亞麻醉濃度的七氟烷對(duì)局灶性腦缺血再灌注大鼠血腦屏障通透性的影響

徐達(dá) 許旭東 潘春英 酈惠芳 商建飛 張愛萍

(常州市中醫(yī)醫(yī)院麻醉科，江蘇 常州 213000)

腦卒中的致殘率、發(fā)病率、死亡率及復(fù)發(fā)率隨著人口老齡化的進(jìn)展而逐年升高，該病以患者出現(xiàn)局灶性神經(jīng)功能障礙或缺失為主要臨床表現(xiàn)，給患者的家庭帶來沉重的經(jīng)濟(jì)和精神負(fù)擔(dān)，不利于社會(huì)公共健康衛(wèi)生事業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。溶解血栓、恢復(fù)腦內(nèi)血流是目前常用的干預(yù)措施，但是在溶栓再灌注干預(yù)過程，不可避免地出現(xiàn)腦缺血再灌注損傷(CIRI)〔1〕。既往的研究〔2〕多從改善患者的神經(jīng)功能、減輕患者腦組織的炎性應(yīng)激阻滯有害物質(zhì)進(jìn)入腦實(shí)質(zhì)的等方面入手，并未取得突破性的進(jìn)展，形成完善的治療手段使患者從中受益免于疾病困擾。血腦屏障(BBB)是機(jī)體腦組織與腦部微血管的分界面，是維持顱內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的重要的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。在腦缺血發(fā)生后BBB的通透性直接影響缺血對(duì)腦損傷的程度。Hassonizadeh等〔3〕研究顯示在CIRI大鼠模型中，改善BBB的通透性可降低實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的腦梗死的面積。但并未詳細(xì)地闡明其中的分子機(jī)制。七氟烷是一種臨床上常用的吸入麻醉藥，其誘導(dǎo)麻醉速度快，麻醉深入便于控制，恢復(fù)蘇醒時(shí)間段，廣泛用于心腦血管外科手術(shù)中的麻醉。Ou等〔4〕研究顯示，亞麻醉濃度的揮發(fā)性的麻醉劑(如七氟烷等)能調(diào)控急性腦梗死小鼠的神經(jīng)元細(xì)胞的靜息膜電位，調(diào)控神經(jīng)元細(xì)胞的生長與興奮性。但是有關(guān)亞麻醉濃度的七氟烷對(duì)腦缺血再灌注損傷的作用機(jī)制報(bào)道較少。本研究通過構(gòu)建局灶性CIRI大鼠模型，從BBB的角度入手，探討亞麻醉濃度的七氟烷對(duì)腦組織的保護(hù)機(jī)制。

1 材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、主要試劑和儀器 SPF級(jí)雄性SD大鼠，9～12周齡，250～280 g，40只，由杭州拓實(shí)生物科技有限公司提供，動(dòng)物的許可證號(hào)SYXK(浙)2020-0025，所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在常州市中醫(yī)醫(yī)院SPF及動(dòng)物房中適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w后用于實(shí)驗(yàn)，飼養(yǎng)設(shè)定條件：溫度22℃～25℃，濕度(45±15)%，自然光照，常規(guī)基礎(chǔ)飼料，自由飲水。本研究經(jīng)醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，并在實(shí)驗(yàn)過程中盡最大努力減少動(dòng)物的傷亡及痛苦。七氟烷購自魯南貝特制藥有限公司；尼莫地平(20 mg×50片，廣東華南藥業(yè)集團(tuán)有限公司，國藥準(zhǔn)字：H44025019)。戊巴比妥鈉、多聚甲醛、組織裂解液、化學(xué)增強(qiáng)顯色劑(南京建成生物科技有限公司)，蛋白濃度檢測(cè)試劑、Western印跡試劑盒、2,3,5-三苯基氯化四氮唑(TTC)染色試劑盒、脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記(TUNEL)染色試劑盒、蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒購自上海碧云天生物科技有限公司，兔抗GAPDH抗體購自美國Abcam公司。X71光學(xué)顯微鏡(日本Olympus公司)，Universal Hood Ⅱ凝膠成像處理系統(tǒng)(美國Bio-rad公司)，Philips 201透射電子顯微鏡(荷蘭Eindhoven公司)，超薄切片機(jī)(德國Leica公司)。

