紅霉素抑制PI3K/Akt通路增加Nrf2蛋白表達(dá)減輕煙草煙霧暴露下單核細(xì)胞炎性反應(yīng)的效果研究*

孫雪皎，陳 琳，陳 慧，李 程，藍(lán)官引

(柳州市人民醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，廣西柳州 545006)

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是累及肺部及全身的慢性炎癥性疾病，疾病呈進(jìn)行性發(fā)展，嚴(yán)重的COPD致殘率及致死率較高，會(huì)影響患者生活質(zhì)量，給患者帶來(lái)極大的心理負(fù)擔(dān)及經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。煙草煙霧及環(huán)境污染等可引起氧化應(yīng)激，導(dǎo)致氧化損傷，進(jìn)而直接損傷氣道上皮、加重氣道的炎癥反應(yīng)，亦可導(dǎo)致蛋白酶抗蛋白酶失衡等，最終導(dǎo)致氣流受限[1-2]?；颊呙撾x氧化應(yīng)激環(huán)境后氣流受限不能完全逆轉(zhuǎn)，呈持續(xù)性的氣流受限，這是導(dǎo)致COPD發(fā)生、發(fā)展的主要原因之一。

紅系衍生的核因子相關(guān)因子2(Nrf2)是具有調(diào)節(jié)抗氧化基因、維持細(xì)胞內(nèi)氧化還原平衡、抑制凋亡及炎癥等多種生物活性的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，其與多種細(xì)胞因子相互關(guān)聯(lián)，從而發(fā)揮多重保護(hù)作用[3-4]。Nrf2與氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、呼吸系統(tǒng)疾病、惡性腫瘤、癌前病變及心血管疾病等的發(fā)生、發(fā)展有著密切的聯(lián)系[5-6]。近年來(lái)，研究發(fā)現(xiàn)Nrf2在COPD的發(fā)生、發(fā)展中具有重要作用[7-8]。有研究表明，PI3K信號(hào)通路激活Nrf2，進(jìn)而對(duì)抗氧化應(yīng)激，維持氧化/抗氧化平衡[9]。然而，是否有藥物可以通過作用于Nrf2進(jìn)而改善COPD患者的炎癥反應(yīng)，國(guó)內(nèi)外尚無(wú)類似研究。作者以此為切入點(diǎn)，以單核細(xì)胞株(U937細(xì)胞)為研究對(duì)象，觀察紅霉素是否能夠通過作用于Nrf2蛋白的表達(dá),減輕煙草煙霧暴露下單核細(xì)胞的炎癥反應(yīng)，同時(shí)驗(yàn)證在單核細(xì)胞炎癥反應(yīng)中，PI3K/Akt通路與Nrf2的關(guān)系，以及Nrf2是否受PI3K/Akt通路的調(diào)控。本研究將為COPD的防治提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

以人U937細(xì)胞為研究對(duì)象，購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。

1.2 方法

1.2.1分組

采用煙草煙霧提取物(CSE)制造細(xì)胞氧化應(yīng)激模型，分為以下4組：空白對(duì)照組(n=3)，細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)U937細(xì)胞，不給予紅霉素及CSE干預(yù)；CSE組(n=3)，給予CSE刺激細(xì)胞過夜；紅霉素組(n=3)，給予紅霉素預(yù)孵育2 h后予CSE刺激過夜；抑制劑組(n=3)，給予PI3K/Akt抑制劑LY294002預(yù)孵育2 h后予CSE刺激過夜。根據(jù)轉(zhuǎn)染Nrf2-siRNA干擾細(xì)胞Nrf2蛋白表達(dá)方式，分為以下6組：siRNA NC對(duì)照組(n=3)，采用細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)，不給予紅霉素及CSE干預(yù)；siRNA NC+CSE組(n=3)，給予CSE刺激細(xì)胞過夜；NC+CSE+紅霉素組(n=3)，給予紅霉素預(yù)孵育2 h后予CSE刺激過夜；Nrf2-siRNA組(n=3)，應(yīng)用脂質(zhì)體法Nrf2-siRNA轉(zhuǎn)染U937細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞應(yīng)用細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)；Nrf2-siRNA+CSE組(n=3)，轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞給予CSE刺激細(xì)胞過夜；Nrf2-siRNA+CSE+紅霉素組(n=3)，轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞給予紅霉素預(yù)孵育2 h后予CSE刺激過夜。

1.2.2U937細(xì)胞的培養(yǎng)

