miRNAs作為糖尿病腎臟疾病早期生物標(biāo)志物的可行性及作用機(jī)制

邢晨皓，唐紅悅，趙子今 綜述，盧亞敏審校

1.河北北方學(xué)院研究生學(xué)院，河北張家口 075000；2.河北省人民醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科，河北石家莊 050051

糖尿病腎臟疾病(DKD)是一種以持續(xù)性蛋白尿和腎功能進(jìn)行性下降為特征的臨床綜合征，是一種典型的腎小球疾病，發(fā)病率逐年上升，已成為終末期腎病最常見的原因[1]，也是近幾年暴發(fā)的新型冠狀病毒感染嚴(yán)重結(jié)局的一項(xiàng)危險(xiǎn)因素[2]。蛋白尿是目前臨床上評(píng)估和監(jiān)測(cè)腎功能的指標(biāo)之一，但是約有1/3的患者在蛋白尿發(fā)生前就已存在腎功能下降，因而僅檢測(cè)蛋白尿不足以監(jiān)測(cè)DKD的發(fā)病率和進(jìn)展[3]。事實(shí)上腎臟穿刺活檢仍然是正確診斷DKD的金標(biāo)準(zhǔn)，但其為有創(chuàng)檢查，不能被患者廣泛接受，而且不能完全做到早期診療，它通常局限于顯示非典型臨床表現(xiàn)的病例。因此，DKD的診斷仍然具有挑戰(zhàn)性，迫切需要高特異性、快速、非侵入性的生物標(biāo)志物來診斷DKD[4]。微小核糖核酸(miRNAs)是普遍存在的內(nèi)源性非編碼單鏈RNA轉(zhuǎn)錄物，最常見的長度為19～25個(gè)核苷酸，通過阻斷蛋白質(zhì)翻譯和/或誘導(dǎo)信使RNA降解作為基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)物。有研究結(jié)果表明，miRNAs通過提供復(fù)雜的反饋系統(tǒng)來保持基因表達(dá)的穩(wěn)定性，從而影響心臟、腎臟、脂肪和免疫組織中的干細(xì)胞活性[5]，并且在血液和尿液中穩(wěn)定存在，其水平的高低影響疾病的進(jìn)程，由此表明miRNAs有可能成為DKD的早期生物標(biāo)志物。

1 miRNAs作為DKD早期生物標(biāo)志物的可行性

眾所周知，持續(xù)性高血糖是糖尿病并發(fā)癥的主要誘因，有研究報(bào)道顯示，不同濃度的葡萄糖對(duì)腎小球內(nèi)皮細(xì)胞中miR-21表達(dá)水平的影響不同，提示腎小球內(nèi)皮細(xì)胞miR-21表達(dá)水平明顯上調(diào)，且miR-21的表達(dá)水平隨葡萄糖濃度升高而逐漸升高，高濃度葡萄糖對(duì)miR-21表達(dá)水平的影響呈時(shí)間依賴性[6]。由此得出，檢測(cè)血清miR-21表達(dá)水平將為DKD早期腎小球內(nèi)皮細(xì)胞損傷的診斷和臨床腎臟功能受損情況的評(píng)估提供更敏感而可靠的依據(jù)。

miR-638在DKD中表達(dá)水平下調(diào)，LIN等[7]研究證實(shí)，miR-638低表達(dá)可以將DKD患者與2型糖尿病患者及健康對(duì)照者區(qū)分開來，因此，miR-638可以作為DKD早期診斷的生物標(biāo)志物。此外，miR-638可能通過調(diào)節(jié)增殖和炎癥參與DKD，為DKD的治療提供新的治療靶點(diǎn)。JIA等[8]評(píng)估了在腎臟中呈高度表達(dá)的幾種miR(miR-192、miR-194和miR-215) 在DKD早期診斷中的作用，比較了不同程度蛋白尿的2型糖尿病患者尿液中miR-192、miR-194和miR-215的表達(dá)水平，與微量清蛋白尿組比較，這3種miRNAs的表達(dá)水平均明顯增加，且miR-192在區(qū)分正常清蛋白組和微量清蛋白組方面優(yōu)于miR-194和miR-215；人腎小管上皮細(xì)胞暴露于高濃度葡萄糖會(huì)增加細(xì)胞上清液囊泡miR-192、miR-194和miR-215的表達(dá)水平，表明這些標(biāo)志物是一種潛在的內(nèi)源性來源，因此，可作為DKD早期診斷的生物標(biāo)志物。