1.2模型構(gòu)建和分組 術(shù)前將大鼠禁食不禁水12 h后，參照Abdel-Rahman等〔5〕介紹的方法進(jìn)行造模構(gòu)建局灶性CIRI大鼠模型：腹腔注射戊巴比妥鈉將大鼠麻醉后，待動(dòng)物失去意識(shí)后固定在無菌實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，消毒備皮，頸部正中切開，顯微鏡下鈍性分離頸總動(dòng)脈、頸內(nèi)外動(dòng)脈，穿線，在距頸外動(dòng)脈近動(dòng)脈分叉約1 cm結(jié)扎頸外動(dòng)脈，結(jié)扎線插入的深度在18 cm上下，當(dāng)栓線呈現(xiàn)一定的波動(dòng)感，以示頸內(nèi)動(dòng)脈沒有完全阻塞，表示結(jié)扎成功，在動(dòng)物缺血2 h后松開線栓進(jìn)行再灌注，假手術(shù)組的動(dòng)物只進(jìn)行穿線，不進(jìn)行結(jié)扎和再灌注。術(shù)后2 h，進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)價(jià)：無神經(jīng)功能缺失癥狀，能夠正?；顒?dòng)為0分；大鼠出現(xiàn)左側(cè)前爪不能完全伸展的情況為1分；大鼠爬行時(shí)出現(xiàn)轉(zhuǎn)圈走的現(xiàn)象為2分；大鼠行走時(shí)身體向一側(cè)傾倒的現(xiàn)象為3分；大鼠出現(xiàn)意識(shí)喪失，不能自主行走的現(xiàn)象為4分，其中獲得1～3分的大鼠表示造模成功。

將造模成功的30只大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法依次分為模型組、實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，每組10只，另取10只大鼠為假手術(shù)組，假手術(shù)組在造模術(shù)中只進(jìn)行穿線，不結(jié)扎；其中實(shí)驗(yàn)組每日給以1.2%七氟烷吸入治療3 h，對(duì)照組每日給以1.08 mg/ml的尼莫地平灌胃給藥，模型組和假手術(shù)組以等劑量的生理鹽水進(jìn)行灌胃處理，所有大鼠以單籠、基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)。

1.3各組神經(jīng)功能評(píng)價(jià) 連續(xù)處理1 w后，再次對(duì)動(dòng)物進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)價(jià)，留取2 ml尾靜脈血，離心后，留取上清待測(cè)；然后將大鼠斷頭處死，取出各組大鼠的腦組織，注意保持動(dòng)物腦組織的完整性。

1.4各組腦梗死面積比較 取腦組織標(biāo)本，制成厚度約為2 μm的冠狀切片，TTC工作液避光染色，正常腦組織中因含與TTC發(fā)生特異性反應(yīng)的酶而呈紅色，缺血區(qū)域因酶活下降不能與TTC發(fā)生特異性的結(jié)合而呈現(xiàn)蒼白色〔6〕，圖像分析測(cè)量系統(tǒng)統(tǒng)計(jì)分析大鼠腦組織的腦梗死面積比例大小。

1.5各組腦組織病理損傷變化 取腦組織標(biāo)本，中性甲醛溶液固定，脫水，包埋，制成厚度在3～5 μm的冠狀石蠟切片，HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察并采集圖片。

1.6各組腦組織的超微結(jié)構(gòu)損傷病理 取腦組織標(biāo)本，在戊二醛溶液(濃度約為3%)中固定1 h，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3次，1%四氧化鋨固定90 min，無水乙醇梯度脫水，中性樹脂包埋，切片，依次經(jīng)洗滌、脫水、切片，醋酸鈾-檸檬酸鉛雙染色，Philips 201透射電子顯微鏡鏡下觀察，拍照。