U937細(xì)胞為懸浮細(xì)胞，采用由RPMI1640培養(yǎng)基及胎牛血清配置、含10%胎牛血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)，于二氧化碳培養(yǎng)箱37 ℃、5%CO2環(huán)境中溫育。培養(yǎng)基4 ℃存儲(chǔ)。嚴(yán)格按照無(wú)菌操作，無(wú)菌臺(tái)使用前打開紫外燈照射30 min，各種所需的容器、槍頭等物品必須經(jīng)高壓滅菌消毒后才能用于細(xì)胞培養(yǎng)。應(yīng)用脂質(zhì)體法Nrf2-siRNA轉(zhuǎn)染U937細(xì)胞。給予PI3K/Akt抑制劑LY294002預(yù)孵育2 h后予CSE刺激過夜。

1.2.3CSE的刺激及紅霉素、抑制劑的干預(yù)

(1)CSE的制備與應(yīng)用。將2支去過濾嘴燃燒的香煙煙霧由注射器驅(qū)動(dòng)裝置連續(xù)抽吸，將煙霧緩慢通入20 mL無(wú)血清的培養(yǎng)基中，制成懸液，放入密封瓶?jī)?nèi)，搖動(dòng)使其充分溶解，應(yīng)用紫外分光光度計(jì)(波長(zhǎng)320 nm，吸光系數(shù)17.5)測(cè)量煙草煙霧提取物的濃度。(2)CSE及紅霉素的水平確定。應(yīng)用Brdu法確定試驗(yàn)中所應(yīng)用的CSE及紅霉素水平。(3)紅霉素及抑制劑的干預(yù)。紅霉素組給予紅霉素預(yù)孵育2 h后予CSE刺激過夜；抑制劑組、CSE組應(yīng)用細(xì)胞培養(yǎng)液代替紅霉素，其余不變；空白對(duì)照組應(yīng)用細(xì)胞培養(yǎng)液代替CSE及紅霉素。經(jīng)以上處理后，離心并獲取上清液及細(xì)胞。

1.2.4各項(xiàng)指標(biāo)的檢測(cè)

(1)IL-8水平。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA，武漢華美生物工程有限公司)測(cè)定各組細(xì)胞上清液中IL-8的濃度。(2)Akt mRNA、Nrf2 mRNA及核因子(NF)-κB p65 mRNA水平。采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)檢測(cè)各組細(xì)胞中Akt mRNA、Nrf2 mRNA、NF-κB p65 mRNA的表達(dá)。(3)Akt、PAkt、Nrf2、NF-κB p65蛋白水平。采用Western blotting檢測(cè)各組細(xì)胞內(nèi)Akt、PAkt、Nrf2、NF-κB p65蛋白的表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 空白對(duì)照組、CSE組、紅霉素組、抑制劑組IL-8水平比較

與空白對(duì)照組比較，CSE組IL-8水平明顯升高，紅霉素組、抑制組IL-8水平較CSE組下降(P<0.01)。見表1。

表1 不同細(xì)胞氧化應(yīng)激模型組IL-8濃度比較

2.2 不同細(xì)胞氧化應(yīng)激模型組細(xì)胞中Akt mRNA、Nrf2 mRNA及NF-κB p65 mRNA比較

不同細(xì)胞氧化應(yīng)激模型組細(xì)胞中Akt mRNA差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。CSE組Nrf2 mRNA表達(dá)較空白對(duì)照組下降，NF-κB p65 mRNA表達(dá)升高；紅霉素組和抑制劑組Nrf2 mRNA表達(dá)有所提高，NF-κB p65 mRNA表達(dá)降低。見圖1。

*：P<0.01；#：P>0.05；ns:P>0.05。

2.3 不同細(xì)胞氧化應(yīng)激模型組細(xì)胞中Akt、PAkt、Nrf2及NF-κB p65蛋白表達(dá)比較

4組細(xì)胞中Akt蛋白表達(dá)無(wú)明顯差異。CSE組Nrf2蛋白達(dá)較空白對(duì)照組下降，PAkt及NF-κB p65蛋白表達(dá)升高；紅霉素組和抑制劑組Nrf2蛋白表達(dá)有所提高，PAkt及NF-κB p65蛋白表達(dá)降低，但兩組間無(wú)明顯差異。見圖2。

GAPDH:甘油醛-3-磷酸脫氫酶，內(nèi)參；+：加入；-：不加入。

2.4 不同干擾組中細(xì)胞Akt、PAkt、Nrf2及NF-κB p65蛋白表達(dá)比較

Nrf2-siRNA組Nrf2蛋白表達(dá)較siRNA NC組明顯降低，但與Nrf2-siRNA+CSE組及Nrf2-siRNA+CSE+紅霉素組比較無(wú)明顯差異；Nrf2-siRNA組的NF-κB p65蛋白表達(dá)較siRNA NC組升高；siRNA NC+CSE組Nrf2蛋白表達(dá)較siRNA NC組降低，而NC+CSE+紅霉素組較siRNA NC+CSE組表達(dá)升高；siRNA NC組與Nrf2-siRNA組的PAkt蛋白表達(dá)無(wú)差異，但siRNA NC+CSE組、Nrf2-siRNA+CSE組表達(dá)均升高，而NC+CSE+紅霉素組、Nrf2-siRNA+CSE+紅霉素組表達(dá)又再度降低。不同干擾組間Akt蛋白表達(dá)無(wú)明顯差異。見圖3。

