來(lái)源于生孢噬纖維菌的新型β-葡萄糖苷酶SmBgl3A 的性質(zhì)研究

費(fèi)嵩禹，王梓懿，荊曉鳳，楊 帆，陳曉藝，李憲臻

（大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院，遼寧 大連 116034）

β-葡萄糖苷酶（β-glucosidase，EC3.2.1.21），又稱(chēng)β-葡萄糖苷水解酶，是一種用于改善食品風(fēng)味或生產(chǎn)活性單體成分的重要酶制劑，廣泛應(yīng)用于食品、藥品、保健品等領(lǐng)域[1]。近年來(lái)，有關(guān)β-葡萄糖苷酶在食品加工領(lǐng)域的應(yīng)用備受關(guān)注，有研究表明，β-葡萄糖苷酶是水解芳香前體物質(zhì)，釋放結(jié)合態(tài)糖苷配基的關(guān)鍵性酶，能夠改善茶葉、果汁、果酒、面包等食品的風(fēng)味，提升食品品質(zhì)[2]。周小玲等研究發(fā)現(xiàn)，可利用β-葡萄糖苷酶輔助提取茶葉中的天然產(chǎn)物[3]；劉芳舒等研究發(fā)現(xiàn)，β-葡萄糖苷酶酶解增香能在較大程度上還原刺梨汁的天然香氣[4]；孫愛(ài)東等研究發(fā)現(xiàn)，用β-葡萄糖苷酶處理各類(lèi)葡萄酒，能夠使其香氣更加飽和，感官品質(zhì)明顯提高[5]；錢(qián)超等研究發(fā)現(xiàn)，添加高產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的乳酸菌發(fā)酵葡萄汁酸面團(tuán)，能夠明顯改善面包風(fēng)味[6]。此外，β-葡萄糖苷酶能夠在纖維素的降解過(guò)程中解除纖維二糖對(duì)內(nèi)切葡聚糖苷酶和外切葡聚糖苷酶的產(chǎn)物抑制，能夠水解結(jié)合于非還原性末端的β-葡萄糖苷鍵，同時(shí)釋放出葡萄糖和相應(yīng)的配基。β-葡萄糖苷酶主要作用于β-1，4 糖苷鍵，此外還可以作用于β-（1，1）、（1，2）、（1，3）、（1，6）糖苷鍵[7]。依據(jù)氨基酸序列的同源性和結(jié)構(gòu)的相似性，已知的β-葡萄糖苷酶被歸為GH1、GH3、GH5、GH9、GH30 和GH116 等6 個(gè)家族中[7-10]。近年來(lái)，關(guān)于微生物來(lái)源β-葡萄糖苷酶的報(bào)道日益增多。相比于真菌，一些細(xì)菌來(lái)源的β-葡萄糖苷酶熱穩(wěn)定性更強(qiáng)，但是產(chǎn)量較低。針對(duì)這些問(wèn)題，研究者利用基因工程等手段，異源表達(dá)性能優(yōu)越的β-葡萄糖苷酶，以提高其產(chǎn)量[11]。

生孢噬纖維菌是土壤中常見(jiàn)的好氧性纖維素分解細(xì)菌，對(duì)纖維素的降解能力十分強(qiáng)大。然而，由于生孢噬纖維菌不易分離純化，研究難度較大，關(guān)于生孢噬纖維菌的纖維素降解機(jī)制尚不明確[12]。部分研究人員對(duì)生孢噬纖維菌中纖維素酶的特性進(jìn)行了研究，Osmundsvag 等從生孢噬纖維菌的發(fā)酵液上清液中檢測(cè)到內(nèi)切葡聚糖酶的酶活力[13]，劉東波等對(duì)生孢噬纖維菌Sporocytophaga sp.JL-01 的纖維素酶進(jìn)行了定位研究[14]。β-葡萄糖苷酶在生孢噬纖維菌降解纖維素的過(guò)程中起著十分重要的作用，但至今還未有關(guān)于生孢噬纖維菌中β-葡萄糖苷酶的報(bào)道。

為了獲得酶學(xué)性質(zhì)優(yōu)良的新型β-葡萄糖苷酶，作者首次從生孢噬纖維菌Sporocytophaga sp.CX11的基因組中篩選出在降解纖維二糖過(guò)程中可能發(fā)揮關(guān)鍵作用的β-葡萄糖苷酶基因（SmBgl3A），將該基因克隆，在大腸桿菌中進(jìn)行異源表達(dá)，并對(duì)其酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了研究，為進(jìn)一步擴(kuò)展β-葡萄糖苷酶的種類(lèi)，及對(duì)其功能及應(yīng)用的探索奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株和質(zhì)粒載體 Sporocytophaga sp.CX11：作者所在實(shí)驗(yàn)室分離保存；大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α、大腸桿菌 BL21（DE3）、質(zhì)粒pET-28a（+）：中國(guó)科學(xué)院大連物理化學(xué)研究所趙宗保研究員課題組惠贈(zèng)。

