(HR=0.03，95%CI為0.002～0.311,P=0.004)[32]。2016年SACHER等[33]發(fā)現(xiàn)導致NSCLC產(chǎn)生的兩種關(guān)鍵基因：EGFR和KRAS。通過MRD對EGFR或KRAS突變進行監(jiān)測，能夠指導EGFR靶向治療的停用藥時機，以避免新突變的產(chǎn)生，進而影響靶向治療的效果。研究人員檢測40例肺癌患者MRD，發(fā)現(xiàn)53%的患者具有與酪氨酸激酶抑制劑或免疫檢查點抑制劑良好反應相關(guān)的ctDNA突變譜[34]。同時，輔助治療期間的ctDNA監(jiān)測可能有助于臨床了解藥物反應和耐藥性機制，為疾病快速進展之前的基于基因組治療提供機會[34-35]。越來越多的證據(jù)表明，ctDNA可以作為MRD檢測的生物標志物，進行準確的風險評估和輔助治療。有研究人員利用生物傳感器將目標分析物檢測轉(zhuǎn)化為可量化的數(shù)字信號，可以檢測到肺癌MRD中較低水平的ctDNA和CTCs。MRD診斷的廣泛應用可以降低成本，擴大檢測的可用性[36]。

3.6 胸腔積液液體活檢

目前液體活檢最常用的是血清樣本，但是胸腔積液也可以作為液體活檢的樣本，它同血清樣本一樣具有獲取方便、可動態(tài)觀察等優(yōu)點。研究發(fā)現(xiàn)，胸腔積液上清液中的總cfDNA濃度中位值顯著高于血漿(278.1 ng/mLvs.20.4 ng/mL，P<0.05)，且其中檢出驅(qū)動基因突變的敏感性更高(93%vs.62%)[37]。此外，胸腔積液液體活檢能協(xié)助鑒別胸腔積液的性質(zhì)，指導肺癌患者的治療和評估預后[38]。這說明胸腔積液樣本用于液體活檢也是未來值得探索的一個方向。

4 小結(jié)與展望

綜上所述，液體活檢與傳統(tǒng)組織活檢相比，具有便捷、微創(chuàng)、可重復、可動態(tài)觀察等優(yōu)勢。雖然影像學、傳統(tǒng)腫瘤標志物、組織活檢仍是肺癌診療中的常用方法，但是液體活檢有望作為其輔助手段，在肺癌的篩查和早期診斷、指導治療、評估療效和預測預后等多領(lǐng)域產(chǎn)生臨床應用價值。在臨床工作中，醫(yī)生可以通過將液體活檢與影像學檢查、傳統(tǒng)腫瘤標志物、組織活檢等相結(jié)合，根據(jù)實時基因信息，為患者提供更精準化和個性化的醫(yī)療。

不可否認的是，液體活檢在臨床廣泛應用前仍面臨不少問題。(1)檢測技術(shù)尚不成熟。雖然通過富集、擴增等手段可提高液體活檢的敏感度，但是存在信息不完整、基因錯配等現(xiàn)象。因此，在應用液體活檢時應針對敏感度、特異度、穩(wěn)定性等進行技術(shù)改進，同時對檢測流程進行標準化，對關(guān)鍵節(jié)點進行質(zhì)量控制。(2)缺乏臨床驗證。目前，液體活檢缺乏大數(shù)據(jù)的人群調(diào)查和一致性評價研究，迫切需要更多的多中心、大型、前瞻性長期研究。(3)缺乏行業(yè)標準和市場監(jiān)管。液體活檢是一種新技術(shù)，急需制定規(guī)范的行業(yè)標準及執(zhí)行嚴格的市場監(jiān)管。(4)檢測成本較高：液體活檢成本較高，且尚未納入醫(yī)保范圍，需要政府、醫(yī)療單位、檢測公司等多方協(xié)調(diào)和投入[39]。相信隨著上述問題的解決，液體活檢在臨床工作中將會有更廣闊的應用前景。