1.7各組腦組織細(xì)胞凋亡 取腦組織，按TUNEL染色試劑盒要求進(jìn)行預(yù)處理，抗原修復(fù)，封閉，標(biāo)記，避光染色，脫水，中性樹膠封片，鏡檢，視野中被染成黃褐色的細(xì)胞為凋亡細(xì)胞〔7〕，細(xì)胞的凋亡率等于TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)與總細(xì)胞的比值。

1.8各組大鼠BBB的通透性比較 處死大鼠24 h前，股靜脈注射4%伊文思藍(lán)(EB)染料5 ml/kg，按EB染色試劑盒要求進(jìn)行生理鹽水及固定液灌注，處死大鼠后，取各組大鼠的腦組織，常規(guī)固定48 h，梯度濃度蔗糖溶液脫水，制成約8 μm的切片，顯微鏡下觀察。

1.9各組血清指標(biāo)檢測(cè) 按照酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)試劑盒要求，檢測(cè)各組大鼠血清中白細(xì)胞介素(IL)-1β和腫瘤壞死因子(TNF)-α等炎性相關(guān)因子含量的變化。

1.10各組腦組織中閉合蛋白(Occludin)、緊密連接蛋白(Claudin)-5、閉鎖連接蛋白(ZO)-1等細(xì)胞連接蛋白的表達(dá) 取各組腦組織，在4℃裂解液中放置30 min，離心，并將上清液稀釋，常規(guī)方法提取樣本中的總蛋白，以50 μg樣品進(jìn)行上樣，電泳后，轉(zhuǎn)模，封閉，加入一抗(1∶1 000)，二抗(1∶5 000)稀釋后，室溫孵育后，顯色30 min，以GAPDH為參照，分析目標(biāo)蛋白的灰度值。

1.11統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用Graphpad8.0進(jìn)行作圖，采用SPSS16.0軟件進(jìn)行單因素分析、t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1各組一般狀態(tài)及神經(jīng)功能評(píng)分比較 假手術(shù)組反應(yīng)敏捷，活潑好動(dòng)，皮毛光亮，飲食與進(jìn)水未見明顯異常，體重增加較為明顯；模型組皮毛雜亂，暗淡無光，活動(dòng)量明顯減少，反應(yīng)遲鈍，大鼠經(jīng)常以鼠尾為中心轉(zhuǎn)圈，四肢協(xié)調(diào)性不高，弓背明顯，食欲不良，體重增加不明顯；與模型組相比，實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組癥狀明顯改善，大鼠四肢協(xié)調(diào)趨于正常，飲水與進(jìn)食量明顯增加，體重較模型組增加較為明顯。神經(jīng)功能評(píng)價(jià)結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，模型組、實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組神經(jīng)功能評(píng)分明顯升高(均P<0.05)，與模型組相比，實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組神經(jīng)功能評(píng)分明顯下降(均P<0.05)，對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組神經(jīng)功能差異不明顯(P>0.05)，見表1。

2.2各組腦梗死面積比較 TTC染色結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，模型組、實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組腦組織的梗死面積明顯升高(均P<0.05)；與模型組相比，實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組腦組織的梗死面積明顯下降(均P<0.05)，對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組腦組織的梗死面積差異不明顯(P>0.05)，見表1、圖1。

表1 各組神經(jīng)功能評(píng)分、腦梗死面積、腦組織細(xì)胞凋亡率比較

圖1 各組腦組織(TTC染色，×10)

2.3各組腦組織病理損傷變化 HE染色結(jié)果顯示，假手術(shù)組腦組織的神經(jīng)元細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，排列緊密，大小均勻，胞質(zhì)中內(nèi)容物豐富，核膜、核仁及尼式體均清晰可辨，神經(jīng)纖維未見明顯異常，毛細(xì)血管無水腫現(xiàn)象出現(xiàn)；模型組腦組織中可見明顯的壞死灶點(diǎn)，壞死灶點(diǎn)周圍較多的壞死的神經(jīng)元細(xì)胞，炎性細(xì)胞浸潤，神經(jīng)元細(xì)胞排列松散，或大或小，胞核固縮嚴(yán)重，胞體損傷明顯，空泡樣變性明顯，核質(zhì)界限不明，神經(jīng)纖維或斷裂或缺失，腦部血管結(jié)構(gòu)不完整。與模型組相比，實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組腦組織的神經(jīng)損傷明顯改善，細(xì)胞內(nèi)空泡樣變性趨于緩解，核質(zhì)界限趨于清晰，腦梗死周圍的神經(jīng)元細(xì)胞損傷趨于恢復(fù)，見圖2。

