TP63對非小細胞肺癌細胞吉非替尼耐藥性及DSC3/DSG3基因表達的影響

楊穎 成薇婷 何肇晴 汪銳 李婧

(武漢市第一醫(yī)院腫瘤科一病區(qū)，湖北 武漢 430022)

非小細胞肺癌(NSCLC)占肺癌的80%～85%，由于其惡性程度高，預后差，5年生存率約15%，其中肺腺癌為最主要的病理類型。吉非替尼為表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑(EGFR-TKIs)，常用于NSCLC患者的治療，可提高患者生存率，然而多數(shù)患者在治療一段時間(9.2～14.7個月)后會產生耐藥性〔1,2〕。因此，探究NSCLC的耐藥機制，有助于提高癌細胞對吉非替尼的敏感性，對改善患者預后具有重要意義。腫瘤蛋白(TP)63是p53的同源基因，可參與調控干細胞的分化、組織的生長發(fā)育及腫瘤的發(fā)生等，在表皮發(fā)育與衰老中起重要作用〔3〕。有研究表明，TP63不僅參與腫瘤細胞的增殖、分化，TP63的異常表達也與腫瘤細胞的耐藥性有關〔4〕。但TP63是否參與NSCLC對吉非替尼耐藥性尚不清楚。橋粒芯膠蛋白(DSC)3是參與細胞間橋連接的鈣結合膜糖蛋白，可介導細胞黏附作用，在NSCLC等多種腫瘤中均有表達〔5〕。橋粒芯糖蛋白(DSG)3屬于黏附分子中的鈣黏素超家族的成員，在NSCLC中表達水平升高，在肺鱗癌中陽性表達高于肺腺癌，可作為區(qū)分肺鱗癌與肺腺癌的標志物〔6〕。本研究探索TP63對人NSCLC細胞(PC9)吉非替尼耐藥及DSC3/DSG3表達的影響，以期為臨床探索克服NSCLC對吉非替尼耐藥性的有效方法提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1主要材料與儀器 人NSCLC吉非替尼敏感細胞株PC9、吉非替尼耐藥株PC9/GR購于中國科學院細胞庫；吉非替尼購于美國Selleckchem公司；TP63干擾RNA序列購于蘇州吉瑪基因公司；TP63、DSG3、DSC3 及內參甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)引物序列由上海生工生物工程有限公司設計合成；PCR試劑盒、反轉錄試劑盒購自日本Takara公司；Lipofectamine 2000試劑盒購自美國Invitrogen公司；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、二喹啉甲酸(BCA)試劑盒購自杭州四季青生物科技公司；CCK-8試劑盒、膜聯(lián)蛋白(Annexin)V/碘化丙啶(PI)細胞凋亡試劑盒購于北京索萊寶科技有限公司；兔抗人TP63、DSG3、DSC3、β-actin單克隆抗體購自美國Abcam公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng)與轉染 將PC9與PC9/GR細胞接種于DMEM培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，待細胞融合至80%左右時，進行后續(xù)試驗。取耐藥細胞 PC9/GR消化接種于24孔板中，調整細胞濃度為5×106個/ml，每孔接種200 μl，實驗分為對照組、TP63-siRNA組和NC-siRNA，對照組不做轉染，其余兩組分別轉染TP63干擾RNA(TP63-siRNA)和陰性對照(NC-siRNA)，按照Lipofectamine 2000試劑盒說明書將TP63-siRNA和NC-siRNA轉染PC9/GR細胞，轉染48 h后，進行陽性克隆篩選。

1.2.2TP63-siRNA轉染后 PC9/GR細胞對吉非替尼的半數(shù)抑制濃度 收集對照組、TP63-siRNA和NC-siRNA組對數(shù)生長期PC9/GR細胞，調整細胞濃度為5×106/ml，按照每孔200 μl接種至96孔板中，分別加入吉非替尼使其終濃度為0.0、0.5、1.0、2.5、5.0、10.0、20.0、40.0 μmol/L，同時設置二甲基亞砜(DMSO)對照孔，培養(yǎng)48 h后，每孔加入CCK-8液，孵育30 min后，測定450 nm處吸光度值，計算各組細胞的半數(shù)抑制濃度(IC50)。

