血小板衍生細(xì)胞外囊泡在兒童IgA血管炎腎損傷患者中的表達(dá)及意義*

張 菂，劉 寧，王彩芳，陳瑞珊，海 冬，楊文浩

(開灤總醫(yī)院：1.兒科；2.腫瘤科；3.風(fēng)濕免疫科，河北 唐山 063000)

免疫球蛋白A血管炎腎損傷(IgAVN)又名紫癜性腎炎，是兒童最常見的血管炎性腎臟疾病，發(fā)病機(jī)制尚未完全明確[1]。血小板衍生細(xì)胞外囊泡(PEVs)是血小板表面以芽出形式脫落的微小顆粒。研究表明，PEVs參與細(xì)胞間通訊、誘導(dǎo)免疫刺激和免疫活化，是具有研究前景的自身免疫性疾病生物標(biāo)志物[2]。PEVs直徑為0.1～1.0 μm，表面表達(dá)CD42、CD61等標(biāo)記，也是血小板活化標(biāo)記之一[3]。國外的研究提示，兒童血管炎患者中血漿PEVs增高[4]，但在兒童IgAVN中血漿PEVs增高尚缺乏研究。本研究通過檢測IgAVN患兒血漿PEVs水平，分析PEVs與IgAVN不同臨床表型的相關(guān)性，探討PEVs在兒童IgAVN患者中的應(yīng)用價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

本研究以2017年6月至2020年6月于開灤總醫(yī)院兒科住院的免疫球蛋白A血管炎(IgAV)患兒92例(觀察組)建立回顧性研究隊列，所有患兒均滿足歐洲風(fēng)濕病聯(lián)盟/兒童風(fēng)濕病國際研究組織/兒童風(fēng)濕病聯(lián)盟2010年制定的IgAV診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]。另選取50例參加體檢、年齡性別匹配的健康兒童作為健康對照組。以住院期間是否滿足中華醫(yī)學(xué)會兒科學(xué)分會腎臟學(xué)組IgAVN診治循證指南(2016)診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]，將研究對象分為IgAVN組(42例)與無腎臟損傷的IgAV組(50例)。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合IgAV診斷標(biāo)準(zhǔn)；(2)同意參加本研究并簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)臨床資料不完整者；(2)有其他感染性疾病、營養(yǎng)不良、自免疫性疾病、免疫系統(tǒng)缺陷及先天遺傳代謝障礙性疾病者；(3)已用免疫調(diào)節(jié)劑治療者；(4)拒絕參加本研究者。本研究遵照赫爾辛基宣言，經(jīng)開灤總醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)(開醫(yī)倫2019-12)。

1.2 方法

1.2.1主要試劑及儀器

流式細(xì)胞分析儀購于美國GE公司。熒光素標(biāo)記的鼠抗人抗血小板單克隆抗體(CD42b-PE)購于美國BD公司。

1.2.2PEVs檢測

基于既往文獻(xiàn)中使用的方法，檢測研究對象外周血PEVs[7]。所有研究對象均于入院第2天、門診就診當(dāng)天或體檢當(dāng)天，采用流式細(xì)胞儀檢測血漿PEVs。研究對象晨起采集空腹靜脈血，即刻引入枸櫞酸鹽抗凝管，以1 000 r/min的轉(zhuǎn)速運行10 min獲取富血小板血漿，再將其以3 500 r/min的轉(zhuǎn)速運行15 min獲取貧血小板血漿。將貧血小板血漿冰上解凍，取50 μL貧血小板血漿，加入5 μL 藻紅蛋白標(biāo)記的CD42(CD42-PE)充分混合孵育20 min，再加入40 μL熒光計數(shù)微球充分混合，加入1 mL生理鹽水緩沖液。采用流式細(xì)胞儀對樣品進(jìn)行分析。以CD42b熒光散點圖陽性范圍作為第一設(shè)門區(qū)域，再以前向散射光(FSC)/側(cè)向散射光(SSC)坐標(biāo)<1.0 μm微球熒光強(qiáng)度以下作為第二門區(qū)域。根據(jù)熒光計數(shù)微球計算PEVs水平。當(dāng)門內(nèi)收集到10 000個微粒時停止計數(shù)，依據(jù)PEVs所占百分比計算血漿PEVs數(shù)量。

1.2.3臨床資料的收集

由專業(yè)兒科醫(yī)師收集IgAV患兒住院期間臨床資料，包括臨床癥狀、實驗室檢查結(jié)果，如關(guān)節(jié)炎發(fā)生情況，血常規(guī)、尿常規(guī)，超敏C反應(yīng)蛋白(Hs-CRP)、紅細(xì)胞沉降率(ESR)、抗溶血性鏈球菌“O”(ASO)、總免疫球蛋白E(IgE)、血漿D二聚體、纖維蛋白原水平，便潛血情況等。