1.1.2 主要試劑 Primer STAR HS DNA Polymerase、DNA Marker、Protein Molecular Weight Marker、PrimeScriptTMRT Reagent Kit（Perfect Real Time）、Dpn I、Pst I、Sma I、rTaq DNA 聚合酶等：大連寶日醫(yī)生物股份有限公司產(chǎn)品；SanProp 柱式DNA膠回收試劑盒、SanProp 柱式質(zhì)粒DNA 小量抽提試劑盒、考馬斯亮藍(lán)G250、羧甲基纖維素鈉（CMCNa）、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）等：生工生物工程股份有限公司產(chǎn)品；對(duì)硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷（pNPG）：北京索萊寶科技有限公司產(chǎn)品；胰蛋白胨、酵母浸粉：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司產(chǎn)品；RNA 提取試劑盒：艾科瑞生物公司產(chǎn)品。

1.1.3 培養(yǎng)基 Sporocytophaga sp.CX11 培養(yǎng)基（g/L）：NaNO30.5，MgSO4·H2O 0.5，KCl 0.5，K2HPO41，F(xiàn)eSO40.01，葡萄糖（或纖維二糖）5。

LB 培養(yǎng)基（g/L）：酵母浸粉5，胰蛋白胨10，NaCl 10。

LLB（低鹽LB）發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：酵母浸粉5，胰蛋白胨10，NaCl 5。

1.2 主要儀器

梯度PCR 儀、高速冷凍臺(tái)式離心機(jī)、電擊轉(zhuǎn)化儀：德國(guó)Eppendorf 公司產(chǎn)品；LAS4000、AKTA 蛋白質(zhì)純化系統(tǒng)：美國(guó)GE Healthcare 公司產(chǎn)品；超濾裝置：美國(guó)Millipore 公司產(chǎn)品；超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)：寧波新芝生物科技股份有限公司產(chǎn)品；安捷倫電泳分析儀：美國(guó)安捷倫科技有限公司產(chǎn)品；酶標(biāo)儀：美谷分子儀器（上海）有限公司產(chǎn)品；三層恒溫?fù)u床：伊孚森生物科技（中國(guó)）有限公司產(chǎn)品；電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司產(chǎn)品；ICS-5000 離子色譜儀：美國(guó)賽默飛世爾科技公司產(chǎn)品；LightCycler480Ⅱ?qū)崟r(shí)熒光定量PCR 儀：瑞士Roche公司產(chǎn)品。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 生孢噬纖維菌總 RNA 的提取 將Sporocytophaga sp.CX11 接種至10 mL 葡萄糖或纖維二糖液體培養(yǎng)基中，30 ℃、200 r/min 培養(yǎng)36 h 制備種子液。種子液以體積比1∶50 接種量分別接種至以葡萄糖或纖維二糖為碳源的液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中前期。收集菌體，用無(wú)菌水反復(fù)洗滌，重懸至OD600為1.0，液氮速凍于-80 ℃保存?zhèn)溆谩２捎肧teadyPure 通用型RNA 提取試劑盒對(duì)生孢噬纖維菌Sporocytophaga sp.CX11 總RNA 進(jìn)行提取，操作方法參照試劑盒說(shuō)明書(shū)。

1.3.2 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng) 利用PrimeScriptTMRT Reagent Kit（Perfect Real Time）對(duì)所獲得RNA 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。反轉(zhuǎn)錄體系包括200 ng RNA，1 μL PrimeScript Enzyme Mix，4 μL 5 ×PrimeScript Buffer，1 μL Random 6 Mers，1 μL Oligo dT Primer，用無(wú)RNase的水補(bǔ)充至20 μL，在PCR 儀中37 ℃反應(yīng)15 min，85 ℃反應(yīng)5 s。

1.3.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 應(yīng)用LightCycler480Ⅱ?qū)崟r(shí)熒光定量PCR 儀，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR 實(shí)驗(yàn)。體系包括10 μL TB Green Premix Ex TaqGC（2×），0.4 μL PCR Forward Primer（10 μmol/L），0.4 μL PCR Reverse Primer（10 μmol/L），100 ng Template 以及0.4 μL 滅菌水。經(jīng)過(guò)擴(kuò)增反應(yīng)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光信號(hào)的收集，根據(jù)Ct 值分析計(jì)算不同基因的相對(duì)表達(dá)量。所用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 引物如表1所示。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 引物Table 1 Primers for real-time quantitative PCR