2.4各組腦組織超微結(jié)構(gòu)損傷病理變化 電鏡下觀察結(jié)果顯示，假手術(shù)組神經(jīng)元細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰完整，核仁大且圓，染色質(zhì)未見明顯異常，核糖體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體等細(xì)胞器性狀穩(wěn)定；模型組腦組織神經(jīng)元細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)損傷明顯，核膜凹陷或溶解明顯，核仁消失，胞質(zhì)中的細(xì)胞器數(shù)量明顯減少，線粒體損傷嚴(yán)重，雙層膜結(jié)構(gòu)不清晰，腫脹明顯，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)斷裂，核糖體脫顆粒現(xiàn)象明顯；與模型組相比，實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組腦組織神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)損傷明顯緩解，線粒體的雙層膜結(jié)構(gòu)逐漸清晰，核膜溶解現(xiàn)象明顯減輕，染色質(zhì)的固縮聚集狀態(tài)明顯減少，見圖3。

圖2 各組腦組織(HE染色，×400)

圖3 各組腦組織超微結(jié)構(gòu)(×10 000)

2.5各組腦組織細(xì)胞凋亡 TUNEL染色結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，模型組、實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組腦組織細(xì)胞凋亡率明顯升高(均P<0.05)；與模型組相比，實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組腦組織的細(xì)胞凋亡率明顯下降(均P<0.05)，對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組腦組織的細(xì)胞凋亡率差異不明顯(P>0.05)，見表1、圖4。

圖4 各組腦組織細(xì)胞凋亡(TUNEL染色，×400)

2.6各組BBB通透性比較 EB染色結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，模型組、實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組腦組織EB的滲出量明顯升高(均P<0.05)；與模型組相比，實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組腦組織EB的滲出量明顯下降(均P<0.05)，對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組腦組織EB的滲出量差異不明顯(P>0.05)，見圖5，表2。

2.7各組血清指標(biāo)比較 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，模型組、實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組血清中IL-1β和TNF-α含量明顯升高(均P<0.05)；與模型組相比，實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組血清中IL-1β和TNF-α含量明顯下降(均P<0.05)，對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組血清中IL-1β和TNF-α含量差異不明顯(P>0.05)，見表2。

2.8各組腦組織中Occludin、Claudin-5、ZO-1蛋白表達(dá) Western印跡結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，模型組、實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組腦組織中Occludin、Claudin-5、ZO-1蛋白相對(duì)表達(dá)明顯降低(均P<0.05)；與模型組相比，實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組腦組織中Occludin、Claudin-5、ZO-1蛋白相對(duì)表達(dá)明顯升高(均P<0.05)，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組相比差異無統(tǒng)計(jì)意義(P>0.05)，見圖6，表3。

圖5 各組BBB通透性(EB染色，×400)

表2 各組腦組織EB的滲出量、血清中IL-1β、TNFα含量比較

圖6 各組腦組織中Occludin、Claudin-5、ZO-1蛋白的表達(dá)

表3 各組腦組織中Occludin、Claudin-5、ZO-1蛋白相對(duì)表達(dá)