在對(duì)2型糖尿病患者的研究中發(fā)現(xiàn)，無論正常蛋白尿還是過量蛋白尿患者，血清和尿液中白細(xì)胞介素(IL)-1α、IL-8、IL-18與miRNA譜之間均存在顯著相關(guān)性，miRNA-125a直接調(diào)控IL-6R，被認(rèn)為參與了DKD的發(fā)病機(jī)制[9]。miRNA-126表達(dá)水平隨著蛋白尿加重而下調(diào)，在早期階段不能維持內(nèi)皮細(xì)胞功能的完整性，與腎臟結(jié)構(gòu)的改變密切相關(guān)。有研究報(bào)道血液中miR-377和miR-192作為DKD生物標(biāo)志物的可能性，其受試者工作特征曲線(ROC曲線)分析結(jié)果顯示這兩種miRNA能夠明顯區(qū)分DKD患者和健康受試者，具有區(qū)分正常清蛋白尿和微量清蛋白尿/大量清蛋白尿的能力，并且miR-377表達(dá)水平隨著清蛋白尿的嚴(yán)重程度加重而增加[10]。由此表明，在DKD早期血液中miR-377的表達(dá)水平就已經(jīng)發(fā)生了變化，可以較早地提示DKD發(fā)生，可以作為DKD早期診斷的生物標(biāo)志物。

2 miRNAs在DKD中的作用機(jī)制

導(dǎo)致DKD發(fā)生和發(fā)展的因素有很多種，其中高血糖狀態(tài)是DKD發(fā)生和發(fā)展的基礎(chǔ)環(huán)節(jié),脂代謝紊亂是DKD發(fā)生的重要危險(xiǎn)因素，炎癥和氧化應(yīng)激激活是DKD病變的直接誘因。

2.1miRNAs與糖、脂代謝 近年來，miRNAs已被證明在糖代謝調(diào)節(jié)的所有生理和病理過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，包括胰島素利用、葡萄糖攝取和胰島素分泌。miRNAs可能是維持葡萄糖穩(wěn)態(tài)有希望的靶點(diǎn)[11]。miR-21可以通過靶向叉頭框蛋白O1(FoxO1)通路介導(dǎo)的磷酸烯醇丙酮酸羧激酶和葡萄糖-6-磷酸酶下調(diào)來降低糖異生，并且靶向3T3-L1脂肪細(xì)胞中的磷酸酯酶與張力蛋白同源物(PTEN)，導(dǎo)致胰島素信號(hào)通路中PI3K-Akt激活的改變。miR-33a和miR-33b調(diào)節(jié)胰島素受體底物(IRS)-2的表達(dá)，可以進(jìn)一步影響信號(hào)網(wǎng)絡(luò)中的下游蛋白，包括FoxO1細(xì)胞質(zhì)定位和蛋白激酶B磷酸化(Akt磷酸化)。miR-155可以增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因小鼠肝臟、脂肪組織和骨骼肌中的糖酵解、IRS-1磷酸化和胰島素刺激的Akt[12]。miR-185-5p通過靶向其 3′-非翻譯區(qū)直接抑制葡萄糖6磷酸酶表達(dá)，抑制db/db小鼠肝糖異生和減輕高血糖作用。

