miR-613 抑制膠質(zhì)瘤增殖及侵襲能力

賀彬 丁晨哲 劉家陽(yáng)

(1固原市人民醫(yī)院神經(jīng)外科，寧夏 固原 756000；2寧夏回族自治區(qū)人民醫(yī)院神經(jīng)外科)

惡性膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見、最具侵襲性的原發(fā)腫瘤，約占中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的30%，腦惡性腫瘤的80%〔1〕。盡管采取了積極的療法，包括外科手術(shù)切除，放療和化學(xué)療法，但膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后仍然很差，主要是由于其明顯的惡性增殖和浸潤(rùn)。微小RNA(miRNA)是一類小型非編碼RNA，通過靶向3′-非翻譯區(qū)(3′-UTR)調(diào)控信息RNA (mRNA)，從而抑制基因表達(dá)。由于miRNAs介導(dǎo)靶基因的表達(dá)，它們參與了多種生物過程的調(diào)控，如細(xì)胞增殖、侵襲、凋亡和分化〔2〕。miRNA在膠質(zhì)瘤起始和進(jìn)展的調(diào)控中也起著關(guān)鍵作用〔3,4〕，miR-613是一種新型的與癌癥相關(guān)的miRNA，已被證明可抑制包括肝癌〔5〕、宮頸癌〔6〕、大腸癌〔7〕等多種癌癥中的腫瘤發(fā)生和發(fā)展〔8〕。雖然miR-613已被證明可以抑制多種惡性腫瘤細(xì)胞增殖和集落形成〔9,10〕，但miR-613在膠質(zhì)瘤中的功能和潛在機(jī)制仍不清楚。本研究旨在探討miR-613對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤的增殖及侵襲能力的影響和調(diào)控機(jī)制。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞培養(yǎng)和細(xì)胞轉(zhuǎn)染 U87MG人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞為星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤，分級(jí)為Ⅳ級(jí)(購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海研究所)。細(xì)胞在含有10%胎牛血清和5% CO2的RPMI1640培養(yǎng)基(GIBCO，USA)中培養(yǎng)。培養(yǎng)基保持在濕度為95%的CO2培養(yǎng)箱中，溫度為37℃。為了進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，根據(jù)制造商的方案，使用miR-613模擬物(HaiJima生物技術(shù)公司)、miR-613抑制劑(HaiJima生物技術(shù)公司)、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G6PD)和miR-613模擬物+G6PD(Lipofectamine 2000，Invitrogen，美國(guó))轉(zhuǎn)染U87MG細(xì)胞，分別記為miR-613模擬物組、miR-613抑制劑組、G6PD組、miR-613+G6PD組。培養(yǎng)24～48 h后，收集細(xì)胞，用TRIzol提取總核糖核酸。轉(zhuǎn)染72 h后，用Western印跡法測(cè)定細(xì)胞的蛋白質(zhì)表達(dá)。

1.2樣本收集 2015年2月至2018年9月，寧夏回族自治區(qū)人民醫(yī)院神經(jīng)外科共確診48例膠質(zhì)瘤患者，其中男26例，女22例，平均年齡(48.5±12.4)歲。納入的患者未患其他疾病，也未接受放療、化療和激素療法。根據(jù)世界衛(wèi)生組織(世衛(wèi)組織)制定的神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤分類〔11〕，神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織被兩名獨(dú)立病理學(xué)家分類為：Ⅰ級(jí)(6例；毛細(xì)胞型星形細(xì)胞瘤)，Ⅱ級(jí)(18例；彌漫性星形細(xì)胞瘤、少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤、原生質(zhì)性星形細(xì)胞瘤、中樞神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞瘤、室管膜瘤)，Ⅲ級(jí)(14例；間變性星形細(xì)胞瘤、間變性細(xì)胞瘤、間變性室管膜瘤)和Ⅳ級(jí)(10例；膠質(zhì)神經(jīng)母細(xì)胞瘤，髓母細(xì)胞瘤)。Ⅰ級(jí)和Ⅱ級(jí)為低級(jí)別膠質(zhì)瘤組織，Ⅲ級(jí)和Ⅳ級(jí)為高級(jí)別膠質(zhì)瘤組織。除此之外，從進(jìn)行尸檢的患者中收集20個(gè)正常腦組織樣本作為對(duì)照，并將所有樣本置于液氮中。整個(gè)程序得到了醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，所有患者簽署了知情同意書。

1.3RNA提取和RT-PCR 用TRIzol試劑(Invitrogen,CA,USA)提取細(xì)胞或人體組織中核糖核酸。使用紫外分光光度計(jì)在260和280 nm處測(cè)量吸光度，并且在260和280 nm的吸光度比率用于評(píng)估核糖核酸的純度。使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)合成cDNA，以量化miR-613和G6PD。通過實(shí)時(shí)熒光定量分析，用THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix(Toyobo,Japan),擴(kuò)增cDNAs，并使用β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)作為內(nèi)源性對(duì)照。聚合酶鏈反應(yīng)條件:95℃變性10 s，60℃退火20 s，在72℃延伸34 s。上述步驟循環(huán)40次進(jìn)行擴(kuò)增。