1.2.4隨訪時間與終點事件

所有IgAV患兒均于出院后第2、4、12周到兒科門診復(fù)診，復(fù)診時據(jù)患者尿常規(guī)、尿蛋白肌酐比結(jié)果確定腎損傷情況。未能復(fù)診者由?？漆t(yī)師電話追蹤和了解其腎臟損傷情況。非IgAVN患兒隨訪至出現(xiàn)腎損傷，如無腎損傷發(fā)生則隨訪至出院后12周；IgAVN患兒隨訪至出院后12周。隨訪由兒科專科醫(yī)師進(jìn)行。終點事件包括遲發(fā)IgAVN和慢性IgAVN。遲發(fā)IgAVN：住院期間未診斷IgAVN而隨訪期間出現(xiàn)血尿或尿蛋白肌酐比>0.2 mg/mg；慢性IgAVN：住院時至隨訪結(jié)束時持續(xù)存在血尿或尿蛋白肌酐比持續(xù)>0.2 mg/mg。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 研究對象一般情況及PEVs水平比較

觀察組男52例，女40例，平均年齡(7.12±3.09)歲，健康對照組男26例，女24例，平均年齡(7.09±2.65)歲，兩組間性別(χ2=0.127,P=0.962)、年齡(t=-0.857,P=0.670)比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。觀察組血漿PEVs水平為(296.94±24.37)個/μL，明顯高于健康對照組的(225.67±34.13)個/μL，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=13.44,P<0.001)。

2.2 不同組別IgAV患兒臨床特征比較

IgAVN組年齡和血漿PEVs水平高于IgAV組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，而兩組間性別分布差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.062)。此外，IgAVN組便潛血陽性患兒百分比、白細(xì)胞計數(shù)、總IgE、ESR、Hs-CRP、血漿D二聚體和纖維蛋白原水平高于IgAV組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。兩組間合并關(guān)節(jié)炎患兒百分比、血小板計數(shù)、補(bǔ)體C3和ASO水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 不同組別IgAV患兒之間的臨床特征比較

2.3 血漿PEVs水平與住院期間IgAVN臨床特點的相關(guān)性分析

Person相關(guān)分析顯示，血漿PEVs水平與IgAVN患兒總IgE、Hs-CRP、白細(xì)胞計數(shù)、ESR、血漿D二聚體水平呈正相關(guān)(P<0.05)，而與年齡和纖維蛋白原水平無明顯相關(guān)性(P>0.05)。Spearman相關(guān)分析顯示，血漿PEVs水平與便潛血陽性百分比呈正相關(guān)(P<0.05)。

表2 PEVs與IgAVN臨床指標(biāo)的相關(guān)性分析

2.4 血漿PEVs水平與遲發(fā)IgAVN和慢性IgAVN的Poisson回歸分析

IgAV組平均隨訪(10.27±3.24)周，失訪9例，總失訪率為18.00%，檢出遲發(fā)IgAVN患兒10例(24.39%)；IgAVN組平均隨訪(10.27±1.6)周，失訪3例，總失訪率為7.14%，確定慢性IgAVN患兒7例(17.95%)。分別以遲發(fā)IgAVN(0=否，1=是)和慢性IgAVN(0=否，1=是)為因變量，年齡、便潛血陽性百分比、總IgE、補(bǔ)體C3、Hs-CRP、血漿D二聚體和基線血漿PEVs為自變量，行GEE-Poisson回歸分析。結(jié)果顯示，校正年齡、便潛血陽性百分比、總IgE、Hs-CRP、血漿D二聚體等指標(biāo)后，血漿PEVs水平與遲發(fā)IgAVN發(fā)生風(fēng)險增加相關(guān)(RR=1.22,95%CI=1.05～1.44，P=0.026)，與慢性IgAVN發(fā)生風(fēng)險增加無關(guān)(RR=1.14,95%CI=0.91～1.67，P=0.083)。見表3、4。

表3 遲發(fā)IgAVN的Poisson回歸分析

表4 慢性IgAVN的Poisson回歸分析

3 討 論

IgAVN累及50%以上的IgAV患兒，是影響IgAV遠(yuǎn)期預(yù)后的首要因素[8]。IgAVN主要的病理改變?yōu)檠苎?；?nèi)皮受損、中性粒細(xì)胞浸潤和免疫復(fù)合物沉積是血管炎腎臟損傷的特征[9]?；A(chǔ)研究證實，血管內(nèi)皮損傷、體內(nèi)存在自身免疫反應(yīng)及急性炎癥時，血小板會釋放PEVs[10-11]。IgAVN發(fā)病機(jī)制中的多個環(huán)節(jié)均可導(dǎo)致PEVs水平升高，因此，患兒體內(nèi)血漿PEVs水平可能反映IgAVN的病情變化。

