宏基因組二代測序技術(shù)對(duì)髖/膝關(guān)節(jié)結(jié)核的診斷價(jià)值

姚黎明 姚曉偉 董昭良 劉豐勝 王連波 賈晨光

關(guān)節(jié)感染性疾病是由特定病原微生物感染骨關(guān)節(jié)所致疾病的統(tǒng)稱。按照感染病原菌的種類可分為特異性感染[結(jié)核分枝桿菌(MTB)、布魯氏菌、梅毒螺旋體、真菌]及非特異性感染(金黃色葡萄球菌、鏈球菌、大腸埃希菌、克雷伯菌、鮑曼不動(dòng)桿菌、銅綠假單胞菌等)。近年來，隨著人口老齡化趨勢及易感人群免疫力下降，關(guān)節(jié)感染性疾病的發(fā)病率也在不斷增加，是造成肢體功能障礙和骨關(guān)節(jié)畸形的原因之一。但此類疾病的早期癥狀缺乏特異性，加之感染病灶病原菌傳統(tǒng)培養(yǎng)陽性率較低，難以獲得明確的病原學(xué)結(jié)果[1-2]，常被誤診為骨關(guān)節(jié)病及骨質(zhì)疏松而被忽略，導(dǎo)致其診斷困難、治療延遲。故早期準(zhǔn)確的病原學(xué)診斷與有效合理的治療措施尤為重要。

宏基因組二代測序技術(shù)(metagenomic next generation sequencing，mNGS)作為一種新興的病原微生物檢測手段，因其較傳統(tǒng)檢測方法具有快速、精準(zhǔn)等優(yōu)勢，已被廣泛應(yīng)用于臨床感染病原學(xué)診斷領(lǐng)域[3-4]。筆者回顧性分析mNGS在髖/膝關(guān)節(jié)感染性疾病診斷中的應(yīng)用情況，以探討mNGS對(duì)關(guān)節(jié)結(jié)核的診斷價(jià)值。

對(duì)象和方法

一、研究對(duì)象

1.一般資料：采用回顧性研究方法，收集2019年6月至2021年6月河北省胸科醫(yī)院收治的34例臨床確診為髖/膝關(guān)節(jié)感染患者的相關(guān)資料。其中，男性16例，女性18例；年齡范圍為8～76歲，平均年齡為(59.32±12.41)歲；左髖8例、右髖10例、左膝8例、右膝8例。主訴為髖關(guān)節(jié)或膝關(guān)節(jié)疼痛伴活動(dòng)受限，其中伴有發(fā)熱者12例。入院后常規(guī)檢查血紅細(xì)胞沉降率(erythrocyte sedimentation rate，ESR)范圍為 17～121 mm/1 h(參考值為0～15 mm/1 h)，平均為(66.65±22.00) mm/1 h；C反應(yīng)蛋白(C-reactive protein，CRP)范圍為10.18～113.94 mg/L(參考值為0～8 mg/L)，平均為(53.37±16.26) mg/L。根據(jù)病史、臨床特點(diǎn)、影像學(xué)表現(xiàn)、組織病理學(xué)和病原學(xué)檢查結(jié)果及抗結(jié)核治療效果進(jìn)行臨床綜合診斷，最終16例確診為關(guān)節(jié)結(jié)核，18例為非結(jié)核感染性疾病，具體見表1。本研究通過本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)[2019倫審(10號(hào))]，患者均簽署知情同意書。

表1 34例髖/膝關(guān)節(jié)感染性疾病患者臨床資料

2.納入標(biāo)準(zhǔn)：需同時(shí)滿足以下4條標(biāo)準(zhǔn)。(1)臨床存在髖/膝關(guān)節(jié)感染癥狀及體征；(2)血常規(guī)、ESR、CRP均異常，可伴有發(fā)熱癥狀；(3)收集足夠的關(guān)節(jié)液或滑膜組織進(jìn)行病原菌培養(yǎng)和mNGS檢測，且mNGS檢測出病原體，同時(shí)排除穿刺損傷引起的血液污染；(4)影像學(xué)表現(xiàn)支持髖/膝關(guān)節(jié)感染，且抗感染治療有效。

3.排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)經(jīng)臨床表現(xiàn)、實(shí)驗(yàn)室檢查，以及影像學(xué)、病原學(xué)和病理學(xué)檢查等綜合診斷排除髖/膝關(guān)節(jié)感染；(2)存在取材中標(biāo)本污染或可疑污染；(3)合并艾滋病等免疫系統(tǒng)或惡性腫瘤等影響檢測結(jié)果的疾病。