+：加入；-：不加入。

3 討 論

Nrf2活化受蛋白磷酸化的調(diào)控。目前認(rèn)為，絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)、PI3K、蛋白激酶C(PKC)等信號(hào)通路分子廣泛參與了Nrf2的活化和核轉(zhuǎn)位過程，誘導(dǎo)Nrf2核轉(zhuǎn)位的信號(hào)通路類型與誘導(dǎo)劑、細(xì)胞種類等因素相關(guān)。有研究表明，PI3K/Akt-Nrf2信號(hào)通路激活是兔內(nèi)毒素休克誘發(fā)急性肺損傷時(shí)機(jī)體的適應(yīng)性調(diào)節(jié)機(jī)制[10]。然而，在COPD炎癥的發(fā)生與發(fā)展中，Nrf2的表達(dá)如何受PI3K/Akt通路調(diào)節(jié)尚不明確，是否有抗炎藥物能夠通過作用于PI3K/Akt-Nrf2信號(hào)通路減輕COPD的炎癥反應(yīng)，國(guó)內(nèi)外尚無(wú)相關(guān)研究。

本研究結(jié)果表明，單核細(xì)胞經(jīng)CSE刺激后炎癥細(xì)胞因子水平提高，NF-κB p65升高，PI3K/Akt通路關(guān)鍵蛋白PAkt表達(dá)增加，Nrf2表達(dá)下降；經(jīng)紅霉素干預(yù)后炎癥反應(yīng)減輕，PAkt表達(dá)下降，而Nrf2水平升高。應(yīng)用PI3K/Akt通路抑制劑LY294002作為本研究的陽(yáng)性對(duì)照，其與紅霉素有同樣的效果。煙草煙霧刺激后單核細(xì)胞炎癥反應(yīng)增加，與PI3K/Akt通路激活、Nrf2蛋白表達(dá)下降有關(guān)，紅霉素及通路抑制劑均可抑制PI3K/Akt通路活性，提高Nrf2蛋白的表達(dá)，進(jìn)而減輕煙草煙霧暴露下單核細(xì)胞的炎癥反應(yīng)。為進(jìn)一步證實(shí)PI3K/Akt通路與Nrf2蛋白的關(guān)系，作者轉(zhuǎn)染Nrf2-siRNA干擾細(xì)胞中Nrf2蛋白的表達(dá)，應(yīng)用siRNA NC組作為對(duì)照，結(jié)果表明，Nrf2-siRNA組的NF-κB p65蛋白表達(dá)較siRNA NC組升高，進(jìn)一步證明Nrf2表達(dá)下降可導(dǎo)致炎癥反應(yīng)增加；而兩組的PAkt蛋白表達(dá)無(wú)差異，證明Nrf2的變化不影響PI3K/Akt通路活性。結(jié)合前述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，證明Nrf2在PI3K/Akt下游，受PI3K/Akt通路的調(diào)控，紅霉素可通過作用于PI3K/Akt-Nrf2減輕煙草煙霧暴露導(dǎo)致的單核細(xì)胞炎癥反應(yīng)。

國(guó)外有研究顯示，Nrf2系統(tǒng)的激活被認(rèn)為是一種有效的細(xì)胞保護(hù)策略，可用于治療不同的疾病，例如新型冠狀病毒感染[11]。此外，COPD相關(guān)的研究顯示,Nrf2激活劑CPUY192018通過激活Nrf2，在對(duì)抗氧化應(yīng)激和改善代謝方面顯示出顯著效果[12]。在經(jīng)CSE和脂多糖處理的A549細(xì)胞中，DJ-1通過激活Wnt3a/β-catenin信號(hào)通路來(lái)調(diào)節(jié)Nrf2介導(dǎo)的MRP1表達(dá)和抗氧化防御，以上兩項(xiàng)研究可能在COPD的治療方面提供潛在的靶點(diǎn)和新思路[13]。紫杉醇可能通過刺激Nrf2信號(hào)通路來(lái)抑制苯并芘所致肺損傷的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)[14]。由此可見，Nrf2的作用在近年來(lái)受到了廣泛關(guān)注，值得進(jìn)一步的研究與探索。

綜上所述，PI3K/Akt信號(hào)通路活性及其下游Nrf2蛋白的表達(dá)與煙草煙霧暴露的單核細(xì)胞炎癥反應(yīng)表達(dá)有關(guān)，紅霉素能夠抑制PI3K/Akt通路活性，增加Nrf2蛋白表達(dá)，減輕炎癥反應(yīng)，這將為今后的研究及防治工作提供新思路及實(shí)驗(yàn)依據(jù)。