雄激素對乳腺癌細(xì)胞增殖的影響

陳月 徐丹

(1北華大學(xué)，吉林 吉林 132011；2北華大學(xué)附屬醫(yī)院)

乳腺癌是全球女性癌癥死亡的主要原因〔1〕。在全球161個(gè)國家中，乳腺癌居女性癌癥發(fā)病率和死亡率的首位，同樣居于我國女性惡性腫瘤發(fā)病率首位〔2〕。乳腺癌是一種高度異質(zhì)性的雌激素依賴性惡性腫瘤，發(fā)病率逐年增高，據(jù)中國腫瘤登記中心發(fā)布的數(shù)據(jù)顯示，中國女性每年新發(fā)乳腺癌約24.9萬例，位居城市女性惡性腫瘤的首位〔3〕。性激素在乳腺癌的發(fā)生和發(fā)展中扮演著重要角色，有研究表明，增加女性接觸卵巢激素的因素同樣也會(huì)增加其患乳腺癌的風(fēng)險(xiǎn)〔4〕。而激素致癌的機(jī)制實(shí)際上就是細(xì)胞增殖的增加，從而增加了基因突變累積的機(jī)會(huì)〔5〕。初潮年齡早、未生育及絕經(jīng)年齡晚都會(huì)增加患乳腺癌的風(fēng)險(xiǎn)〔6〕，此外，激素的替代療法也會(huì)增加患乳腺癌的風(fēng)險(xiǎn)〔7〕，而母乳喂養(yǎng)和生育期則具有保護(hù)作用。盡管流行病學(xué)研究強(qiáng)烈支持雌激素在絕經(jīng)后乳腺癌中的病因?qū)W作用，但雌激素在絕經(jīng)前乳腺癌中的作用尚不清楚〔8〕。

雌激素同樣在乳腺癌的發(fā)生和發(fā)展中也扮演著重要的角色，其中終生接觸雌激素的增加或許是許多乳腺癌發(fā)生發(fā)展危險(xiǎn)因素中最有依據(jù)的解釋。乳腺癌的發(fā)生與內(nèi)源性類固醇有關(guān)〔9〕。乳房是對雌激素敏感的器官〔1〕，雌激素可以促進(jìn)乳腺腫瘤的發(fā)展和生長〔10〕。雌二醇(E2)，是由雌酮(E1)的還原和(或)睪酮(T)的芳構(gòu)化形成的〔11〕。雄激素由卵巢和腎上腺分泌，它們構(gòu)成了女性一生中占主導(dǎo)地位的性類固醇激素，雄激素可以作為雌激素前體，它們還可以通過與大多數(shù)乳腺癌標(biāo)本中存在的雄激素受體結(jié)合來直接作用于乳腺癌細(xì)胞〔12〕。雄激素種類較多，如T、雙氫睪酮(DHT)及脫氫表雄酮等，具有生物活性的主要為T和DHT〔13〕。研究表明，T通過其兩種活性代謝物之間的平衡相互作用控制乳腺上皮生長：E2促進(jìn)細(xì)胞增殖，而DHT抑制細(xì)胞增殖〔14〕。雄激素作為調(diào)節(jié)機(jī)體正?；顒?dòng)的重要物質(zhì)，具有多種重要的生物學(xué)功能，其表達(dá)與乳腺癌有著密切的聯(lián)系。雖然雌激素在乳腺癌病因?qū)W中的作用已被證實(shí)，但雄激素在乳腺癌發(fā)展和進(jìn)展中的作用尚不清楚。目前的理論認(rèn)為雄激素可以抑制乳腺癌細(xì)胞的生長，這種作用是通過雄激素受體所介導(dǎo)的〔15〕。目前，國內(nèi)外針對雄激素在不同濃度對乳腺癌細(xì)胞的增殖是抑制還是促進(jìn)、在不同濃度雄激素環(huán)境下是否可以抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖之間的關(guān)系研究鮮有報(bào)道。而許多關(guān)于雄激素對乳腺癌影響的體外研究都是在低濃度雌激素的存在下進(jìn)行的，這使結(jié)果的解釋復(fù)雜化了。本研究中，給予的條件是在嚴(yán)重缺乏雌激素的情況下，雄激素對乳腺癌細(xì)胞增殖的影響。在這樣的條件下檢查雄激素的作用可能更加具有臨床意義。本文對不同濃度下雄激素對乳腺癌細(xì)胞增殖的影響進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞培養(yǎng) MCF-7細(xì)胞購自美國標(biāo)準(zhǔn)生物品收藏中心(ATCC)，在DMEM低糖培養(yǎng)基中添加10%胎牛血清(FBS)培養(yǎng)于37℃、95%空氣和5%CO2培養(yǎng)箱。細(xì)胞培養(yǎng)液在添加到細(xì)胞培養(yǎng)基之前，通過用2%葡聚糖包被的活性炭(Sigma，St.Louis，MO，USA)處理FBS并在4℃過夜，消除血清中的外源性激素。

