miR-21通過調(diào)節(jié)TGF-β/activin信號(hào)通路影響人骨髓間質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化的機(jī)制

劉暉 李熙 吳學(xué)軍 林妙闊

(廈門大學(xué)附屬福州第二醫(yī)院，福建 福州 350000)

骨髓間質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)具有廣義上干細(xì)胞的特征，自我增殖能力強(qiáng)，能夠進(jìn)行多向分化為成骨細(xì)胞、心肌細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等〔1,2〕。在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域經(jīng)常會(huì)有骨缺損的情況發(fā)生，骨組織工程的進(jìn)步為患者的這一病癥提供了良好的解決方式〔3,4〕，尤其是其中的干細(xì)胞療法成為現(xiàn)階段的新興研究方向。微小RNA〔5〕(miRNA)是一種特屬于真核細(xì)胞中的內(nèi)源性的非編碼RNA，長度僅僅在20個(gè)核苷酸左右，具有特異性識(shí)別靶基因3′端非翻譯區(qū)的功能，在細(xì)胞的新陳代謝等病理生理中起著不可或缺的調(diào)控作用〔6,7〕。而miR-21也與多種生物學(xué)過程密切相關(guān)，具有調(diào)控細(xì)胞新陳代謝、血管再生、成骨分化等作用〔8,9〕。轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β是一種具有多種功能的細(xì)胞因子，主要調(diào)控細(xì)胞的生長，在成骨細(xì)胞的分化中也具有重要作用〔10〕。本研究以TGF-β/激活蛋白(activin)信號(hào)通路為基礎(chǔ)，探討miR-21對(duì)BMSCs分化為成骨細(xì)胞的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1試劑 胎牛血清(貨號(hào)10270-106，上海昱都生物科技有限公司)，低糖型DMEM培養(yǎng)基、Li-pofectamineTM2000(Thermo Fisher)，miR-21模擬物(mimics)、miR-21抑制劑(inhibitor)由諾揚(yáng)生物技術(shù)公司合成，青霉素、鏈霉素(貨號(hào)BJ016251、BJ016332，上海邦景實(shí)業(yè)有限公司)，pmirGLO載體(貨號(hào)LM1439，上海聯(lián)邁生物工程有限公司)、雙熒光素酶報(bào)告基因試劑盒(貨號(hào)ab228530，英國Abcam公司)，MTT檢測(cè)試劑盒、二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒、DNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(貨號(hào)11465007001、23225、10503027、18091050，美國Sigma公司)，引物由上海江林生物科技有限公司提供。

1.2細(xì)胞

1.2.1BMSCs的分離及培養(yǎng) 骨髓由健康獻(xiàn)髓者捐贈(zèng)，使用L-DMEM對(duì)采集的抗凝骨髓按照1∶5的比例稀釋，然后使用Percoll分離液對(duì)其進(jìn)行分離。具體步驟：首先在試管底部加入1.073 g/ml的Percoll分離液，然后將處理后的骨髓通過1∶1的比例緩慢滴加進(jìn)試管，以2 800 r/min的條件對(duì)其離心30 min，得到的單個(gè)核細(xì)胞使用L-DMEM洗滌兩次后在含有10%胎牛血清的L-DMEM培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)使用24孔板，規(guī)定濃度為2.0×105/cm2，放置于37℃，含有5%CO2的培養(yǎng)箱中，2 d后將非貼壁細(xì)胞清除，其余細(xì)胞置于新鮮的培養(yǎng)基中，在細(xì)胞擴(kuò)增到瓶底的90%融合時(shí)，使用0.05%的胰蛋白酶分解，并按照1∶1的比例對(duì)其進(jìn)行傳代，傳代至2代以1∶2的比例進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.2.2轉(zhuǎn)染及分組 將培養(yǎng)的BMSCs細(xì)胞分為無轉(zhuǎn)染的空白對(duì)照組，轉(zhuǎn)染miR-21 mimics的BMSCs組、轉(zhuǎn)染有miR-21 inhibitor的miR-21敲低組。將生長程度為70%～80%融合度的細(xì)胞接種到細(xì)胞瓶中，再使用Li-pofectamineTM2000并按照其說明書來進(jìn)行轉(zhuǎn)染，這樣進(jìn)行2 d后將細(xì)胞培養(yǎng)液倒清，細(xì)胞用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗，后使用細(xì)胞裂解液進(jìn)行細(xì)胞裂解。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1miR-21靶基因預(yù)測(cè) 聯(lián)合TargetScan和miRanda兩個(gè)網(wǎng)站對(duì)miR-21的靶基因進(jìn)行探找，最終選擇TGF-β/activin信號(hào)通路上miR-21的靶基因：TGF-β受體Ⅱ(TGF-βR2)、TGF-β1(activin)。