3 討 論

缺血性腦卒中又被稱為腦梗死，是由多種原因引起的腦組織局部區(qū)域出現(xiàn)血液供應(yīng)障礙，腦神經(jīng)元細(xì)胞在缺血、缺氧情況下異常凋亡，腦組織出現(xiàn)不可逆的損傷，進(jìn)而誘發(fā)神經(jīng)功能障礙及運(yùn)動(dòng)功能障礙，肢體自主能力受限，影響患者的正常生活。CIRI是在腦組織恢復(fù)血流致使腦組織損傷進(jìn)一步加重的現(xiàn)象。其病理機(jī)制尚處于實(shí)驗(yàn)研究階段，臨床上尚缺乏根治性的治療措施。大量的研究顯示〔8〕，CIRI的病理機(jī)制涉及能量代謝障礙、炎癥性與氧化應(yīng)激、酸中毒等多個(gè)生理病理過程。但有研究顯示〔9〕，BBB的通透性增加與CIRI的關(guān)系密切。當(dāng)CIRI的發(fā)生導(dǎo)致患者的BBB的開放，血液及血漿中的組分由此進(jìn)入腦實(shí)質(zhì)誘發(fā)患者出現(xiàn)血管性的腦水腫，致使腦組織神經(jīng)元的損傷進(jìn)一步加劇。因此研究BBB通透性的改變成為干預(yù)CIRI的一個(gè)新思路，改善腦?；颊叩腂BB，有助于降低患者的神經(jīng)障礙程度，提高患者的日常生存質(zhì)量。

七氟烷是使用較為廣泛的麻醉藥。但最新的研究顯示七氟烷不僅具有良好的鎮(zhèn)靜催眠的效用，并且在外科手術(shù)中具有對(duì)肝、肺、心、腦等器官保護(hù)的作用。Tuncay等〔10〕研究顯示，在下肢缺血再灌注損傷大鼠模型中，七氟烷能明顯抑制肺組織中的氧化應(yīng)激的酶活性，發(fā)揮對(duì)非保護(hù)的作用。Shiraishi 等〔11〕研究顯示，在肝移植和肝切除等因素導(dǎo)致的大鼠肝缺血再灌注損傷模型中，七氟烷的應(yīng)用能明顯抑制肝細(xì)胞的異常凋亡。Xie 等〔12〕研究報(bào)道，在糖尿病心肌缺血再灌注小鼠模型中，七氟烷(1.2%)能明顯抑制炎性相關(guān)信號(hào)的傳導(dǎo)，抑制心肌炎性反應(yīng)的級(jí)聯(lián)放大。Yue等〔13〕研究顯示，吸入性麻醉劑七氟烷(1.2%)能激活神經(jīng)系統(tǒng)的自我防御機(jī)制，增強(qiáng)神經(jīng)元對(duì)CIRI的耐受作用。本研究中七氟烷的濃度為1.2%，屬于亞麻醉范圍濃度，本研究結(jié)果證實(shí)了治療手段對(duì)疾病的干預(yù)作用。

BBB是將腦組織和血液進(jìn)行分隔的一個(gè)復(fù)雜的細(xì)胞系統(tǒng)，其主要功能是調(diào)控某些物質(zhì)在血液循環(huán)和中樞神經(jīng)區(qū)域的交換，進(jìn)而保護(hù)中樞神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，其通透性的改變與中樞神經(jīng)元細(xì)胞的損傷、變性、炎性應(yīng)激及凋亡、壞死等生理過程關(guān)系密切〔14〕。Occludin、Claudin-5、ZO-1蛋白是構(gòu)成BBB的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。Liu等〔15〕研究顯示，CIRI發(fā)生后，BBB的結(jié)構(gòu)被破壞，其正常功能隨之發(fā)生嚴(yán)重的障礙。Khamchai等〔16〕研究顯示，在CIRI后，改善大鼠腦組織BBB的通透性，有助于炎性因子進(jìn)入中樞神經(jīng)區(qū)域的量，保護(hù)腦組織免于過于激烈的炎性損傷。本研究結(jié)果證實(shí)藥物對(duì)BBB的修復(fù)作用。

綜上，亞麻醉濃度的七氟烷能明顯改善局灶性CIRI大鼠BBB的通透性，降低神經(jīng)元的凋亡率，改善其神經(jīng)功能。但是在臨床應(yīng)用中，該干預(yù)手段能否發(fā)揮等效的作用，仍需要結(jié)合患者的個(gè)體特殊性及疾病的進(jìn)展進(jìn)行綜合考量。