1.3.4 β-葡萄糖苷酶SmBgl3A 蛋白質(zhì)序列分析通 過(guò)EMBL-EBI（https：//www.ebi.ac.uk/about）對(duì)SmBgl3A 進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)。利用SWISS-MODEL（https：//swissmodel.expasy.org/）進(jìn)行同源建模，模擬SmBgl3A 的三級(jí)結(jié)構(gòu)。利用NCBI BLAST（https：//novopro.cn/blast/blastp.html）進(jìn)行序列同源性比對(duì)。用 Clustal Omega（https：//www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/）進(jìn)行多重序列比對(duì)，并利用ESpript 服務(wù)器（http：//espript.ibcp.fr/ESPript/cgi-bin/ESPript.cgi）進(jìn)行多序列比對(duì)結(jié)果輸出。

1.3.5 β-葡萄糖苷酶基因SmBgl3A 的克隆和表達(dá)載體構(gòu)建 根據(jù)生孢噬纖維菌Sporocytophaga sp.CX11 基因組中β-葡萄糖苷酶SmBgl3A 的基因和表達(dá)載體pET-28a（+）的多克隆位點(diǎn)，設(shè)計(jì)上游引物SmBgl3A-F（CAGCAAATGGGTCGCGGATCCCAAAA TCAGGATCAAAAGATTG）及下游引物SmBgl3A-R（GTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGCTATTTAAACGAA ATGATCACC）。以基因組DNA 為模板，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，循環(huán)30 次；最后72 ℃延伸10 min。由此得到目的片段，以擴(kuò)增出來(lái)的β-葡萄糖苷酶目的片段為引物，利用RF-clone（restriction-free clone）技術(shù)將目的片段克隆至pET-28a（+）載體上。隨后用1.5 μL 的限制性?xún)?nèi)切酶Dpn Ⅰ消化模板，37 ℃反應(yīng)10 h 以上，得到構(gòu)建成功的質(zhì)粒。將構(gòu)建成功的質(zhì)粒電擊轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細(xì)胞中，挑取陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，酶切驗(yàn)證正確后送測(cè)序，測(cè)序結(jié)果比對(duì)正確即重組質(zhì)粒鑒定正確。

1.3.6 重組β-葡萄糖苷酶SmBgl3A 在大腸桿菌中表達(dá) 將鑒定正確的重組質(zhì)粒熱激轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞中，挑取陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子送公司測(cè)序，將測(cè)序正確的轉(zhuǎn)化子接種至LB 培養(yǎng)基（含終質(zhì)量濃度30 μg/mL 的卡納霉素），37 ℃、200 r/min過(guò)夜培養(yǎng)。將種子液以2%（體積分?jǐn)?shù)）接種量接入LLB 發(fā)酵培養(yǎng)基，37 ℃、200 r/min 培養(yǎng)至OD600為0.6，加入終濃度為1 mmol/L 的IPTG，16 ℃過(guò)夜誘導(dǎo)16 h。

1.3.7 重組β-葡萄糖苷酶SmBgl3A 的純化 重組大腸桿菌誘導(dǎo)過(guò)夜后，收集菌體。用pH 8.0 的緩沖液重懸菌體，混合均勻后用高壓勻漿破碎。于4 ℃條件下，10 000 g 離心20 min，上清液即為粗酶液，利用Ni-NTA 親和層析進(jìn)行純化。

純化采用AKTA 蛋白質(zhì)純化系統(tǒng)，用5 倍柱體積的結(jié)合緩沖液（0 mmol/L 咪唑、500 mmol/L NaCl、50 mmol/L NaH2PO4·2H2O，pH 8.0）平衡系統(tǒng)（2 mL/min）。依次用5 倍柱體積的結(jié)合緩沖液、清洗緩沖液（30 mmol/L 咪 唑、500 mmol/L NaCl、50 mmol/L NaH2PO4·2H2O，pH 8.0）及洗脫緩沖液（250 mmol/L咪唑、500 mmol/L NaCl、50 mmol/L NaH2PO4·2H2O，pH 8.0）洗脫蛋白質(zhì)，收集洗脫液。分別對(duì)粗酶液及洗脫液進(jìn)行SDS-PAGE 檢測(cè)。利用Bradford 法測(cè)定蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度。

1.3.8 重組β-葡萄糖苷酶SmBgl3A 的酶活力測(cè)定以對(duì)硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷（pNPG）為底物測(cè)定SmBgl3A 的酶活力，反應(yīng)體系包括250 μL 1.25 mmol/L pNPG 和250 μL酶液，35 ℃反 應(yīng)30 min 后，加入1 mL 1 mol/L Na2CO3終止反應(yīng)，在405 nm 處檢測(cè)吸光度，以滅活蛋白質(zhì)作空白對(duì)照，每組設(shè)置3 個(gè)平行樣。