二、研究方法

1.普通細(xì)菌和分枝桿菌培養(yǎng)：所有患者均經(jīng)過彩色多普勒超聲或CT定位引導(dǎo)下穿刺或手術(shù)途徑獲取感染病灶核心部位的膿液、病變滑膜及肉芽組織樣本，分別對(duì)組織樣本進(jìn)行常規(guī)普通細(xì)菌和分枝桿菌培養(yǎng)。普通細(xì)菌采用VITEK-60全自動(dòng)細(xì)菌鑒定系統(tǒng)(法國生物梅里埃公司)進(jìn)行培養(yǎng)及菌株鑒定；分枝桿菌使用MGIT 960自動(dòng)MTB培養(yǎng)儀(美國BD公司)進(jìn)行培養(yǎng)及菌種鑒定。

2.MTB-DNA擴(kuò)增檢測：將標(biāo)本同時(shí)送分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室行GeneXpert MTB/RIF(簡稱“GeneXpert”)檢測(美國Cepheid公司)。根據(jù)應(yīng)用手冊，將各冰凍病灶標(biāo)本解凍后，分別取1 ml標(biāo)本沉淀物加入2 ml 樣本處理液，劇烈振蕩20次，室溫孵育10 min；再次振蕩，室溫孵育5 min，使用新的移液管將2 ml樣本加入試劑匣，將標(biāo)本置4通道GeneXpert平臺(tái)進(jìn)行自動(dòng)操作，約2 h后將樣品加入盒子，系統(tǒng)可自動(dòng)讀取測試結(jié)果和利福平耐藥結(jié)果。

3.mNGS檢測：主要包括以下步驟：(1)樣本處理和DNA提?。簩颖巨D(zhuǎn)移至含細(xì)胞裂解液、玻璃珠及氧化鋯珠的2 ml離心管中。將離心管置于渦旋混合器上，劇烈攪拌20 min。攪拌完成后將樣本轉(zhuǎn)移至新的離心管并提取DNA。(2)DNA文庫構(gòu)建和測序：將提取的樣本DNA經(jīng)超聲破碎為片段、末端修復(fù)、適配體連接和PCR擴(kuò)增后構(gòu)建DNA文庫，DNA文庫樣本質(zhì)控采用Agilent 2100生物分析儀和Qubit 2.0熒光計(jì)。隨即將通過質(zhì)控的雙鏈DNA文庫轉(zhuǎn)化為單鏈環(huán)狀DNA。再通過滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)生成DNA納米球(DNAnanoball, DNB)。采用Qubit 2.0熒光計(jì)對(duì)DNB進(jìn)行質(zhì)控。將合格的DNB加載至測序芯片上，然后通過高通量測序系統(tǒng)BGISEQ-50平臺(tái)進(jìn)行SE50bp測序，測序數(shù)據(jù)量為20 M reads。(3)生物信息分析：通過BWA測序分析軟件剔除高質(zhì)量數(shù)據(jù)中可比對(duì)到人參考基因組序列上的數(shù)據(jù)。經(jīng)過上述步驟篩選后的數(shù)據(jù)在去除低復(fù)雜度reads后再與專用的微生物大數(shù)據(jù)庫比對(duì)，并將比對(duì)后的數(shù)據(jù)按照病毒、細(xì)菌、真菌和寄生蟲等進(jìn)行分類和排列。微生物參考全基因組數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)全部來源于NCBI。根據(jù)序列數(shù)的高低及臨床其他檢測來判斷可能的病原體。

4.關(guān)節(jié)結(jié)核的臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)：以病原學(xué)、病理檢查結(jié)果作為關(guān)節(jié)結(jié)核確診依據(jù)，也可結(jié)合流行病學(xué)史、癥狀、體征、影像學(xué)及相關(guān)輔助檢查進(jìn)行綜合分析作出臨床診斷[5-7]。符合以下(1)～(6)條中至少4項(xiàng)，同時(shí)符合(7)和(8)條中至少1項(xiàng)，即可確診為關(guān)節(jié)結(jié)核。(1)單一關(guān)節(jié)腫痛、活動(dòng)受限且合并典型結(jié)核全身中毒癥狀；(2)影像學(xué)檢查DR顯示，鄰近關(guān)節(jié)骨量減少或骨質(zhì)疏松、關(guān)節(jié)邊緣骨侵蝕、關(guān)節(jié)間隙變窄；CT掃描顯示軟骨下死骨周圍無硬化及骨膜反應(yīng)；(3)ESR、CRP、白介素-6等炎性指標(biāo)明顯增高；(4)結(jié)核免疫指標(biāo)檢測：結(jié)核菌素皮膚試驗(yàn)強(qiáng)陽性、γ-干擾素釋放試驗(yàn)或結(jié)核抗體陽性；(5)系統(tǒng)抗結(jié)核治療有效；(6)MTB核酸檢測陽性；(7)MTB培養(yǎng)陽性；(8)穿刺活檢或手術(shù)獲取病灶組織為典型結(jié)核性肉芽腫。