在多種血管炎性疾病如抗中性粒細(xì)胞胞質(zhì)抗體相關(guān)性血管炎[12]和系統(tǒng)性紅斑狼瘡[13]的研究表明，血管炎介導(dǎo)腎炎患者體內(nèi)PEVs升高，而抑制PEVs釋放與血管炎介導(dǎo)的腎臟損傷改善有關(guān)[14]。目前，PEVs在兒童IgAVN中的表達(dá)缺乏研究。本研究中，觀察組患兒血漿PEVs水平明顯高于健康對照組，而IgAVN組患兒血漿PEVs水平也高于IgAV組，提示PEVs可能與IgAV病情活動及腎臟損傷有關(guān)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，血漿PEVs水平增高與IgAVN患兒病情活動性指標(biāo)如總IgE、Hs-CRP、白細(xì)胞計數(shù)、ESR、血漿D二聚體相關(guān)，提示PEVs水平反映了兒童IgAVN的病情活動和其他內(nèi)臟損傷情況。此外，消化道損傷是IgAVN的嚴(yán)重并發(fā)癥，PEVs水平與便潛血陽性百分比相關(guān)，提示高PEVs水平時患兒病情更加嚴(yán)重。早期準(zhǔn)確評估病情，制訂針對性治療方案是改善IgAVN預(yù)后的關(guān)鍵，但目前IgAVN最有效的評估方法為腎臟活組織病理檢查[15]。鑒于其有創(chuàng)性，臨床開展仍存在困難，尋找可靠的IgAVN血清標(biāo)志物具有重要臨床價值。本研究結(jié)果顯示，PEVs水平可作為有效評價IgAVN病情活動和嚴(yán)重程度的客觀指標(biāo)。

盡管多數(shù)IgAVN患兒早期即出現(xiàn)尿檢異常，但仍有部分IgAVN發(fā)生于病程中期或后期[16]。由于缺乏簡便易行且具有特異性的預(yù)測指標(biāo)，此部分患兒的診斷和治療常常延遲，預(yù)后受到影響。本研究中，IgAV組平均隨訪(10.27±3.24)周，檢出遲發(fā)IgAVN患兒10例(24.39%)，Poisson回歸結(jié)果表明，基線血漿PEVs水平是隨訪期內(nèi)出現(xiàn)腎臟損傷的獨立危險因素(RR=1.22)。盡管研究結(jié)果中年齡、便潛血陽性百分比、總IgE、Hs-CRP也與遲發(fā)性IgAVN相關(guān)，但年齡、便潛血陽性百分比、總IgE也與慢性IgAVN有關(guān)，并不具有特異性?；€血漿PEVs與Hs-CRP均僅與遲發(fā)性IgAVN相關(guān)，且基線血漿PEVs水平與遲發(fā)性IgAVN相關(guān)性強(qiáng)于Hs-CRP，因此基線血漿PEVs水平是評估遲發(fā)性IgAVN發(fā)生風(fēng)險的更優(yōu)指標(biāo)。遲發(fā)性IgAVN的發(fā)生與調(diào)節(jié)性T細(xì)胞功能減弱有關(guān)[17]。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞可負(fù)向調(diào)控過激的免疫反應(yīng)，其功能受到抑制，可導(dǎo)致自身免疫反應(yīng)持續(xù)存在，進(jìn)而發(fā)生器官損傷。試驗表明，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞表面FoxP3的表達(dá)下調(diào)與PEVs 水平升高有關(guān)[18]。

成人血漿PEVs水平與慢性腎功能不全有關(guān)[19]，但PEVs是否與IgAVN慢性化相關(guān)并不確定。本研究中，IgAVN組確定慢性IgAVN患兒7例(17.95%)，而基線血漿PEVs水平與慢性IgAVN之間不具有明顯相關(guān)性。因此，PEVs可能并未參與兒童IgAVN的慢性化過程，而僅僅是急性期亢進(jìn)的自身免疫和過激炎癥反應(yīng)的結(jié)果。此外，研究結(jié)果還顯示，發(fā)病年齡、便潛血陽性百分比和總IgE與慢性IgAVN有關(guān)。這一結(jié)果與WANG等[20]和NOSSENT等[21]的研究一致，均表明發(fā)病時年齡較大、合并消化道損傷和過敏因素持續(xù)存在會增加IgAVN的發(fā)生風(fēng)險。

綜上所述，IgAVN患者血漿PEVs水平顯著升高，PEVs水平與IgAVN病情活動和嚴(yán)重程度有關(guān)，并與遲發(fā)IgAVN的發(fā)生風(fēng)險增加有關(guān)，而與IgAVN的慢性化無關(guān)。血漿PEVs水平可用于兒童急性IgAVN病情活動和遲發(fā)IgAVN發(fā)生風(fēng)險的評估，但這一結(jié)論還需在大樣本量研究中進(jìn)行驗證。