玉米赤霉烯酮降解酶ZHD101 的表達(dá)優(yōu)化及 在玉米漿脫毒中的應(yīng)用

陳 偉，谷新晰，李廣靖，徐 冉，谷子林，陳寶江，盧海強

（1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科技學(xué)院，河北 保定 071000；2. 河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科技學(xué)院，河北 保定 071000）

玉米漿是濕法工藝生產(chǎn)玉米淀粉的主要副產(chǎn)品，是1 種黏稠酸性的漿體［1］。玉米漿含有大量的氨基酸、維生素和生長因子，因此在氨基酸發(fā)酵、植物蛋白調(diào)味液和飼料等領(lǐng)域有重要應(yīng)用價值。然而玉米極易受到玉米赤霉烯酮毒素污染［2-3］，過高的玉米赤霉烯酮含量給玉米漿的應(yīng)用帶來了潛在的生物安全問題。玉米赤霉烯酮( Zearalenone，ZEN)是鐮刀菌產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物，具有較強的雌激素效應(yīng)、致癌性和遺傳毒性［4-6］，ZEN 不僅可以降低糧食和農(nóng)副產(chǎn)品的質(zhì)量，還可以從食物鏈進入人體，并對人體健康造成嚴(yán)重?fù)p傷［7］。

大量研究者嘗試物理、化學(xué)及生物法進行玉米赤霉烯酮的降解，而其中的生物酶法具有綠色、高效及反應(yīng)溫和等特點。目前已發(fā)現(xiàn)三類酶可有效降解玉米赤霉烯酮，分別為漆酶(Laccase，EC 1.10.3.2)，內(nèi)酯水解酶(Lactonohydrolase，EC 3.1.1)和過氧化物酶(Peroxidase，EC 1.11.1.X)［8］。內(nèi)酯水解酶因降解ZEN 及ZEN 衍生物的徹底性而成為研究熱點，其中ZHD101 酶因其在該類酶中的引領(lǐng)地位一直是研究關(guān)注的對象。2002 年，Takahashi-Ando 等首次從粉紅黏帚霉 IFO7063 中獲得ZEN 降解酶基因（ZHD101），隨后研究人員利用大腸桿菌、裂殖酵母、釀酒酵母和水稻為宿主對ZHD101基因進行異源表達(dá)及性質(zhì)研究，這為全面表征酶學(xué)性質(zhì)提供了豐富的數(shù)據(jù)［9-12］。隨后，ZHD101 酶的表達(dá)效率的提高及應(yīng)用價值探討逐漸成為關(guān)注重點［13］。

大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)在廉價培養(yǎng)基中易快速生長和易于規(guī)?；a(chǎn)，大量研究結(jié)果指出外源基因密碼子與表達(dá)宿主密碼子偏好性的差異會降低翻譯水平，甚至?xí)钄喾g過程。因此，通過對外源基因密碼子進行優(yōu)化可提高外源蛋白的表達(dá)量。除此之外，適宜的發(fā)酵參數(shù)是提高工程菌生產(chǎn)能力和降低生產(chǎn)成本的重要手段［14-16］。目前，響應(yīng)面優(yōu)化策略是眾多優(yōu)化方法中的首選。

本研究依據(jù)大腸桿菌的密碼子偏好性對ZHD101基因的密碼子進行同義優(yōu)化，采用響應(yīng)面優(yōu)化策略探究工程菌最優(yōu)的發(fā)酵條件，直接分析ZHD101 酶降解玉米漿中ZEN 的效果。本研究不僅可以豐富ZHD101 蛋白高效表達(dá)的策略，同時還可探究其在玉米漿ZEN 脫毒中的應(yīng)用前景，為實際生產(chǎn)的應(yīng)用提供一定指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玉米漿樣品購自河北斐默特生物科技有限公司；赤霉烯酮標(biāo)準(zhǔn)品購自上海源葉生物科技有限公司；玉米赤霉烯酮(ZEN)ELISA 試劑盒，酶免；異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，卡那霉素(Kan)等分子試劑購自北京索萊寶科技有限公司；菌株E. coliBL21(DE3)為本實驗室保存。甲醇、乙腈為色譜純，購自德國默克公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