5.關(guān)節(jié)非結(jié)核感染性疾病臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)：符合以下第(5)條，同時(shí)(1)～(4)條至少符合1項(xiàng)，即可診斷為關(guān)節(jié)非結(jié)核感染性疾病。(1)臨床表現(xiàn)和影像學(xué)檢查診斷關(guān)節(jié)感染性疾病，實(shí)驗(yàn)室檢查顯示白細(xì)胞計(jì)數(shù)、中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)、CRP、ESR升高；(2)血培養(yǎng)、病灶組織培養(yǎng)陽性；(3)mNGS檢測顯示陽性結(jié)果；(4)病理組織學(xué)檢查考慮感染性疾病表現(xiàn)，同時(shí)未提示MTB感染可能；(5)對(duì)可疑病原微生物針對(duì)性抗感染治療有效。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)數(shù)資料以“例(百分率，%)”描述，組間差異的比較采用卡方檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。以臨床診斷為參照標(biāo)準(zhǔn)，采用敏感度、特異度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值、Kappa值等指標(biāo)評(píng)估MGIT 960培養(yǎng)、MTB-DNA擴(kuò)增檢測和mNGS檢測在骨關(guān)節(jié)結(jié)核診斷中的效能。其中，Kappa值≥0.75表示一致性良好，0.4～0.74表示一致性尚可，<0.4表示一致性不佳。

結(jié) 果

一、髖/膝關(guān)節(jié)感染性疾病患者檢測結(jié)果

16例髖/膝關(guān)節(jié)結(jié)核患者中，mNGS累計(jì)檢出病原菌20例次。其中，檢出單一MTB 11例次(55.0%)，均為人型MTB；真菌1例次(5.0%)，為曲霉菌；同時(shí)有4例合并竇道的患者分別檢測出MTB和另一種病原體(分別為鮑曼不動(dòng)桿菌、溶血葡萄球菌、金黃色葡萄球菌和嗜麥芽窄食單胞菌各1例)，共計(jì)8例次(40.0%)；mNGS對(duì)MTB的檢出率為93.8%(15/16)，明顯高于MTB-DNA擴(kuò)增檢測[50.0%(8/16)]和MGIT 960培養(yǎng)[25.0%(4/16)]，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=7.575，P=0.015；χ2=15.676，P=0.000)。另外，觀察到的MTB菌屬的序列范圍為5～7×104序列數(shù)；其中序列數(shù)≤1×102有5例，1×102<序列數(shù)≤2×104有6例，2×104<序列數(shù)≤7×104有5例。

18例髖/膝關(guān)節(jié)非結(jié)核感染性疾病患者，累計(jì)檢出病原菌21例次(包括14個(gè)菌屬，分別為假單胞菌、黃單胞桿菌、腸球菌、葡萄球菌、鏈球菌、枸櫞酸桿菌、埃希菌、克雷伯菌、棒狀桿菌、擬桿菌、布魯氏菌、希瓦氏菌、鞘氨醇單胞菌、非結(jié)核分枝桿菌)；檢出頻次最高的為嗜麥芽窄食單胞菌(6例次)，其次為布魯氏菌(3例次)；其中，1例膝關(guān)節(jié)感染患者經(jīng)mNGS檢出膿腫分枝桿菌；11例患者為單一病原體感染[61.1%(11/18)]，7例患者同時(shí)檢測出2種及以上病原體[38.9%(7/18)]。觀察到的病原體序列范圍為1×102～8×104序列數(shù)，其中1×102<序列數(shù)≤2×104有15例，2×104<序列數(shù)≤8×104有3例。mNGS對(duì)病原體檢出率[100.0%(18/18)]明顯高于常規(guī)細(xì)菌培養(yǎng)[11.1%(2/18)]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=28.800，P=0.000)。