酶活力單位定義：在pH 6.5、35 ℃條件下，每分鐘水解pNPG 釋放出1 μmol pNP 所需要的酶量為1 U。

以纖維二糖為底物測(cè)定SmBgl3A 的酶活力，反應(yīng)體系包括250 μL 1 g/dL 纖維二糖和250 μL 酶液，35 ℃反應(yīng)30 min 后，沸水浴10 min 終止反應(yīng)。10 000 g 離心5 min，取上清液，利用離子色譜法測(cè)定葡萄糖的生成量，離子色譜條件為：進(jìn)樣量為10 μL，流動(dòng)相流量為0.4 mL/min，用體積分?jǐn)?shù)98%的200 mmol/L NaOH 洗脫，分析柱及保護(hù)柱溫度為30 ℃。以滅活蛋白質(zhì)作空白對(duì)照，每組設(shè)置3 個(gè)平行樣。

酶活力單位定義：在pH 6.5、35 ℃條件下，每分鐘水解纖維二糖釋放出1 μmol 葡萄糖所需要的酶量為1 U。

以其他底物測(cè)定SmBgl3A 的酶活力，反應(yīng)體系包括250 μL 1 g/dL 的底物和250 μL 酶液，35 ℃反應(yīng)30 min 后，沸水浴10 min 終止反應(yīng)。10 000 g 離心5 min，取150 μL 上清液與200 μL 的DNS 試劑混合，煮沸5 min，冷卻后向其中加入900 μL 的蒸餾水，在540 nm 處檢測(cè)吸光度。以滅活蛋白質(zhì)作空白對(duì)照，每組設(shè)置3 個(gè)平行樣。

酶活力單位定義：在pH 6.5、35 ℃條件下，每分鐘水解底物釋放出1 μmol 還原糖所需要的酶量為1 U。

1.3.9 重組β-葡萄糖苷酶SmBgl3A 酶學(xué)性質(zhì)表征

1）SmBgl3A 最適反應(yīng)溫度和熱穩(wěn)定性的測(cè)定在25～80 ℃，每隔5 ℃作為一個(gè)測(cè)量點(diǎn)，于50 mmol/L 磷酸鹽緩沖溶液（pH 6.5）中，測(cè)定酶活力。以最大值為100%，分別計(jì)算不同溫度下的相對(duì)酶活力，以此確定SmBgl3A 的最適反應(yīng)溫度。

將SmBgl3A 酶蛋白分別在25～80 ℃條件下（每隔5 ℃作為一個(gè)測(cè)量點(diǎn)）孵育2 h，在最適條件下測(cè)定殘余酶活力。以未經(jīng)處理的酶液為對(duì)照，計(jì)算殘余酶活力占對(duì)照酶活力的百分比（相對(duì)酶活力），以此測(cè)定SmBgl3A 的熱穩(wěn)定性。

2）SmBgl3A 最適反應(yīng)pH 和pH 穩(wěn)定性的測(cè)定分別用不同pH 的緩沖液稀釋酶液，在最適溫度下反應(yīng)30 min，測(cè)定酶活力。以最大值為100%，分別計(jì)算不同pH 條件下的相對(duì)酶活力，以此測(cè)定最適反應(yīng)pH。緩沖體系包括：檸檬酸-檸檬酸鈉體系（pH 4.0～6.0），NaH2PO4-Na2HPO4體系（pH 6.0～8.0）；NaH2PO4-K2HPO4體系（pH 8.0～9.0）。

將SmBgl3A 酶蛋白分別在不同pH 的緩沖液中孵育2 h，然后在最適條件下測(cè)定殘余酶活力。以未經(jīng)處理的酶液為對(duì)照，計(jì)算殘余酶活力占對(duì)照酶活力的百分比（相對(duì)酶活力），以此測(cè)定SmBgl3A 的pH 穩(wěn)定性。

3）SmBgl3A 的底物特異性測(cè)定 分別以1.25 mmol/L 芳香基糖苷（對(duì)硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷（pNPG）、4-硝基苯基-β-D-吡喃木糖苷（pNPX）、4-硝基苯基-β-D-纖維二糖苷（pNPC）、4-硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷（pNP（α）G））、終質(zhì)量濃度為1 g/dL 的二糖（纖維二糖、乳糖、蔗糖、麥芽糖）及多糖（微晶纖維素avicel、普魯蘭糖、木聚糖、殼寡糖、幾丁質(zhì)、黃原膠）、濾紙、CMC-Na、水楊苷為底物，在35 ℃、pH 6.5 的條件下反應(yīng)，測(cè)定產(chǎn)物生成量，參照1.3.8 的方法，計(jì)算酶的比活力。