酶標(biāo)儀，Bio-RAD；SDS-PAGE 電泳設(shè)備與凝膠成像系統(tǒng)，北京君意東方電泳設(shè)備有限公司。立式高速低溫離心機，HITACHI 公司；Biometra Tprofessional PCR 儀， 德 國Biometra 公 司；TU-1810 紫外分光光度計，北京普析通用儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 玉米赤霉烯酮酶ZHD101基因的密碼子優(yōu)化與合成 使用數(shù)據(jù)庫(http://www.kazusa.or.jp/codon/) 中的大腸桿菌相關(guān)數(shù)據(jù)將ZHD101基因（ALI16790.1）中使用頻率低的密碼子進行優(yōu)化，同時使用RNA 折疊網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器和mRNA 翻譯折疊優(yōu)化的密碼子以進行蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測手動校正。GC含量設(shè)定在40%至50%之間，沒有局部峰。優(yōu)化后的基因由金斯瑞生物科技有限公司合成至pET-28a 表達(dá)質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌TOP10 中保存。

1.3.2 重組菌株的構(gòu)建表達(dá)及分析 將pET-28a-ZHD101 表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞中，涂布于含卡那抗生素的 LB 平板上，37°C 過夜培養(yǎng)。挑取單克隆進行菌落PCR 鑒定，陽性克隆送上海生工生物公司測序驗證。將鑒定正確的重組子的菌株接種于含卡那抗生素的LB 液體培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)12 h，以1%的接種量轉(zhuǎn)接于含相應(yīng)抗生素的 LB 液體培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)3 h 至A600=0.8 時，加入異丙基-β-D 硫代半乳糖苷( IPTG)至終濃度1 mmol/L，在37 ℃振蕩培養(yǎng)4 h。離心收集誘導(dǎo)表達(dá)后的細(xì)胞并使用超聲波細(xì)胞粉碎機進行破碎。高速離心后，取適量上清進行SDS-PAGE 分析。

1.3.3 工程菌株發(fā)酵條件的優(yōu)化 在單因素實驗基礎(chǔ)上，利用Minitab 17 軟件設(shè)計Plackett-Burman 試驗對6 個影響工程菌株產(chǎn)酶量的因素進行分析，篩選影響表達(dá)量的最主要影響因素。Plackett-Burman設(shè)計見表1。

表1 Plackett-Burman 試驗因子與水平Table 1 Plackett Burman test factors and levels

根據(jù)Plackett-Burman 試驗結(jié)果找出的3 個最主要因素設(shè)計最陡爬坡實驗，并通過Plackett-Burman試驗回歸方程得到各因子系數(shù)，確定主要因素的變化方向及步長，得到響應(yīng)面實驗的中心點。在此基礎(chǔ)上，運用Design Expert 11 設(shè)計Box-Benhnkens試驗對工程菌發(fā)酵產(chǎn)酶條件進行3 因素3 水平的響應(yīng)面分析實驗，獲得最佳發(fā)酵工藝條件。

1.3.4 ZHD101蛋白表達(dá)量分析 收集取菌體沉淀，液氮凍融后向其加入100 μL 裂解液（0.5 mg/mL 溶菌酶，50 mmol/L 三羥甲基氨基甲烷—鹽酸緩沖液（Tris-HCl）pH 8.0，100 mmol/L 氯化鈉（NaCl），冰浴 45 min 后離心 15 min，取上清制樣，使用12%的聚丙烯酰胺凝膠進行SDS-PAGE（Bio-Rad），考馬斯亮藍(lán)染液對凝膠進行染色。