二、常規(guī)培養(yǎng)、MTB-DNA擴(kuò)增檢測和mNGS對(duì)關(guān)節(jié)結(jié)核的診斷效能

結(jié)果顯示，mNGS診斷關(guān)節(jié)結(jié)核的敏感度、陰性預(yù)測值和Kappa值均明顯高于常規(guī)培養(yǎng)和MTB-DNA擴(kuò)增，具體見表2。

表2 常規(guī)培養(yǎng)、MTB-DNA擴(kuò)增檢測和宏基因組二代測序?qū)顷P(guān)節(jié)結(jié)核的診斷效能

討 論

在關(guān)節(jié)結(jié)核診斷領(lǐng)域，目前實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)仍是關(guān)節(jié)感染病原菌檢測的常規(guī)方法，雖然培養(yǎng)技術(shù)在持續(xù)優(yōu)化，但由于關(guān)節(jié)結(jié)核標(biāo)本難以獲取、樣本含菌量低，仍存在培養(yǎng)陽性率不高、周期較長及診斷效率不高等不足。有研究顯示，關(guān)節(jié)液或病灶組織MTB的培養(yǎng)陽性率僅為20%～30%[6]，這使得臨床醫(yī)生常要面對(duì)疑似關(guān)節(jié)結(jié)核卻無法明確致病菌的困惑，不能早期施行準(zhǔn)確及時(shí)的診治。而MTB-DNA擴(kuò)增檢測具有敏感度和特異度均較高、可早期診斷MTB利福平耐藥等優(yōu)點(diǎn)，卻無法有效檢出合并細(xì)菌或真菌的混合感染。相比實(shí)驗(yàn)室細(xì)菌培養(yǎng)和MTB-DNA擴(kuò)增檢測，mNGS是通過高通量測序和自動(dòng)化生物信息分析進(jìn)行檢測，可在短時(shí)間內(nèi)將臨床樣本核酸序列與所有已知微生物基因組進(jìn)行比對(duì)，從而精準(zhǔn)診斷病原菌感染。作為應(yīng)用于感染性疾病病原學(xué)診斷領(lǐng)域的新型檢測技術(shù)，mNGS應(yīng)用于骨關(guān)節(jié)結(jié)核診斷的相關(guān)報(bào)道則較為少見。

mNGS檢測技術(shù)具有諸多優(yōu)勢：(1)可明顯提升MTB的陽性檢出率，對(duì)關(guān)節(jié)結(jié)核具有更好的診斷效能；同時(shí)，還可以有效甄別除外關(guān)節(jié)的非結(jié)核感染性疾病。本研究細(xì)菌培養(yǎng)和MTB-DNA擴(kuò)增檢測的敏感度分別為25.0%和50.0%，與國內(nèi)學(xué)者的研究結(jié)果接近[6，8]，且陰性預(yù)測值分別為60.0%和69.2%；而mNGS的敏感度(93.8%)和陰性預(yù)測值(94.7%)均明顯高于以上兩種檢測方法；此外，MTB-DNA擴(kuò)增檢測與臨床診斷一致性尚可(Kappa=0.515)，而mNGS與臨床診斷一致性良好(Kappa=0.942)，表明mNGS較MTB-DNA擴(kuò)增檢測診斷效能更好。(2)檢測時(shí)間迅速。mNGS平均約需48 h即可得到檢測結(jié)果[9-10]，明顯短于傳統(tǒng)細(xì)菌和MTB培養(yǎng)鑒定的周期(分別為5 d和45～60 d)[11-12]。(3)能檢測出某些少見甚至罕見及不易培養(yǎng)的細(xì)菌。本研究中有1例膝關(guān)節(jié)感染患者經(jīng)mNGS檢測確定為膿腫分枝桿菌，并在40 d后獲得手術(shù)病灶組織的非結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)陽性的證實(shí)，及時(shí)避免了被誤診誤治為關(guān)節(jié)結(jié)核的情況。國內(nèi)有學(xué)者也曾報(bào)道了mNGS在非結(jié)核分枝桿菌骨關(guān)節(jié)感染的病原學(xué)精準(zhǔn)診斷方面的優(yōu)勢[13]。(4)可檢出復(fù)雜混合感染的多種病原體。本研究有4例合并竇道的關(guān)節(jié)結(jié)核患者是通過mNGS檢測明確了混合感染中的多種病原菌，對(duì)臨床診斷、治療、患者預(yù)后起到了關(guān)鍵作用。