1.4Western印跡法檢測(cè)相關(guān)蛋白水平 使用RIPA緩沖液裂解總細(xì)胞提取物。用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離細(xì)胞蛋白質(zhì)，并轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。一抗包括抗G6PD、抗細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)、抗磷酸化(p)ERK、抗c-Fos和抗β-actin(Santa Cruz Biotechnology,USA)。用Tris-緩沖鹽水和TBST洗滌膜3次，每次10 min，加入辣根過氧化物酶結(jié)合的二級(jí)抗體，并在室溫下孵育1 h。之后，用TBST洗滌膜3次，每次10 min，通過增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光顯影并拍照。

1.5CCK-8細(xì)胞增殖檢測(cè) 細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h后，U87MG細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶消化，用含10%胎牛血清(FBS)的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)成單細(xì)胞懸液，然后置于每孔含1×104個(gè)細(xì)胞的24孔板中，在5% CO2培養(yǎng)箱中孵育。使用細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8 (CCK-8,Japan)在24、48、72和96 h測(cè)量細(xì)胞增殖。此外，將10 μl CCK-8溶液加入100 μl培養(yǎng)基中，細(xì)胞在37℃孵育4 h后，檢測(cè)每個(gè)孔在450 nm波長(zhǎng)下的光密度。繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，其中橫軸代表不同的測(cè)量時(shí)間，縱軸代表吸收值。

1.6Transwell細(xì)胞體外侵襲實(shí)驗(yàn) 轉(zhuǎn)染24 h后收集細(xì)胞，用濃度為5×105細(xì)胞/ml的無(wú)血清培養(yǎng)基懸浮。神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的體外侵襲性通過涂有基質(zhì)凝膠(BD,Biosciences)的8 μm孔的Transwell小室(Corning Incorporated Life Sciences)進(jìn)行評(píng)估。此外，將200 ml細(xì)胞懸液加入上腔室，并將10% FBS培養(yǎng)基置于匹配的下腔室中，在37℃下培養(yǎng)24 h。用棉簽擦拭上腔室中的非侵入細(xì)胞，用多聚甲醛(PFA)固定遷移到下膜中的細(xì)胞20 min，并用0.1%結(jié)晶紫(Beyotime)染色。使用顯微鏡(Olympus)在每個(gè)孔的6個(gè)隨機(jī)選擇的區(qū)域觀察和計(jì)數(shù)染色的細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)被獨(dú)立重復(fù)3次。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS22.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、單因素方差分析、χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1膠質(zhì)瘤腦組織和正常腦組織中miR-613和G6PD水平比較 與正常腦相比，膠質(zhì)瘤組織中miR-613的表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.05)。與低級(jí)別膠質(zhì)瘤組織比較，miR-613表達(dá)在高級(jí)別膠質(zhì)瘤組織顯著下調(diào)(P<0.05)，G6PD基因在膠質(zhì)瘤組織中高表達(dá)，并隨惡性程度增加而增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

2.2miR-613直接抑制膠質(zhì)瘤中G6PD的表達(dá) 與空白對(duì)照組和miR-613 NC組比較，miR-613模擬物組，G6PD表達(dá)水平顯著降低，miR-613顯著升高(P<0.05)；miR-613抑制劑組G6PD表達(dá)水平上調(diào)，miR-613顯著下調(diào)(P<0.05)。見表2和圖1。

表1 不同組織中miR-613和G6PD mRNA表達(dá)水平比較

表2 各組miR-613和G6PD mRNA表達(dá)比較

1～4：空白對(duì)照組，miR-613 NC組，miR-613模擬物組，miR-613抑制劑組圖1 miR-613直接抑制G6PD在膠質(zhì)瘤中表達(dá)

2.3miR-613通過靶向G6PD抑制ERK途徑 與空白對(duì)照組相比，miR-613組pERK、c-Fos和G6PD蛋白表達(dá)水平均顯著降低(P<0.05)。與miR-613組相比，miR-613+G6PD組和G6PD組的pERK、c-Fos和G6PD蛋白水平顯著增加(P<0.05)。與miR-613+G6PD組相比，G6PD組的pERK、c-Fos和G6PD蛋白水平顯著增加(P<0.05)。見圖2、 表3。

1～5:空白對(duì)照組，miR-613 NC組，miR-613組，miR-613+G6PD組，G6PD組圖2 Western印跡法檢測(cè)各組相關(guān)蛋白表達(dá)水平