掃描圖像并利用Quantity One 軟件對每條電泳條帶進行圖像分析，測得電泳條帶的平均灰度值乘以相應(yīng)條帶的面積（總灰度值）分析得到各樣品中目的蛋白的表達(dá)量。

1.3.5 重組酶ZHD101在玉米漿中的應(yīng)用 以0.05 mol/L Tris-HCl (pH8.0) 緩 沖 液 配 制20 μg/mL ZEN 標(biāo) 準(zhǔn)品溶液。取1 mL 毒素標(biāo)準(zhǔn)品溶液，加入1 mL 酶液使ZEN 標(biāo)準(zhǔn)品溶液終濃度為10 μg/mL，37 ℃反應(yīng)2 h，使用酶免玉米赤霉烯酮(ZEN)ELISA 試劑盒MM-32862O1 測定反應(yīng)體系中ZEN 的含量，由ZEN 的減少量來表征ZHD101 活性。重組酶ZHD101 酶活定義：1 個酶活單位U 為每分鐘降解 1 μg ZEN 所需的酶量。

將玉米漿pH 調(diào)至8.0，在1 mL 玉米漿中加入1 mL 酶液混勻，37 ℃條件下反應(yīng)1、2 和3 h，對照加入1 mL 無菌水代替酶液，進行ZEN 含量的測定。以脫毒率來評價重組酶對玉米漿中赤霉烯酮降解能力，脫毒率計算公式：脫毒率(%)=［(A1-A2) /A1］×100，其中A1為對照組玉米漿ZEN 含量，A2為酶處理組玉米漿ZEN 含量。

1.3.6 數(shù)據(jù)分析及處理 每次試驗重復(fù)測定3 次，利用 Excel 和SPSS19.0 軟件對測定結(jié)果進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)結(jié)果采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 ZHD101 基因的設(shè)計和密碼子優(yōu)化

大量研究指出，不同物種或基因存在著同義密碼子的使用偏好性，密碼子偏好性顯著影響外源基因在表達(dá)宿主中的轉(zhuǎn)錄和翻譯速率。按照大腸桿菌密碼子偏好性替代野生基因中的部分密碼子，合成和構(gòu)建ZHD101opt基因，開展重組酶的表達(dá)研究。ZHD101（ALI16 790.1）CDS 區(qū)全長為795 bp，編碼1 個264AA 組成的成熟蛋白。重新設(shè)計的目標(biāo)基因ZHD101opt與野生ZHD101wt序列的一致性為 81.1%。設(shè)計后的目標(biāo)基因編碼1 條長度為264 個氨基酸殘基組成的重組蛋白，與野生ZHD101一致。

在本研究中，對ZHD101wt基因密碼子、ZHD101opt基因密碼子和大腸桿菌密碼子使用頻率進行分析，結(jié)果見表2。經(jīng)分析ZHD101wt基因在同義密碼子的使用偏好性上與大腸桿菌有較大差異，ZHD101wt基因序列中含有大腸桿菌稀有密碼子27 個，并且ZHD101wt基因序列中有4 處出現(xiàn)連續(xù)稀有密碼子（GGA CCC、CCC GGA、AGG AUA、CGA GGA）， 稀有密碼子和連續(xù)稀有密碼子的存在會降低翻譯效率，甚至使翻譯終止。ZHD101基因在優(yōu)化119個密碼子后，27 個稀有密碼子被相應(yīng)的同義密碼子替換，連續(xù)稀有密碼子消失。其CAI（Codon Adaptation Index）值經(jīng)OptimumGeneTM 軟件在線（http://www.genscript.com.cn/ technology-support/ on-line-tools）計算為0.97；與優(yōu)化前，為0.64 相比有較大改善，CAI值大于 0.8 則意味著該目標(biāo)基因可以在大腸桿菌中高效表達(dá)。優(yōu)化了GC含量和不利峰后，ZHD101opt基因中GC平均值由56.35%調(diào)整為60.23%，并且延長了mRNA 的半衰期，破壞了影響核糖體結(jié)合和mRNA 穩(wěn)定性的莖環(huán)結(jié)構(gòu)。此外，優(yōu)化過程篩選并成功地修飾了順式負(fù)作用位點。