1.3.2RT-PCR檢測(cè)相關(guān)基因 通過Trizol法對(duì)總RNA進(jìn)行提取，具體的操作按照說明書進(jìn)行，然后將其進(jìn)行純化定量，再按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒中的說明書步驟合成互補(bǔ)DNA，在RT-PCR試劑盒的步驟要求下對(duì)miR-21、TGF-βR2、TGFβ1、骨特異性轉(zhuǎn)錄因子(Runx)2、成骨細(xì)胞特異基因(Osterix)mRNA的表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)，以U6和GAPDH作為內(nèi)參，使用2-△△Ct公式對(duì)它的表達(dá)情況進(jìn)行分析。

1.3.3Western印跡檢測(cè)相關(guān)蛋白 使用裂解液裂解細(xì)胞，將裂解的細(xì)胞置于EP管中進(jìn)行離心，離心條件為：12 000 r/min，4℃，15 min，然后收集上清液，根據(jù)BCA法檢測(cè)TGF-βR2、TGF-β1、Runx2、Osterix蛋白表達(dá)，從而可以通過BandScan5.0對(duì)得到的目的蛋白條帶進(jìn)行分析。

1.3.4成骨細(xì)胞的鑒定

1.3.4.1鈣沉積檢測(cè) 細(xì)胞經(jīng)miR-21過表達(dá)或敲低后21 d后使用PBS洗滌兩次后加入適當(dāng)?shù)能缢丶tS染液進(jìn)行滴染，維持3～5 min，于顯微鏡下對(duì)染色結(jié)果進(jìn)行觀察。

1.3.4.2堿性磷酸酶(ALP)活性測(cè)定 按照ALP測(cè)定試劑盒的步驟，于細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-21后的第0、3、6、9、12、15、18、21天對(duì)其ALP活性進(jìn)行檢測(cè)。

1.3.4.3骨橋蛋白(OPN)檢測(cè) 合成cDNA后對(duì)PCR進(jìn)行擴(kuò)增，通過2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后通過EB得出顯色結(jié)果。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 利用SPSS24.0進(jìn)行單因素方差分析，多組內(nèi)采用LSD-t兩兩比較，Pearson分析相關(guān)性。

2 結(jié) 果

2.1miR-21轉(zhuǎn)染對(duì)TGF-β1及TGF-βR2的影響 如表1所示，與空白對(duì)照組相比， miR-21過表達(dá)組中TGF-β1與TGF-βR2 mRNA的表達(dá)均顯著上升(P<0.05)，而miR-21敲低組中TGF-β1與TGF-βR2 mRNA的表達(dá)顯著降低(P<0.05)。miR-21與TGF-β1、TGF-βR2均呈正相關(guān)(r=0.568，P<0.05；r=0.627，P<0.05)。

2.2過表達(dá)miR-21可能增強(qiáng)TGF-β1及TGF-βR2蛋白的表達(dá) 如圖1、表2所示，與對(duì)照組相比，miR-21過表達(dá)組TGF-β1與TGF-βR2蛋白的表達(dá)明顯上升(P<0.05)，miR-21敲低組TGF-β1及TGF-βR2蛋白的表達(dá)顯著降低(P<0.05)。

表1 miR-21轉(zhuǎn)染后miR-21、TGF-β1及TGF-βR2 mRNA的表達(dá)

圖1 TGF-β1及TGF-βR2蛋白的表達(dá)情況

表2 miR-21轉(zhuǎn)染后 TGF-β1、TGF-βR2的蛋白水平

2.3成骨細(xì)胞的鑒定結(jié)果

2.3.1鈣沉積檢測(cè) 如圖2所示，miR-21過表達(dá)組轉(zhuǎn)染21 d后染色通過顯微鏡觀察可見染液與鈣鹽結(jié)合后成的橘色物質(zhì)，已形成鈣沉淀。

圖2 成骨細(xì)胞的鈣沉淀(茜素紅S染色，×200)

2.3.2ALP活性檢測(cè)結(jié)果 與空白對(duì)照組及miR-21敲低組相比，miR-21過表達(dá)組15 d、21 d ALP活性增高較明顯(P<0.05)。見表2。提示過表達(dá)miR-21可能能夠促進(jìn)BMSCs向成骨細(xì)胞分化。

2.3.3OPN檢測(cè) 如圖3所示，將所獲取的PCR產(chǎn)物使用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行測(cè)定，可以發(fā)現(xiàn)，其產(chǎn)物擴(kuò)增后約為320 bp。