有研究結(jié)果表明，miRNAs在調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝中起至關(guān)重要的作用[13]，過氧化物酶體增殖物激活受體α(PPAR-α)是脂質(zhì)代謝的關(guān)鍵調(diào)控因子，糖尿病大鼠腎組織中miR-21表達(dá)水平明顯升高，PPAR-α mRNA的表達(dá)水平明顯降低，miR-21通過調(diào)控炎癥因子(IL-6和IL-18)及凋亡蛋白Bax途徑，進(jìn)而抑制下游靶基因PPAR-α的表達(dá)水平，從而促進(jìn)脂質(zhì)代謝紊亂，加劇細(xì)胞炎癥與凋亡反應(yīng)。

2.2miRNAs與炎癥 有研究報(bào)道顯示，高血糖誘導(dǎo)的miR-467a-5p可以抑制與調(diào)節(jié)炎癥有關(guān)的血栓反應(yīng)蛋白-1產(chǎn)生[14]。給小鼠注射miR-467a-5p拮抗劑，抑制miR-467a-5p可導(dǎo)致脂肪組織中巨噬細(xì)胞浸潤增加，脂肪組織中IL-6水平升高，血漿胰島素水平升高和葡萄糖清除率降低；miR-467a-5p通過靶向血栓反應(yīng)蛋白-1來調(diào)控炎癥。miRNAs在DKD發(fā)展過程中的調(diào)節(jié)作用尤為突出[15]，在不同嚴(yán)重程度的DKD中，miRNAs通過PTEN、PI3K/Akt和絲裂原活化蛋白激酶通路對(duì)轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β進(jìn)行調(diào)節(jié)，從而控制不同炎癥程度的表達(dá)。高糖通過己糖胺生物合成途徑代謝介導(dǎo)細(xì)胞外基質(zhì)的產(chǎn)生和炎癥通路激活，刺激腎臟細(xì)胞中的TGF-β轉(zhuǎn)錄活性增加；同時(shí)己糖胺生物合成途徑產(chǎn)生活化的氨基糖UDP-N-乙酰基葡萄糖胺，催化蛋白質(zhì)葡萄糖胺糖基化，影響一系列細(xì)胞過程，包括炎癥、新陳代謝、運(yùn)輸和細(xì)胞骨架組織，在DKD的發(fā)展中起作用[16]。

有研究發(fā)現(xiàn)，miR-192在正常腎皮質(zhì)中富集，且miR-192可能是腎臟病理改變過程TGF-β1/Smads信號(hào)傳導(dǎo)通路的重要下游介質(zhì)[17]，所以miR-192對(duì)TGF-β1/Smads 炎癥信號(hào)通路具有調(diào)控作用。在DKD腎組織和高葡萄糖刺激的足細(xì)胞中miR-770-5p表達(dá)水平上調(diào)[18]，敲低miR-770-5p可以抑制足細(xì)胞凋亡和炎癥，表明miR-770-5p可能是DKD的潛在治療靶點(diǎn)。

晚期糖基化終產(chǎn)物(AGEs)/高級(jí)糖基化終產(chǎn)物受體相互作用可觸發(fā)活性氧(ROS)生成并激活下游信號(hào)通路，誘導(dǎo)內(nèi)皮祖細(xì)胞凋亡，AGEs在體內(nèi)積累會(huì)引起一系列氧化應(yīng)激反應(yīng)及炎癥[19]。有新的證據(jù)表明，miRNAs與DKD中AGEs介導(dǎo)的病理改變有關(guān),經(jīng)AGEs處理的內(nèi)皮細(xì)胞通過上調(diào)RhoA/ROCK2信號(hào)通路抑制miR-200b/miR-200c的表達(dá)[20]。miR-92b-3p在AGEs對(duì)大鼠DKD模型中的表達(dá)水平變化最為明顯，miR-92b-3p可以與AGEs介導(dǎo)的Smad7的非編碼區(qū)相互作用，使Smad7成為DKD相關(guān)的miRNAs的下游靶點(diǎn)[20]。