表2 ZHD101 野生型基因密碼子、ZHD101 優(yōu)化型基因密碼子和大腸桿菌密碼子使用頻率統(tǒng)計表Table 2 Statistics of ZHD101 wild type gene codon, ZHD101 optimized gene codon and E. coli codon usage frequency

2.2 工程菌株ZHD101opt 基因誘導(dǎo)表達(dá)及產(chǎn)物的SDS-PAGE 分析

采用熱激法進行了ZHD101opt基因的大腸桿菌轉(zhuǎn)化，經(jīng)測序鑒定篩選出正確的工程菌E. coliBL21 (DE3){pET-28a-ZHD101opt}進行搖瓶誘導(dǎo)表達(dá)后，收集菌體并裂解，取上清進行 SDS-PAGE 分析表達(dá)情況，結(jié)果見圖1，經(jīng)SDS-PAGE 電泳分析得出ZHD101opt表觀分子量約為28 ～29 kD，與理論分子量28.8 kD 相符。

圖1 玉米赤霉烯酮水解酶ZHD101 的SDS-PAGE 分析Fig. 1 SDS-PAGE analysis of zearalenone hydrolase ZHD101

2.3 玉米赤霉烯酮水解酶ZHD101opt 工程菌發(fā)酵條件的優(yōu)化

使 用Minitab 17 軟 件 設(shè) 計Plackett-Burman 試驗（N=6），每組進行3 次平行試驗，以工程菌表達(dá)的ZHD101 的SDS-PAGE 總灰度值為響應(yīng)值。Plackett-Burman 試驗結(jié)果經(jīng)分析得出誘導(dǎo)時間、誘導(dǎo)溫度和誘導(dǎo)種齡為顯著影響因子，進而設(shè)計最陡爬坡試驗得出響應(yīng)面試驗中心點，最陡爬坡試驗實驗設(shè)計及分析結(jié)果見表3。

表3 最陡爬坡試驗及結(jié)果Table 3 Climbing test and results

由表3 可知，試驗號為3 的玉米赤霉烯酮降解酶ZHD101 表達(dá)總灰度值最大，即誘導(dǎo)溫度29 ℃、誘導(dǎo)種齡0.8 和誘導(dǎo)時間10 h，以此為中心點進行響應(yīng)面試驗設(shè)計。運用Design-Expert 11 軟件設(shè)計3因素3 水平響應(yīng)面試驗共17 個實驗點的響應(yīng)面分析實驗。其中，5 個零點重復(fù)作為誤差分析，每個試驗進行3 次。響應(yīng)面設(shè)計及結(jié)果見表4，回歸方程方差分析見表5。

利用 Design Expert 11 軟件，對中心組合實驗結(jié)果進行響應(yīng)面回歸分析，得到工程菌的ZHD101表達(dá)量對誘導(dǎo)時間(A)、誘導(dǎo)溫度(B)和誘導(dǎo)種齡(C) 的多元二次回歸方程：總灰度值=-28 088 300+ 2 235 630A+9 56 535B+9 127 290C-12 651.562 52AB+183 675AC-35 316.667 41BC-95 994.416 80A2-13 675.468 75B2-6 002 300C2。

表4 響應(yīng)面設(shè)計及結(jié)果Table 4 Response surface design and results

由表5 可知，本實驗的回歸模型P＜0.000 1，說明方程擬合度較好。同時，失擬項的P=0.468 0，說明失擬不顯著，殘差由隨機誤差引起，模型選擇正確；模型的決定系數(shù)R2=0.993 0，調(diào)整后調(diào)整性決定系數(shù)AdjR2=0.984 0，表明方程與實測值擬合度較高，足以反映出ZHD101的表達(dá)量與發(fā)酵條件誘導(dǎo)時間、誘導(dǎo)溫度和誘導(dǎo)種齡的關(guān)系，說明方程模型可信度較高。