M：標(biāo)準(zhǔn)marker；1、2：空白對(duì)照組；3、4：過表達(dá)miR-21組；5、6：敲低miR-21組圖3 OPN的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)

2.4成骨細(xì)胞相關(guān)基因及蛋白的表達(dá) 如表3、表4及圖4所示，miR-21過表達(dá)組中Rumx2與Osterix基因及蛋白的表達(dá)較空白對(duì)照組顯著上升(P<0.05)，而miR-21敲低組中成骨細(xì)胞Rumx2與Osterix基因及蛋白的表達(dá)較空白對(duì)照組和miR-21過表達(dá)組顯著降低(P<0.05)。miR-21與成骨細(xì)胞相關(guān)基因Rumx2、Osterix均呈正相關(guān)(r=0.627，P<0.05；r=0.516，P<0.05)。

表3 成骨細(xì)胞相關(guān)基因Rumx2與Osterix mRNA的表達(dá)

表4 miR-21轉(zhuǎn)染后Runx2、Osterix的蛋白水平

圖4 各組Rumx2及Osterix蛋白表達(dá)

3 討 論

對(duì)于骨科疾病的研究從古代時(shí)期便開始，從使用針灸、中醫(yī)手法復(fù)位，到中西醫(yī)結(jié)合治療等〔11〕，而對(duì)于一些類似于骨損傷，骨軟骨缺損，或者一些由惡性腫瘤細(xì)胞引起的異常骨樣來說〔12〕，還是需要利用好現(xiàn)代的生物力學(xué)及微觀發(fā)展思路〔13〕。BMSCs是一種多能干細(xì)胞，能夠分化為多種成熟細(xì)胞，例如成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞等，除此之外，還具有分離、體外擴(kuò)增、免疫等功能，并且在血管的生成及組織修復(fù)方面還具有極其重要的治療潛能〔14,15〕。

近年來有不少針對(duì)成骨細(xì)胞分化的研究，有研究表明miRNA作為一種關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控RNA，在成骨細(xì)胞分化方面承擔(dān)著至關(guān)重要的調(diào)控角色〔16〕，并且已有多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，屬于miRNA超家族的部分成員在BMSCs向成骨細(xì)胞分化的這一進(jìn)程中具有重要的作用，比如Zhang等〔17〕在了解到人脂肪來源的干細(xì)胞可以作為骨再生中的種子細(xì)胞來源后，提出如何改善骨組織工程中脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(hASCs)成骨分化，及各種因子是如何調(diào)節(jié)這一分化的問題，他們通過實(shí)時(shí)PCR對(duì)miR-218的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示在成骨分化的這個(gè)過程中miR-218出現(xiàn)了表達(dá)上調(diào)的情況，并且miR-218能夠直接靶向分泌型卷曲相關(guān)蛋白(SFRP)2和Dickkopf相關(guān)蛋白(DKK)2，它的過表達(dá)可以提高Wnt/β-連環(huán)蛋白信號(hào)傳導(dǎo)的活性，使成骨細(xì)胞更快的分化；楊楠等〔18〕，針對(duì)骨質(zhì)疏松患者特有的骨吸收能力加快、骨形成能力下降這一問題為導(dǎo)向，來探究骨形成能力與骨分化能力的關(guān)系，研究發(fā)現(xiàn)絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松患者成骨能力會(huì)有所減弱，而通過miR-21對(duì)細(xì)胞轉(zhuǎn)染，降低軟脂酰化磷蛋白(Spry1)的表達(dá)可恢復(fù)成骨分化水平。miR-21最早在人腦瘤中發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)今在發(fā)育、干細(xì)胞生物學(xué)等眾多領(lǐng)域均有所涉及，尤其在腫瘤的發(fā)展中應(yīng)用較多〔19〕，對(duì)細(xì)胞的增殖凋亡能夠起到調(diào)控作用。TGF-β是一種具有多種功能的生長因子，能夠影響不同種類型的細(xì)胞，具有調(diào)控細(xì)胞生長分化、遷移、凋亡等效用〔20〕，其家族成員包括TGF-β、activin、骨形態(tài)發(fā)育蛋白(BMP)等，其各自介導(dǎo)的信號(hào)通路具有不同的作用〔21〕。

本文結(jié)果提示過表達(dá)miR-21可以使其靶基因TGF-β1、TGF-βR2的表達(dá)上調(diào)。過表達(dá)miR-21可能促進(jìn)BMSCs分化為成骨細(xì)胞。

綜上所述，miR-21能夠促進(jìn)BMSCs分化為成骨細(xì)胞，其機(jī)制可能是通過上調(diào)TGF-β/activin信號(hào)通路中TGF-β1、TGF-βR2的表達(dá)來促進(jìn)其分化。