1.2.3實時熒光定量PCR(qRT-PCR)實驗檢測TP63、DSG3、DSC3 mRNA表達 采用qRT-PCR檢測PC9與各組細胞中TP63、DSG3、DSC3相對表達量，使用RNA提取試劑盒提取各組細胞總RNA，使用反轉錄試劑盒反轉錄合成cDNA后，進行PCR擴增。以GAPDH為內參，采用2-△△Ct法分別計算各RNA相對表達量。引物序列：TP63上游引物5′-3′：GGACCAGCAGATTCAGAACGG；下游5′-3′：AGG ACA CGTCGAAACTGTGCDSG3上游引物5′-3′：GGAGGAACAGACTAACAGGC；下游5′-3′：ACCATCAGGAGGGCCAGAGADSC3上游引物5′-3′：GAAAGTAGTAG ACCTGGTACT；下游5′-3′：ACGCCTGTGCTGGGATGCAGAPDH上游引物5′-3′：GGTGAAGGTCGGTGTGAACGGATTTGG；下游5′-3′：TGTGCCGTTGAATTTGCCGTGAGTGG。

1.2.4CCK-8法檢測細胞增殖 取對照組、TP63-siRNA組和NC-siRNA細胞，調整細胞濃度為5×106/ml，按照每孔200 μl接種至96孔板中，分別于24、48、72 h時向每孔加入100 μl濃度為10%的CCK8的反應液，于450 nm酶標儀測定吸光度值，計算細胞存活率。

1.2.5細胞凋亡實驗 取對照組、TP63-siRNA組和NC-siRNA細胞，調整細胞濃度為5×106/ml，按照每孔200 μl接種至96孔板中，培養(yǎng)24 h后，分別加入5 μl Annexin V-異硫氰酸熒光素(FITC)和5 μl PI染液，流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

1.2.6劃痕實驗檢測細胞遷移能力 取對照組、TP63-siRNA組和NC-siRNA組對數(shù)生長期細胞，接種于6孔板中，用無血清的培養(yǎng)基調整細胞密度，使每孔接種約2×105個細胞，培養(yǎng)24后，用200 μl的槍頭在各孔垂直劃痕，培養(yǎng)48 h后，顯微鏡觀察拍照，測量劃痕距離，計算愈合率。愈合率(%)=〔(愈合前劃痕兩側細胞間距離-愈合后劃痕兩側細胞間距離)/愈合前劃痕兩側細胞間距離〕×100%

1.2.7Transwell 小室檢測細胞侵襲 將融化的基質膠鋪于24孔Transwell板上室中，待基質膠凝固，取對照組、TP63-siRNA組和NC-siRNA組對數(shù)生長期細胞，用無血清培養(yǎng)液調整細胞密度，每孔接種3×105個細胞，下室加入10%胎牛血清(FBS)的完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h后，用4%多聚甲醛固定20 min，0.5%結晶紫染色10 min，顯微鏡觀察拍照，并計算穿模細胞數(shù)。

1.2.8Western印跡檢測TP63、DSG3、DSC3蛋白表達 取PC9與各組細胞接種于6孔板中，培養(yǎng)48 h后，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌細胞，加入裂解液提取總蛋白，經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白后轉膜，使用10%脫脂奶粉封閉2 h，加入兔抗人TP63、DSG3、DSC3單克隆抗體和β-actin，37℃孵育2 h后，TBST洗滌3次，再加入相應的二抗，室溫孵育1 h，使用電化學發(fā)光(ECL)試劑顯色，以β-actin為內參，分析各條帶灰度值。

1.3統(tǒng)計學方法 采用SPSS22.0軟件進行單因素方差分析、SNK-q檢驗。

2 結 果

2.1PC9細胞和PC9/GR細胞中TP63的表達 與PC9細胞相比，耐藥細胞PC9/GR中TP63 mRNA及蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)，見圖1，表1。

圖1 Western印跡檢測TP63蛋白表達

表1 PC9、 PC9/GR細胞TP63表達

2.2干擾TP63的表達對PC9/GR細胞IC50值的影響 與對照組和NC-siRNA組相比，TP63-siRNA組 PC9/GR細胞IC50值顯著降低(P<0.05)。見表2。

2.3干擾TP63的表達對PC9/GR細胞增殖與凋亡的影響 與對照組和NC-siRNA組比較，TP63-siRNA組PC9/GR細胞48、72 h增殖顯著下降，凋亡率顯著升高(P<0.05)；說明干擾TP63的表達顯著抑制PC9/GR細胞增殖，促進細胞凋亡。見表2、表3、圖2。

2.4干擾TP63的表達對PC9/GR細胞遷移、侵襲的影響 與對照組和NC-siRNA組比較，TP63-siRNA組 PC9/GR細胞遷移、侵襲能力顯著下降(P<0.05)；說明干擾TP63的表達可顯著抑制 PC9/GR細胞遷移、侵襲行為。見表2、圖3、4。

2.5干擾TP63的表達對PC9/GR細胞TP63、DSC3、DSG3 mRNA的影響 與對照組和NC-siRNA組比較，TP63-siRNA組TP63、DSC3、DSG3 mRNA表達顯著降低(P<0.05)，見表2。