誘導(dǎo)時間和誘導(dǎo)溫度對重組菌表達(dá)玉米赤霉烯酮水解酶ZHD101opt影響的交互作用最為顯著，Design- Expert 11 軟件預(yù)測重組菌發(fā)酵最佳條件為：誘導(dǎo)時間8.658 h，誘導(dǎo)溫度30.109 ℃，誘導(dǎo)種齡0.998，理論總灰度值能達(dá)8 335 575.112。在驗證預(yù) 測值時，將發(fā)酵最佳條件稍作調(diào)整為：誘導(dǎo)時間8.5 h， 誘導(dǎo)溫度30.0 ℃，誘導(dǎo)種齡1.0，共進行3 次平行試驗，通過SDS-PAGE 檢測，以總灰度值大小作為產(chǎn)酶量的比較，3 次實驗結(jié)果的總灰度值平均值為 9 334 666，是預(yù)測值的1.12 倍，結(jié)果表明模型預(yù)測是可用的。經(jīng)與優(yōu)化前的表達(dá)量進行對比發(fā)現(xiàn)， 表達(dá)量大幅度提升了約3 倍左右。

表5 回歸方程方差分析 Table 5 Analysis of variance for the regression equation

2.4 玉米赤霉烯酮水解酶ZHD101 活性的測定及在玉米漿中的應(yīng)用

在玉米深加工過程中，富含水溶性蛋白質(zhì)的玉米浸泡液等副產(chǎn)物經(jīng)濃縮后為玉米漿副產(chǎn)物。玉米漿可以作為發(fā)酵工業(yè)的營養(yǎng)基源；可替代飼料中的部分蛋白質(zhì)原料；還可作為植物蛋白調(diào)味液而被用在食品生產(chǎn)等多種領(lǐng)域。然而由于玉米身受玉米赤霉烯酮毒素的困擾，使得相關(guān)產(chǎn)品的安全性受到越來越多關(guān)注。

先以ZEN 標(biāo)準(zhǔn)品為底物測定玉米赤霉烯酮水解酶ZHD101 的活性，在37 ℃ 反應(yīng)2 h 可降解（5.5±1.1）μg/mL ZEN，酶 活 為0.05 U/mL。玉米漿pH 為3.5，而pH 低于4.5 可使玉米赤霉烯酮水解酶ZHD101 不可逆失活［10］。因此進行脫毒應(yīng)用時，將玉米漿的pH 調(diào)至8.0 左右。如圖3 所示，脫毒率隨著酶解時間的延長而提高，在1、2 和3 h的脫毒率分別為（6.2±1.5）%、（13.4±2.8）%和（17.1±8.0）%，其中處理1 h 和處理2 h 的脫毒率之間差異極顯著，處理1 h 和處理3 h 的脫毒率之間差異顯著，而處理2 h 和處理3 h 的脫毒率之間不存在差異。該酶對玉米漿中ZEN 的降解效果不及對ZEN 標(biāo)準(zhǔn)品的降解效果，推測很可能由于酶液濃度及玉米漿復(fù)雜的成分所致，如大量的硫酸鹽存在使得玉米赤霉烯酮水解酶ZHD101 活性受到抑制，相應(yīng)后續(xù)試驗還需繼續(xù)開展。

圖3 不同酶解時間的玉米漿脫毒率Fig. 3 Detoxification rate of corn steep liquor with different enzymatic hydrolysis time