表3 各組細(xì)胞中蛋白相對(duì)表達(dá)水平

2.4miR-613靶向G6PD抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和侵襲 與空白對(duì)照組相比，miR-613組48、72、96 h OD450值及侵襲細(xì)胞數(shù)均顯著降低(P<0.05)；與miR-613組相比，G6PD組和miR-613+G6PD組48、72、96 h 的OD450值及侵襲細(xì)胞數(shù)均顯著升高(P<0.05)；與miR-613+G6PD組相比，G6PD組48、72、96 h 的OD450值及侵襲細(xì)胞數(shù)顯著升高(P<0.05)。見表4、圖3。

表4 細(xì)胞中各個(gè)時(shí)間點(diǎn)不同組別膠質(zhì)瘤細(xì)胞的OD450 nm相對(duì)值及侵襲細(xì)胞數(shù)比較

圖3 miR-613通過靶向G6PD抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲(結(jié)晶紫染色，×200)

3 討 論

膠質(zhì)瘤是一種預(yù)后差的原發(fā)性惡性腦腫瘤，最常見的亞型(膠質(zhì)母細(xì)胞瘤)的中位生存時(shí)間只有14個(gè)月〔12〕。膠質(zhì)母細(xì)胞瘤起始細(xì)胞能抑制T細(xì)胞的增殖，增強(qiáng)免疫抑制調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的凋亡〔13〕。miRNA的失調(diào)已成為惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤的主要特征，一些miRNA可能是膠質(zhì)瘤診斷和預(yù)后的潛在新生物標(biāo)記〔14,15〕。部分miRNAs已被證明參與抑制膠質(zhì)瘤的進(jìn)展和發(fā)展，是膠質(zhì)瘤的潛在治療靶點(diǎn)〔15〕。既往研究表明miR-613在多種類型的癌癥中下調(diào)，并作為腫瘤抑制因子發(fā)揮作用〔5,6,8,10,16～18〕。如miR-613通過靶向formin樣蛋白2抑制結(jié)腸直腸癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，并在G1期誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯〔18〕。miR-613在骨肉瘤細(xì)胞中過表達(dá)，通過調(diào)控細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期，顯著抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和集落形成，損害細(xì)胞的遷移和侵襲能力，進(jìn)而通過抑制c-MET抑制上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化〔19〕。miR-613在體外顯著抑制甲狀腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、遷移和侵襲，在體內(nèi)通過靶向鞘氨醇激酶2抑制腫瘤生長(zhǎng)〔20〕。本研究中，miR-613在膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)顯著降低，在高級(jí)別膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)顯著降低。miR-613的異常表達(dá)可能與人腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生有關(guān)。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)G6PD蛋白在膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)水平高于正常腦組織。G6PD是miR-613的直接靶標(biāo)〔8〕，而G6PD過表達(dá)被證明在食管癌中逆轉(zhuǎn)了miR-613的作用〔16〕。在多種類型的惡性腫瘤中均存在G6PD活性的異常上升〔21～24〕。G6PD的主要作用是通過戊糖磷酸途徑產(chǎn)生核糖和還原性等效的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)。G6PD是維持細(xì)胞生長(zhǎng)和發(fā)育的典型管家酶。G6PD活性減弱或功能失調(diào)會(huì)阻礙正常細(xì)胞增殖及胚胎和器官發(fā)育〔25,26〕?？焖偕L(zhǎng)的癌細(xì)胞已經(jīng)進(jìn)化出多種機(jī)制來(lái)激活G6PD，以支持NADPH生成和脂肪酸及核酸合成的細(xì)胞需求〔27,28〕。本研究結(jié)果顯示膠質(zhì)瘤腦組織中的miR-613表達(dá)水平下降，而G6PD的水平上升,并且MiR-613直接抑制膠質(zhì)瘤中G6PD的表達(dá)。

ERK通路在膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖中起著至關(guān)重要的作用。ERK信號(hào)通路可影響包括轉(zhuǎn)錄因子和其他與細(xì)胞周期進(jìn)程、分化和蛋白質(zhì)翻譯相關(guān)的激酶的磷酸化。參與ERK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的分子的異常表達(dá)被認(rèn)為在癌癥的發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用〔29〕。例如，Alves等〔30〕利用結(jié)腸模型證明，上調(diào)ERK信號(hào)通路可使G6PD誘導(dǎo)自噬，從而促進(jìn)結(jié)直腸癌的生存。并且ERK信號(hào)可以被一些結(jié)合上游分子或下游受體的因素所抑制。本研究結(jié)果提示G6PD可能是miR-613的直接靶點(diǎn)，參與了miR-613抑制增殖和侵襲的抑制作用。

綜上所述，miR-613在膠質(zhì)瘤中下調(diào)，而miR-613過表達(dá)與膠質(zhì)瘤細(xì)胞ERK信號(hào)通路降低相關(guān)，從而抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖和侵襲。本研究為膠質(zhì)瘤的發(fā)病機(jī)制提供了新的認(rèn)識(shí)，為膠質(zhì)瘤的治療提供了一個(gè)潛在的有效靶點(diǎn)。