在DKD大鼠組織和高葡萄糖處理的腎小管上皮(HK)-2細(xì)胞中均發(fā)現(xiàn)miR-365的表達(dá)水平升高[21]。miR-365可調(diào)節(jié)腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子中的原肌球蛋白相關(guān)激酶B信號(hào)軸誘導(dǎo)DKD纖維化。而沉默miR-365抑制了HK-2細(xì)胞中細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)成分的積累和炎癥細(xì)胞因子的分泌，敲低miR-365可抑制脊髓性肌萎縮癥，降低膠原蛋白Ⅳ、TGF-β1、腫瘤壞死因子-α和IL-6水平，由此表明敲低miR-365可抑制腎纖維化。

2.3miRNAs與氧化應(yīng)激 miR-377在DKD的體外和體內(nèi)模型中均被證實(shí)為過度表達(dá)，其水平增加抑制了p21活化激酶和錳超氧化物歧化酶1、2的翻譯，并增強(qiáng)了纖維連接蛋白產(chǎn)生[22]，其成分的增加可導(dǎo)致系膜基質(zhì)增多、系膜區(qū)擴(kuò)張,最后導(dǎo)致彌漫性腎小球硬化和間質(zhì)纖維化。有研究報(bào)道顯示，miR-4449水平在DKD患者血清外泌體中呈高表達(dá)，通過調(diào)控IL-1β和IL-18水平，以及ROS水平和焦亡，從而在DKD的發(fā)病機(jī)制中起關(guān)鍵作用[23]。此外，無論在DKD患者還是HK-2細(xì)胞中癌癥超甲基化1(HIC1)蛋白的表達(dá)與miR-4449的表達(dá)均呈負(fù)相關(guān)，HIC1通過調(diào)控炎癥和miR-4449/HIC1通路促進(jìn)細(xì)胞焦亡和氧化應(yīng)激。

miR-21在對(duì)照組、DKD早期和中晚期表達(dá)水平依次降低，各組間均有明顯差異，miR-21與氧化應(yīng)激指標(biāo)丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、高級(jí)氧化蛋白質(zhì)產(chǎn)物及煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4(NOX4)均呈負(fù)相關(guān)，與血紅素加氧酶1呈正相關(guān)，進(jìn)而使腎臟組織遭受氧化應(yīng)激損傷,最終表現(xiàn)在氧化應(yīng)激指標(biāo)水平明顯異常[24]。miR-21參與發(fā)病進(jìn)程的具體機(jī)制主要可能是由PTEN/Akt、TGF-β/Smads及基質(zhì)金屬蛋白酶等有關(guān)信號(hào)途徑而實(shí)現(xiàn)，再次證實(shí)血清miR-21與其機(jī)體的氧化應(yīng)激反應(yīng)聯(lián)系緊密。同樣也有相似報(bào)道顯示，DKD患者miR-21與SOD、MDA、NOX4、胱抑素C均有明顯相關(guān)性，且ROC曲線分析結(jié)果顯示miR-21有較高的靈敏度和特異度[25]，由此提示，miR-21對(duì)早期DKD的診斷有較好的價(jià)值，其與糖尿病患者腎功能損傷、氧化應(yīng)激狀態(tài)具有密切關(guān)系。

有報(bào)道顯示，miR-205協(xié)同高遷移率族蛋白B1(HMGB1)在DKD發(fā)生和發(fā)展中起重要作用[26]，HMGB1被鑒定并證實(shí)是miR-205的靶標(biāo)，miR-205通過靶向HMGB1對(duì)高葡萄糖誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷起保護(hù)作用。過表達(dá)miR-205 或敲低脂蛋白受體6可抑制核因子κB信號(hào)通路，進(jìn)一步調(diào)節(jié)高葡萄糖誘導(dǎo)的系膜細(xì)胞增殖、氧化應(yīng)激、ECM積累和炎癥。

3 小 結(jié)

盡管DKD的發(fā)生機(jī)制還未完全闡明，但miRNAs的發(fā)現(xiàn)為DKD的分子水平研究提供了新的方向。miRNAs與DKD的關(guān)系還需要更多的臨床研究來證明，對(duì)miRNAs的深入研究及相關(guān)作用機(jī)制靶點(diǎn)的認(rèn)識(shí)與探索，將為DKD的早期診斷和治療帶來新的思路和方法。