4）SmBgl3A 的NaCl 耐受性測(cè)定 在酶反應(yīng)體系中分別添加終濃度為0～2 500 mmol/L 的NaCl 溶液。參照1.3.8 所述方法測(cè)定殘余酶活力，將不添加NaCl 的酶活力設(shè)置為100%，計(jì)算殘余酶活力占對(duì)照酶活力的百分比（相對(duì)酶活力）。

5）金屬離子對(duì)SmBgl3A 酶活力的影響 在酶反應(yīng)體系中分別加入終濃度為10 mmol/L 的Mg2+、Li+、Mn2+、Na+、Fe2+、K+、Ca2+、Zn2+、Cu2+、Fe3+等金屬離子鹽溶液及EDTA，以未添加金屬離子溶液的酶活力為100%，測(cè)定金屬離子對(duì)SmBgl3A 酶活力的影響。

6）SmBgl3A 的葡萄糖耐受性測(cè)定 在酶反應(yīng)體系中分別添加終濃度為0～2 000 mmol/L 的葡萄糖溶液。參照1.3.8 所述方法測(cè)定殘余酶活力，將不添加葡萄糖組的酶活力設(shè)置為100%，計(jì)算殘余酶活力占對(duì)照酶活力的百分比（相對(duì)酶活力）。

7）SmBgl3A 的酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)測(cè)定 以pNPG 為底物，測(cè)定SmBgl3A 的酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)。250 μL 酶液分別與等體積終濃度為0.1～5.0 mmol/L 的pNPG 溶液混合，測(cè)定反應(yīng)初速度，確定反應(yīng)時(shí)間，計(jì)算不同底物濃度下的反應(yīng)速度，采用雙倒數(shù)作圖法，以1/[S]為橫坐標(biāo)，1/V 為縱坐標(biāo)，計(jì)算動(dòng)力學(xué)參數(shù)。

以纖維二糖為底物，測(cè)定SmBgl3A 的酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)。250 μL 酶液分別與等體積終濃度為0.5～50.0 mmol/L 的纖維二糖溶液混合，測(cè)定反應(yīng)初速度，確定反應(yīng)時(shí)間，計(jì)算不同底物濃度下的反應(yīng)速度，采用雙倒數(shù)作圖法，以1/[S]為橫坐標(biāo)，1/V 為縱坐標(biāo)，計(jì)算動(dòng)力學(xué)參數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 生孢噬纖維菌Sporocytophaga sp.CX11 中不同β-葡萄糖苷酶基因的表達(dá)水平分析

通過(guò)基因注釋以及NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)分析，在生孢噬纖維菌Sporocytophaga sp.CX11 基因組中共挖掘到7 個(gè)β-葡萄糖苷酶基因。其中，所對(duì)應(yīng)的蛋白酶SmBgl1A 為GH1 家族的糖苷水解酶，SmBgl3A、SmBgl3B、SmBgl3C、SmBgl3D、SmBgl3E 以及SmBgl3F 均為GH3 家族的糖苷水解酶。為了從中篩選出在降解纖維二糖過(guò)程中起關(guān)鍵作用的β-葡萄糖苷酶，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 技術(shù)對(duì)上述編碼基因在不同碳源培養(yǎng)條件下的相對(duì)表達(dá)水平進(jìn)行了分析。結(jié)果如圖1 所示，7 個(gè)β-葡萄糖苷酶基因在以纖維二糖為碳源的培養(yǎng)基中的表達(dá)水平均高于以葡萄糖為碳源的培養(yǎng)基中的表達(dá)水平，其中SmBgl3A 在以纖維二糖為碳源的培養(yǎng)基中的表達(dá)水平是在以葡萄糖為碳源的培養(yǎng)基中表達(dá)水平的18 倍，上調(diào)最為顯著。且SmBgl3A 的表達(dá)量相對(duì)較高，推測(cè)其可能在生孢噬纖維菌Sporocytophaga sp.CX11 降解纖維二糖的過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，解除纖維二糖對(duì)內(nèi)切纖維素酶及外切纖維素酶的產(chǎn)物抑制作用，提高Sporocytophaga sp.CX11 菌株降解纖維素的效率。

圖1 生孢噬纖維菌Sporocytophaga sp.CX11 β-葡萄糖苷酶基因在不同碳源條件下的相對(duì)表達(dá)量Fig.1 Relative expression level of β-glucosidase genes from Sporocytophaga sp.CX11 in different carbon sources