3 討論

本研究參照大腸桿菌密碼子偏好性對ZHD101酶原有堿基序列進行分析，發(fā)現(xiàn)ZHD101基因在同義密碼子的使用偏好性上與大腸桿菌有較大差異，ZHD101wt基因序列中含有大腸桿菌稀有密碼子27個，并且有4 處出現(xiàn)連續(xù)稀有密碼子，稀有密碼子和連續(xù)稀有密碼子的存在會降低翻譯效率，甚至使翻譯終止。ZHD101基因在優(yōu)化后，稀有密碼子盡數(shù)被相應(yīng)的同義密碼子替換，連續(xù)稀有密碼子消失，其CAI值由0.64 提高至0.97。利用宿主的密碼子偏好性對目的基因進行優(yōu)化以提高異源蛋白的表達(dá)量是目前得到了人們廣泛認(rèn)可的方法，但也有研究表明，對目的基因密碼子優(yōu)化后，基因表達(dá)量沒有提高甚至使蛋白的含量降低［16,17］。田健等［18］利用大數(shù)據(jù)對大腸桿菌中的基因進行了統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌中的高表達(dá)的基因并不是完全使用高頻密碼子進行表達(dá)，而是以1 種前段序列使用低頻密碼子，下游使用高頻密碼子，即外源基因采用高頻密碼子和低頻密碼子交錯使用的方式來實現(xiàn)高效表達(dá)。除此之外，基因表達(dá)效率受多種因素的影 響［19］。因此，要在分子改造策略上實現(xiàn)玉米赤酶烯酮ZHD101基因高效表達(dá)，后續(xù)研究中仍需要進行系統(tǒng)全面的分子優(yōu)化措施。

重組菌發(fā)酵條件也可顯著影響重組蛋白的表達(dá)產(chǎn)量，如宿主外源基因的表達(dá)往往受到誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)時間、誘導(dǎo)劑濃度、pH 值、接菌量和誘導(dǎo)種齡等因素的影響，并且往往是這些因素的疊加。如誘導(dǎo)溫度和誘導(dǎo)時間之間存在著交互作用，低溫誘導(dǎo)可以避免重組蛋白形成包涵體，誘導(dǎo)溫度過低則需要較長的誘導(dǎo)時間，而長時間的誘導(dǎo)可令重組蛋白降解且時間成本較高［20-22］。Garcia-Fraga 等［23］的研究發(fā)現(xiàn)較低的IPTG 濃度誘導(dǎo)可以獲得最高酶活性，而極低或極高的IPTG 誘導(dǎo)劑濃度可以降低酶的活性。培養(yǎng)基pH 值主要影響宿主大腸桿菌的生長速度，而在誘導(dǎo)過程中，pH 值對轉(zhuǎn)錄效率和包涵體的形成有影響［24-25］。總之，多種條件影響著重組蛋白的表達(dá)，并且某些條件之間還存在著交互作用。響應(yīng)面法可以在試驗次數(shù)較低的情況下確定各獨立因子對1 個響應(yīng)因子的最佳影響，并且可以解釋不同因子之間的相互作用，采用響應(yīng)面方法在優(yōu)化重要條件提高大腸桿菌中重組蛋白產(chǎn)量已取得較好效果［14-15］。本研究通過Plackett-Burman 設(shè)計對影響玉米赤霉烯酮降解酶ZHD101 產(chǎn)量的相關(guān)因素進行評價和篩選，發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)溫度、pH、接種量是影響ZHD101 表達(dá)量的3 個顯著因素，然后采用響應(yīng)面分析法確定最優(yōu)產(chǎn)酶發(fā)酵條件：誘導(dǎo)時間8.5 h， 誘導(dǎo)溫度30.0 ℃，誘導(dǎo)種齡1.0，表達(dá)量提高了300%。