本研究結(jié)果還顯示，與非結(jié)核感染性疾病組相比較，確診為關(guān)節(jié)結(jié)核患者經(jīng)mNGS檢測出MTB的序列數(shù)據(jù)差異較大，變化范圍為5～7×104。其中有5例患者的序列數(shù)≤100，說明僅獲得了少量低于限值的MTB序列數(shù)，分析原因可能為：(1)關(guān)節(jié)結(jié)核病灶含菌量較低，MTB定植數(shù)是肺部的1/1000，從而導(dǎo)致病原體檢測陽性率低；(2)MTB屬于胞內(nèi)細(xì)菌且細(xì)胞壁較厚，在提取處理病變組織樣本時(shí)因難以破壁，導(dǎo)致其胞外核酸釋放量較少；(3)非嚴(yán)格的低溫運(yùn)輸條件，也可能加速核酸降解。有學(xué)者研究認(rèn)為，當(dāng)MTB為明確致病菌時(shí)，發(fā)生環(huán)境污染的可能性小，故mNGS只要檢測到1條屬水平的結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群序列，在排除其他標(biāo)本攜帶污染后即具有臨床意義[14]。因此，雖然在髖/膝關(guān)節(jié)感染性疾病的mNGS檢測報(bào)告中，MTB的序列數(shù)常低于化膿菌，甚至低于常規(guī)閾值，但仍認(rèn)為有診斷與治療的臨床意義。

另外，mNGS檢測雖然對(duì)診斷關(guān)節(jié)感染性疾病具有諸多優(yōu)勢，但還需注意到目前臨床應(yīng)用中的諸多困惑：(1)1次檢測可匹配到細(xì)菌、病毒、支原體、真菌等多種微生物的序列，這在本研究結(jié)果中也有所體現(xiàn)，但應(yīng)注意檢測結(jié)果會(huì)受到人源性細(xì)胞、定植和污染背景微生物的干擾，推薦在層流手術(shù)室采集關(guān)節(jié)感染病灶標(biāo)本，并在采集后立即放置在無菌容器內(nèi)以盡量縮短與空氣環(huán)境接觸的時(shí)間；(2)測序數(shù)據(jù)量和生物信息分析缺乏標(biāo)準(zhǔn)化，測序過程和結(jié)果仍缺乏質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)[15-16]，且標(biāo)本前處理操作繁雜，涉及多次轉(zhuǎn)管和移液操作，容易出現(xiàn)操作失誤和樣本污染；(3)檢測花費(fèi)較高，外送檢測周轉(zhuǎn)時(shí)間較長，故建議mNGS適用于慢性反復(fù)發(fā)作、疑難復(fù)雜的骨關(guān)節(jié)感染患者?；谝陨锨闆r，筆者認(rèn)為需根據(jù)檢測的微生物種類、序列數(shù)目，參考感染部位的背景微生物庫，結(jié)合患者的臨床特征和感染相關(guān)的實(shí)驗(yàn)室結(jié)果來綜合判讀mNGS檢測報(bào)告：(1)檢出明確的致病菌，如MTB、曲霉菌等，因這類菌發(fā)生環(huán)境污染的概率較小，即使序列數(shù)較低，也要考慮可能為致病性病原體；(2)檢出易于引起局灶膿腫或軟組織感染的化膿菌，如葡萄球菌、鏈球菌、銅綠假單胞菌等，當(dāng)其序列數(shù)較高且在報(bào)告檢出的病原體排名居第1～2位，可認(rèn)為有臨床意義；(3)檢出非結(jié)核分枝桿菌，需要結(jié)合序列數(shù)、臨床及影像學(xué)表現(xiàn)、組織病理檢查，以及非結(jié)核分枝桿菌菌種培養(yǎng)鑒定和分子生物學(xué)診斷方法來進(jìn)一步明確診斷。本研究受限于單中心、樣本量較少等，可能會(huì)影響結(jié)果的可靠性，未來有待進(jìn)一步積累樣本量、聯(lián)合多中心開展深入研究。

綜上所述，mNGS可有效檢出髖/膝關(guān)節(jié)感染性疾病病原體，對(duì)關(guān)節(jié)結(jié)核具有更好的診斷效能，可提供重要的臨床指導(dǎo)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻(xiàn)姚黎明：醞釀和設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)、采集/分析/解釋數(shù)據(jù)、起草文章；姚曉偉、董昭良和王連波：采集/分析/解釋數(shù)據(jù)；劉豐勝：醞釀和設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)、采集/分析/解釋數(shù)據(jù)；賈晨光：醞釀和設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)、分析/解釋數(shù)據(jù)、對(duì)文章的知識(shí)性內(nèi)容作批評(píng)性審閱和指導(dǎo)