2.2 新型β-葡萄糖苷酶SmBgl3A 的序列分析

SmBgl3A（NCBI 登錄號(hào)No.OL653716）編碼的蛋白質(zhì)由760 個(gè)氨基酸組成，該蛋白質(zhì)由信號(hào)肽、GH3 催化結(jié)構(gòu)域及Fibronectin type Ⅲ-like domain（FnⅢ）結(jié)構(gòu)域組成。其中，GH3 催化結(jié)構(gòu)域主要由22 個(gè)α-螺旋和17 個(gè)β-折疊構(gòu)成，F(xiàn)nⅢ結(jié)構(gòu)域主要由8 個(gè)β-折疊組成，這種結(jié)構(gòu)在GH3 家族β-葡萄糖苷酶中普遍存在[21]。圖2 為SmBgl3A 與PDB 數(shù)據(jù)庫(kù)中GH3 家族β-葡萄糖苷酶多重氨基酸序列比對(duì)結(jié)果，其中SmBgl3A 與Bacteroides ovatus 來(lái)源的BoGH3B[15]（NCBI 登錄號(hào)No.WP_004298458.1）的同源性最高，為46.76%。據(jù)報(bào)道，在GH3 家族β-葡萄糖苷酶中，參與催化反應(yīng)的氨基酸主要包括一個(gè)親核催化殘基和一個(gè)酸/堿催化殘基。其中，親核催化殘基非常保守，通常是天冬氨酸，而作為廣義酸堿對(duì)的催化殘基卻并不保守[22]，一般為谷氨酸。經(jīng)過(guò)比對(duì)分析推斷，SmBgl3A 保守的親核催化殘基為D308。

圖2 β-葡萄糖苷酶SmBgl3A 與其他GH3 家族β-葡萄糖苷酶多重氨基酸序列比對(duì)結(jié)果Fig.2 Multiple amino acid sequences blast of β -glucosidase SmBgl3A with other β-glucosidase from GH3 families

2.3 重組β-葡萄糖苷酶SmBgl3A 的表達(dá)與純化

將重組大腸桿菌菌株接種至LLB 培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至OD600達(dá)到0.6 左右時(shí)加入IPTG 誘導(dǎo)培養(yǎng)16 h。SDS-PAGE 分析結(jié)果（見(jiàn)圖3）表明，SmBgl3A 表達(dá)量相對(duì)較高，經(jīng)純化后，得到電泳純的目的蛋白質(zhì)，且與理論相對(duì)分子質(zhì)量（8.12×104）一致。酶活力測(cè)定結(jié)果顯示，以pNPG 為底物時(shí)，SmBgl3A 的比活力為 14.74 U/mg。該酶的比活力高于細(xì)菌Actinomadura amylolytica YIM 77502T[22]（4.6 U/mg）來(lái)源、真菌Sporothrix schenckii[23]（0.801 U/mg）來(lái)源、植物Cyamopsis tetragonoloba[24]（6.6 U/mg）來(lái)源的β-葡萄糖苷酶。

圖3 重組蛋白質(zhì)SmBgl3A 親和層析純化的SDS-PAGE分析Fig.3 SDS-PAGE analysis of the purification of SmBgl3A by affinity chromatography

2.4 重組β-葡萄糖苷酶SmBgl3A 的酶學(xué)性質(zhì)分析

2.4.1 溫度和pH 對(duì)SmBgl3A 酶活力的影響SmBgl3A 的最適反應(yīng)溫度曲線如圖4（a）所示，在25～35 ℃時(shí)，酶活力隨著反應(yīng)溫度的升高而升高，35 ℃時(shí)酶活力最高；隨著溫度的繼續(xù)升高，酶活力逐漸降低，60 ℃時(shí)基本失活。熱穩(wěn)定性結(jié)果如圖4（b）所示，SmBgl3A 在40 ℃條件下孵育2 h 后仍保留40%以上的酶活力，45 ℃條件下穩(wěn)定性有較大幅度的下降。最適pH 結(jié)果如圖5（a）所示，SmBgl3A 在pH 6.5 時(shí)酶活力最高，在pH 5.0～8.0 時(shí)可表現(xiàn)出50%以上的相對(duì)酶活力。pH 穩(wěn)定性結(jié)果如圖5（b）所示，SmBgl3A 在pH 5.0～7.0 的條件下，在35 ℃孵育2 h 后，殘余酶活力（相對(duì)酶活力）在50%以上；在pH 低于4.5 及pH 高于8.0 時(shí)，殘余酶活力有較大幅度的下降，說(shuō)明SmBgl3A 有一定的酸堿適應(yīng)能力。GH3 家族β-葡萄糖苷酶的最適溫度一般較高，多在50～70 ℃，且具有較好的熱穩(wěn)定性，例如來(lái)源于Bifidobacterium adolescentis[25]的β-葡萄糖苷酶BaBgl3 的最適溫度為45 ℃，來(lái)源于Penicillium citrinum UFV1[21]的β-葡萄糖苷酶PcβGlu2 在50 ℃孵育13 h，仍能保持50%的酶活力，這種特性對(duì)于工業(yè)應(yīng)用來(lái)說(shuō)非常有利[16]；GH3 家族β-葡萄糖苷酶的最適pH 一般在4.0～6.5，且在酸性范圍內(nèi)穩(wěn)定性較好[17]，例如來(lái)源于Penicillium citrinum UFV1[26]的β-葡萄糖苷酶PcβGlu1 最適pH 為5.0，且在pH 4.0～8.0 時(shí)穩(wěn)定性較好，與SmBgl3A 的pH 穩(wěn)定性類(lèi)似。