1.2不同濃度雄激素的制備 選用T及DHT粉末，根據(jù)其分子量，首先溶解于二甲基亞砜(DMSO)中配備1個(gè)高濃度備用，再用無水乙醇稀釋到所需的不同濃度。DHT濃度分別為：0.0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0、2.4 nmol/L。T濃度分別為：0.0、0.4、0.8、1.2、2.0 nmol/L，待需要時(shí)加入培養(yǎng)孔中。

1.3細(xì)胞增殖 通過CyQuant細(xì)胞增殖試劑盒(Molecular Probe，Eugene，OR，USA)測定細(xì)胞增殖。將MCF-7細(xì)胞(3×103)接種到含有100 μl活性炭處理的無激素培養(yǎng)基的96 孔板上，48 h后分別給予0.0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0、2.4 nmol/L濃度的DHT及0.0、0.4、0.8、1.2、2.0 nmol/L濃度T加入培養(yǎng)液中，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，加入0.0 nmol/L DHT及加入0.0 nmol/L T的細(xì)胞被認(rèn)定為無激素組。細(xì)胞培養(yǎng)基每2 d更換一半。第4天，用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌板并在-80℃下冷凍。

通過CyQuant細(xì)胞增殖試劑盒確定細(xì)胞增殖測定培養(yǎng)板在室溫下解凍，在避光條件下在每孔中加入200 μl的 CYQUANT GR染料/細(xì)胞裂解緩沖液添加到每個(gè)孔中，然后輕輕混合，室溫條件下孵育2～5 min。在使用裝有基于Excel的細(xì)胞增殖軟件的 Genios Plus(激發(fā)光480 nm，發(fā)射光520 nm)中讀板。

1.4細(xì)胞活力測定 通過使用噻唑藍(lán)(MTT)測定細(xì)胞活力。將3×103個(gè)細(xì)胞接種在96孔板中并孵育24 h。然后分別加入濃度為0.0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0、2.4 nmol/L DHT及0.0、0.4、0.8、1.2、2.0 nmol/L濃度T一起孵育。處理4 d后，每孔加入10 μl MTT試劑，將細(xì)胞在37℃下孵育2～4 h，直至出現(xiàn)紫色沉淀，然后加入100 μl洗滌試劑。將板在室溫下在黑暗中放置過夜，并使用讀板器在570 nm處記錄吸光度。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS26.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1雄激素對細(xì)胞增殖表達(dá)的影響 DHT 0.0 nmol/L組和T 0.0 nmol/L組為無激素影響對照，加入不同濃度DHT和T均對細(xì)胞增殖有影響。隨著雄激素濃度升高細(xì)胞增殖也隨之變化， DHT 0.8、1.2、1.6、2.0 nmol/L組與DHT 0.0 nmol/L組差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)， DHT 1.6 nmol/L組DNA濃度表達(dá)量最低，抑制作用最明顯。T 2.0 nmol/L組DNA濃度與T 0.0 nmol/L組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示隨著T濃度的升高,T抑制細(xì)胞增殖的作用更加明顯。見表1、表2。

2.2雄激素對細(xì)胞活力表達(dá)的影響 DHT 1.6 nmol/L組細(xì)胞活力較DHT 0.0 nmol/L組顯著下降 (P<0.05)，且吸光度最低。T 0.4、0.8、1.2、2.0 nmol/L組細(xì)胞活力與T 0.0 nmol/L組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，T 2.0 nmol/L組吸光度值最低，表明雄激素發(fā)揮的抑制作用最明顯。見表1、表2。