表2 各組細胞IC50細胞凋亡率、遷移、侵襲及TP63、DSC3、DSG3 mRNA比較

表3 干擾TP63的表達對PC9/GR細胞增殖影響

圖2 流式細胞儀檢測各組PC9/GR細胞凋亡

圖3 各組PC9/GR細胞遷移(×100)

圖4 各組PC9/GR細胞侵襲(結晶紫染色，×200)

2.6干擾TP63的表達對PC9/GR細胞TP63、DSC3、DSG3蛋白表達的影響 與對照組和NC-siRNA組比較，TP63-siRNA組TP63、DSC3、DSG3 蛋白表達顯著降低(P<0.05)，見圖5、表4。

1～3:對照組、NC-siRNA組、TP63-siRNA組圖5 Western印跡檢測各組TP63、DSC3、DSG3蛋白表達

表4 各組細胞TP63、DSC3、DSG3蛋白表達情況

3 討 論

NSCLC由于潛伏期長，患者確診時多為中晚期，放化療是其主要治療方式，吉非替尼是常用于治療NSCLC的分子靶向藥物，然而EGFR基因突變會導致NSCLC吉非替尼耐藥，歐美有10%～15%肺腺癌患者發(fā)生突變，而在亞洲EGFR突變可高達40%～50%，藥物耐受成為EGFR-TKI治療的瓶頸，也是導致NSCLC化療失敗的主要原因〔7,8〕。

TP63是p53家族成員的核轉錄因子，與p53具有同源性，在食管鱗癌、乳腺癌、宮頸癌等腫瘤中均有表達，發(fā)揮抑癌或促癌作用〔9,10〕。TP63基因可編碼TAp63、ΔNp63等兩大類型蛋白，其中TAp63與p53的功能類似，可與p53的DNA結合位點相結合，誘導細胞凋亡，發(fā)揮抑癌作用；ΔNp63可競爭性結合TAp63的結合位點，降低p53的轉錄活性，進一步抑制細胞凋亡而促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展〔11,12〕。鄭雪等〔13〕研究表明，宮頸癌中TP63 基因啟動子 DNA 甲基化抑制其表達，且與腫瘤大小、病理分級、臨床分期相關。研究表明〔14〕，TP63在NSCLC表達水平升高，且肺鱗癌中TP63蛋白陽性表達率顯著高于肺腺癌。本研究結果提示TP63與PC9細胞耐藥有關，推測TP63可能在PC9/GR中發(fā)揮ΔNp63的促癌特性。Patel等〔4〕研究表明，在絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)抑制劑耐藥的黑色素瘤細胞中TP63表達上調，通過用鼠雙微基因(MDM)2抑制劑Nutlin-3A的治療可降低TP63表達，促進細胞凋亡、克服耐藥性。本研究結果表明干擾TP63表達，可增加PC9/GR細胞對吉非替尼的敏感性，TP63可能是PC9細胞吉非替尼耐藥的標志物，然而其具體作用機制尚不清楚。

DSC3和DSG3都屬于鈣黏蛋白基因超家族，主要在細胞膜表面發(fā)揮作用，與細胞黏附、表皮細胞的定位有關。研究表明〔15〕，DSC3在前列腺癌組織與細胞系中中低表達或甲基化，且與患者預后不良有關。另外，DSC3的表達受P53途徑的調節(jié)，其甲基化與結腸癌患者預后有關〔16〕。Dong等〔17〕研究表明，DSG3在NSCLC中高表達，且肺鱗癌患者DSG3相對表達水平高于肺腺癌患者，其高表達與肺鱗癌患者不良預后有關。另有研究表明〔18〕，直腸腺癌中DSG3表達水平升高，且與患者預后有關。本研究結果提示干擾TP63表達，可下調細胞DSC3、DSG3表達。DSG3可通過DSG3-plakoglobin-TCF/LEF 通路促進頭頸癌細胞的生長與侵襲，沉默DSG3表達可抑制細胞生長，使細胞停留在G0/G1期〔19〕，表明下調DSG3表達可抑制癌細胞增殖，因此，本研究推測，干擾TP63表達水平可顯著降低PC9/GR細胞增殖、遷移、侵襲行為可能與下調DSC3和DSG3表達有關。

綜上，TP63在PC9/GR細胞中高表達，干擾TP63表達可抑制 PC9/GR 細胞增殖、遷移與侵襲行為，促進細胞凋亡，逆轉PC9/GR對吉非替尼的耐藥性，可能與下調DSC3/DSG3表達有關。然而，其具體作用機制仍需要做進一步研究來驗證。