圖4 重組蛋白質(zhì)SmBgl3A 的最適溫度及熱穩(wěn)定性Fig.4 Optimal temperature and thermal stability of recombinant protein SmBgl3A

圖5 重組蛋白質(zhì)SmBgl3A 的最適pH 及pH 穩(wěn)定性Fig.5 Optimum pH and pH stability of recombinant protein SmBgl3A

2.4.2 SmBgl3A 的底物特異性分析 SmBgl3A 的底物特異性分析結(jié)果如表2 所示，SmBgl3A 對(duì)芳香族底物pNPG 和pNPX 具有水解活性，且對(duì)pNPG 的活性最高。除此之外，SmBgl3A 還能水解pNPC，這意味著其可以水解纖維寡糖，但是對(duì)pNP（α）G 不具有活性。在天然底物中，SmBgl3A 對(duì)纖維二糖活性最高，其次是水楊苷，對(duì)蔗糖、CMC-Na、avicel 和普魯蘭糖有微弱的酶活力，對(duì)麥芽糖、乳糖、黃原膠、木聚糖、殼寡糖、幾丁質(zhì)、濾紙均未檢測(cè)到活性。GH3 家族的β-葡萄糖苷酶可水解的底物類(lèi)型很多樣，除可強(qiáng)烈水解pNPG 外，部分β-葡萄糖苷酶還可水解4-硝基苯基-β-D-半乳糖苷、纖維二糖、纖維三糖、纖維四糖等[27]。

表2 SmBgl3A 的底物特異性Table 2 Substrate specificity of SmBgl3A

2.4.3 NaCl 對(duì)SmBgl3A 酶活力的影響 測(cè)定NaCl對(duì)SmBgl3A 酶活力的影響，結(jié)果如圖6 所示。NaCl濃度在0～400 mmol/L 時(shí)，SmBgl3A 的酶活力有小幅度下降，但仍能保留90%以上活性；NaCl 濃度在400～800 mmol/L 時(shí)，酶活力相對(duì)穩(wěn)定，相對(duì)酶活力約為90%；當(dāng)NaCl 濃度在800～2 500 mmol/L 時(shí)，SmBgl3A 酶活力開(kāi)始較大幅度降低，但是當(dāng)NaCl濃度達(dá)到2 500 mmol/L 時(shí)，仍能保留約50%的活性。據(jù)報(bào)道，只有少數(shù)的β-葡萄糖苷酶具有較好的NaCl 耐受性，如來(lái)源于Alteromonas sp.L82 的β-葡萄糖苷酶Bgl[28]在NaCl 濃度為1 000 mmol/L 時(shí)的相對(duì)酶 活力為 90.7%，來(lái)源于 Bacillus cellulosilyticus 的β-葡萄糖苷酶BcBgl1A[29]在NaCl濃度為1 000 mmol/L 時(shí)的相對(duì)酶活力為62.3%。而在相同NaCl 濃度下，SmBgl3A 仍能保存80%以上的相對(duì)酶活力，說(shuō)明SmBgl3A 具有較好NaCl 耐受性。在工業(yè)應(yīng)用中，β-葡萄糖苷酶在復(fù)雜的外部環(huán)境中仍能保持活性非常重要，較好的NaCl 耐受性使β-葡萄糖苷酶在工業(yè)上具有更大的應(yīng)用潛力，可以嘗試應(yīng)用于海洋食品加工、生物乙醇生產(chǎn)等領(lǐng)域[30]。

圖6 重組蛋白質(zhì)SmBgl3A 的NaCl 耐受性Fig.6 NaCl tolerance of recombinant protein SmBgl3A