表1 DHT對細(xì)胞增殖及細(xì)胞活力表達(dá)的影響

表2 T對細(xì)胞增殖及細(xì)胞活力表達(dá)的影響

3 討 論

雄激素是人體內(nèi)必不可少的一種性激素，屬于類固醇激素，是人體內(nèi)生物活性的蛋白質(zhì)，一般是指男性睪丸所產(chǎn)生的激素，而女性體內(nèi)的雄激素則主要是卵巢和腎上腺皮質(zhì)分泌，絕經(jīng)前女性體內(nèi)的五種主要雄激素(根據(jù)血清濃度降序排列)分別是硫酸脫氫表雄酮(DHEAS)、脫氫表雄酮(DHEA)、雄烯二酮、T和DHT〔16〕。DHEAS僅由腎上腺產(chǎn)生〔17〕，而DHEA則是通過硫酸酯酶(30%)將DHEAS外周轉(zhuǎn)化，在腎上腺(50%)、卵巢(20%)和其他地方產(chǎn)生〔18〕雄烯二酮由卵巢和腎上腺等量產(chǎn)生的。大約一半的T來自雄烯二酮的外周轉(zhuǎn)化，剩下的一半由腎上腺和卵巢合成。在絕經(jīng)前婦女中，雌激素來自卵巢和脂肪組織，在黃體期產(chǎn)生的卵巢雌激素相對多于卵泡期〔19，20〕。E2是絕經(jīng)前婦女循環(huán)雌激素的主要類型，主要由卵巢分泌〔21〕。雄激素其主要通過與雄激素受體結(jié)合而發(fā)揮作用，其主要功能是促進(jìn)性器官的生長發(fā)育和第二性征出現(xiàn)，維持正常生殖功能。雄激素在調(diào)節(jié)女性生殖功能中也起著重要的作用，它們對卵巢功能和生育能力具有協(xié)調(diào)作用，對顆粒細(xì)胞和卵母細(xì)胞的刺激有利于卵泡發(fā)育〔22，23〕及在調(diào)節(jié)卵泡成熟的所有階段都是必不可少的〔24〕。其中在乳房和其他組織中芳構(gòu)化成E2和E1，成為雌激素的重要來源〔21，25〕。E1似乎是雌激素絕經(jīng)后循環(huán)的主要形式。在一項(xiàng)對絕經(jīng)后婦女的9項(xiàng)前瞻性研究的匯總分析中，Key等〔26〕報(bào)告了隨著循環(huán)性激素水平(包括E2、硫酸雌酮、雄烯二酮、DHEA和T)的增加，乳腺癌的風(fēng)險(xiǎn)也在增加〔26〕。研究表明，循環(huán)雄激素水平，與乳腺癌風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)，雄激素可直接通過促進(jìn)細(xì)胞生長和增殖，或間接通過其芳構(gòu)化成雌激素發(fā)揮作用。盡管雄激素有擴(kuò)增的原因，但是雄激素在細(xì)胞增殖中也起著至關(guān)重要的作用〔27〕。對絕經(jīng)后婦女的臨床研究表明，乳腺癌的發(fā)病率與循環(huán)雄激素水平〔28～31〕及與E2和T水平升高呈正相關(guān)〔29，32〕。

本研究結(jié)果表明，不同濃度的雄激素對MCF-7乳腺癌細(xì)胞株的增殖作用有所不同，當(dāng)DHT濃度為1.6 nmol/L時(shí)及T濃度為2.0 nmol/L時(shí)可明顯抑制MCF-7乳腺癌細(xì)胞株的增殖。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，雄激素T和DHT在沒有雌激素的情況下仍然可以誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞生長，并且乳腺癌細(xì)胞也能表現(xiàn)出較高的增殖現(xiàn)象。事實(shí)上，雄激素對乳腺細(xì)胞并非僅具有單一的抗增殖作用，可能是由于這幾種機(jī)制導(dǎo)致雄激素對乳腺細(xì)胞增殖的影響，其中包括雄激素轉(zhuǎn)化為DHT(5α-還原酶途徑)，DHT的下游代謝產(chǎn)物為5α-3β二醇是由3β-羥類固醇脫氫酶(HSD)作用產(chǎn)生的〔33〕，3β二醇在乳腺癌細(xì)胞中具有雌激素作用，它能激活雌激素受體(ER)α誘導(dǎo)生長和ER信號所導(dǎo)致，或E2(芳香酶途徑)、腎上腺雄激素(包括T和雄烯二酮)通過芳香化酶(CYP19)外周轉(zhuǎn)化產(chǎn)生從而雌激素，或者是它們與雄激素受體(AR)和(或)ER結(jié)合，雄激素信號使用5α-還原酶途徑，能夠控制由AR介導(dǎo)的細(xì)胞增殖〔34〕。研究表明，缺乏雌激素的乳腺癌細(xì)胞上調(diào)了激素生成酶，并將雄激素代謝為雌激素樣類固醇，而雌激素樣類固醇的產(chǎn)生代表了對芳香化酶抑制劑的一種潛在的耐藥性機(jī)制〔33〕。Omoto等〔35〕研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)敲除雌性小鼠氧固醇7α羥化酶( CYP7B1，負(fù)責(zé)消除 3β二醇)時(shí)，小鼠乳腺和其他生殖組織表現(xiàn)出增殖升高及青春期早發(fā)和卵巢早衰，這更加印證了3β二醇在乳房和生殖組織中確實(shí)具有雌激素作用〔35〕。因此，可知雄激素信號在乳房穩(wěn)態(tài)中起著至關(guān)重要的作用，它不僅可以抵消乳房中雌激素信號的增殖作用，而且當(dāng)雄激素轉(zhuǎn)化為雌激素(芳香酶途徑)時(shí)，也會(huì)增加細(xì)胞增殖和乳腺癌發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)〔34〕。

綜上，人體內(nèi)雌雄激素代謝是一個(gè)復(fù)雜的通路，需要各種激素相互協(xié)同、拮抗起作用，雖然本研究可以看出雄激素在特定濃度下能夠抑制乳腺癌細(xì)胞增殖，但仍無法明確將雄激素尤其是DHT確定為抑制乳腺癌細(xì)胞增殖的作用。