2016 年Xiang 等［13］首 次 定 義 了ZHD101 的酶活力單位，即每分鐘降解1 μg/mL ZEN 所需要的酶量作為1 個酶活單位U。在此之前，玉米赤霉烯酮水解酶ZHD101 的酶活性是以對添加在培養(yǎng)基中的某一濃度的ZEN 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的降解率來表征。同時Xiang 采用了密碼子優(yōu)化、增加外源基因拷貝數(shù)和高密度發(fā)酵表達(dá)的策略，使得ZHD101 在P.pastorisGS115 中高效表達(dá)，在甲醇誘導(dǎo)84 h 時，發(fā)酵上清酶活性最高可達(dá)150.1 U/mL，雖然，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于本研究中的大腸桿菌ZHD101 酶的表達(dá)量，但是大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)培養(yǎng)條件簡單、生產(chǎn)時間短和培養(yǎng)成本低廉等特點，使得ZHD101 酶在大腸桿菌系統(tǒng)中進行表達(dá)依然具有強大優(yōu)勢。本課題組會在后續(xù)的試驗過程中，進一步通過篩選啟動子、優(yōu)化基因結(jié)構(gòu)、表達(dá)質(zhì)粒及宿主等方面研究提高酶的表達(dá)量。

玉米赤霉烯酮毒素是1 種影響農(nóng)業(yè)經(jīng)濟的主要毒素，嚴(yán)重污染谷物衍生的食品和飼料。在濕法工藝生產(chǎn)玉米淀粉時，大部分玉米自身毒素滯留在玉米漿中。調(diào)查研究表明，玉米及其深加工產(chǎn)品受ZEN 的污染較為嚴(yán)重，如2017 年，周建川等［26］調(diào)查發(fā)現(xiàn)玉米和玉米副產(chǎn)物中 ZEN 的檢出率分別為 80.25%和88. 89%。為了提高玉米相關(guān)產(chǎn)品的安全性，我國頒布了相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)，如《GB 2761—2017食品中真菌毒素限量》要求谷物及其制品中玉米赤霉烯酮含量應(yīng)低于60 μg/kg，《GB13078—2017飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》要求飼料原料的玉米漿干粉中玉米赤霉烯酮含量不得超過1 500 μg/kg［27-28］。眾多的研究只是在產(chǎn)酶微生物的分離及酶學(xué)性質(zhì)挖掘等方面開展，而玉米赤霉烯酮降解酶表達(dá)量及應(yīng)用研究相對不足。Xiang 等［13］在麥芽汁的ZEN 脫毒研究中50 μL 的ZHD101 降解酶，用12 min 可將ZEN濃度為20 μg/mL 的麥芽汁降解90%。Bi 等［29］將ZEN 降解酶ZENC (800 U) 添加到干酒糟、玉米副產(chǎn)品和玉米麩皮(25 g)中，ZEN 的濃度分別降低了70.9%、88.9% 和94.7%。本研究涉及的羧酸酯酶具有較強的pH 值和溫度適應(yīng)性，最適反應(yīng) pH 值為8.0，最適反應(yīng)溫度為30 ℃。酶解過程具有時間依賴性，本研究將ZEN 降解酶ZHD101（粗酶液）應(yīng)用到玉米漿的ZEN 脫毒研究中，反應(yīng)1、2 和 3 h 對玉米漿中的ZEN（約25 μg/mL）分別降解了（6.2±1.5）%、（13.4±2.8）%和（17.1±8.0）%，這一應(yīng)用效果不及Xiang 等在麥芽汁應(yīng)用效果，可能是玉米漿富含多種物質(zhì)，如氨基酸、礦物質(zhì)（微量元素）、有機酸、還原糖和維生素等［30］，可能抑制ZEN 降解酶ZHD101 的活性。

本研究通過目的基因的密碼子優(yōu)化和基于Plackett-Burman 設(shè)計和響應(yīng)面分析法優(yōu)化發(fā)酵條件的策略，以最大程度提高大腸桿菌中玉米赤霉烯酮降解酶表達(dá)量，使酶的產(chǎn)量提高了3 倍左右，并且該酶在玉米漿中玉米赤霉烯酮降解應(yīng)用中有著巨大前景。