2.4.4 金屬離子對(duì)SmBgl3A 酶活力的影響 在酶反應(yīng)體系中分別加入終濃度為10 mmol/L 的Mg2+、Li+、Mn2+、Na+、Fe2+、K+、Ca2+、Zn2+、Cu2+、Fe3+等金屬離子鹽溶液及EDTA，測(cè)定金屬離子對(duì)SmBgl3A 酶活力的影響（見(jiàn)圖7）。結(jié)果表明，Mg2+和Li+對(duì)酶活力有少許激活作用，相對(duì)酶活力分別達(dá)104%和103%；其余8 種金屬離子及EDTA 對(duì)酶活力均有抑制作用，其中Fe3+能夠完全抑制酶活力。一般而言，金屬離子對(duì)不同β-葡萄糖苷酶的活性影響有很大區(qū)別。梁金鳳等分離獲得的β-葡萄糖苷酶，其酶活力經(jīng)Zn2+激活，受Fe2+抑制，而Cu2+、EDTA 對(duì)其活性基本無(wú)影響[33]。王劍鋒等分離獲得的β-葡萄糖苷酶，酶活力經(jīng)Fe2+激活，被Cu2+抑制[34]。

圖7 金屬離子對(duì)SmBgl3A 酶活力的影響Fig.7 Effect of metal ions on the enzyme activity of SmBgl3A

2.4.5 葡萄糖對(duì)SmBgl3A 酶活力的影響 測(cè)定葡萄糖對(duì)SmBgl3A 酶活力的影響，結(jié)果如圖8 所示，SmBgl3A 的IC50 小于25 mmol/L，對(duì)葡萄糖較敏感。正如報(bào)道的那樣，GH3 家族的β-葡萄糖苷酶的IC50 通常小于100 mmol/L[31]。提高SmBgl3A 對(duì)葡萄糖的耐受性，對(duì)其在工業(yè)中的應(yīng)用具有十分重要的意義。

圖8 重組蛋白質(zhì)SmBgl3A 的葡萄糖耐受性Fig.8 Glucose tolerance of recombinant protein SmBgl3A

2.4.6 SmBgl3A 酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)分析 測(cè)定SmBgl3A 水解pNPG 及纖維二糖的酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)，結(jié)果如表3 所示，SmBgl3A 對(duì)pNPG 的親和力較好，催化效率更高。SmBgl3A 對(duì)纖維二糖的催化效率遠(yuǎn)高于Actinomadura amylolytica YIM 77502T[22]來(lái)源的β-葡萄糖苷酶（10.7 s-1）。同時(shí)SmBgl3A 對(duì)pNPG 的催化效率也高于Actinomadura amylolytica YIM 77502T 來(lái)源的β-葡萄糖苷酶（5.5 s-1）。

表3 SmBgl3A 的動(dòng)力學(xué)參數(shù)Table 3 Kinetic parameters of SmBgl3A

3 結(jié)語(yǔ)

從生孢噬纖維菌Sporocytophaga sp.CX11 基因組中篩選出在纖維二糖降解過(guò)程中起關(guān)鍵作用的β-葡萄糖苷酶基因（SmBgl3A），該基因編碼的蛋白質(zhì)同一些已報(bào)道的GH3 家族β-葡萄糖苷酶氨基酸序列同源性較高，其中，與Bacteroides ovatus 來(lái)源的β-葡萄糖苷酶BoGH3B 同源性為46.76%。將該基因在大腸桿菌中異源表達(dá)，得到純酶相對(duì)分子質(zhì)量為8.12×104。SmBgl3A 的最適 底物為pNPG，對(duì)pNPG 比活力高達(dá)14.74 U/mg，最適pH 為6.5，最適溫度為35 ℃，且pH 在5.0～7.0、溫度在40 ℃以下時(shí)，穩(wěn)定性較好。SmBgl3A 具有較好的NaCl 耐受性，使其在食品、藥品等工業(yè)領(lǐng)域的應(yīng)用更為廣泛。但SmBgl3A 的酶活力及穩(wěn)定性還有待提高，糖基化修飾是改善酶活力及穩(wěn)定性的有效手段。經(jīng)過(guò)糖基化位點(diǎn)的預(yù)測(cè)可知，SmBgl3A 存在4 個(gè)潛在的N-糖基化位點(diǎn)（N137、N161、N459、N483）。有研究表明，將細(xì)菌來(lái)源的基因在畢赤酵母中表達(dá)時(shí)，分泌表達(dá)的酶蛋白會(huì)被糖基化修飾，能夠明顯改善酶的熱穩(wěn)定性[32]。在后續(xù)研究中，可將SmBgl3A 的基因在畢赤酵母中異源表達(dá)，以提高酶活力及穩(wěn)定性。作者將一種新型的來(lái)自于生孢噬纖維菌Sporocytophaga sp.CX11 的β-葡萄糖苷酶基因在大腸桿菌中進(jìn)行異源表達(dá)，并對(duì)重組蛋白質(zhì)的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了表征，為挖掘新型β-葡萄糖苷酶及其功能應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)，也為該酶的進(jìn)一步工業(yè)化應(yīng)用提供參考與借鑒。